马蓝色氨酸合成酶基因的克隆、序列及表达分析

通过对马蓝转录组数据分析,从马蓝叶片cDNA中克隆得到了色氨酸合成酶基因完整的编码序列(CDS),长度为807 bp,命名为BcTSA(GenBank登录号:MG857654),可编码269个氨基酸,并对其蛋白质理化性质、结构域、跨膜区、信号肽、磷酸化位点、糖基化位点、编码蛋白的二、三级结构、亚细胞定位进行了分析。蛋白序列多重比对结果显示与其他植物的TSA蛋白序列具有一定的同源性,并通过qRT-PCR法检测BcTSA基因在不同器官的表达与外源激素茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)诱导表达情况。推测其编码的蛋白为亲水蛋白,相对分子质量为28.9 kD,理论等电点(pI)为5.65,无跨膜区;亚细胞定位分析结果显示,BcTSA定位在叶绿体中的可能性大,没有信号肽;有18个磷酸化位点,存在6个潜在的糖基化位点,二级结构主要由α-螺旋构成;BcTSA氨基酸序列与其它15种物种氨基酸序列的保守区域达到81.35%的相似性;BcTSA基因在马蓝不同组织中均有表达,在叶中的表达量最高,根中最低;另外,发现BcTSA基因响应外源诱导子对代谢的调控。BcTSA基因的克隆与序列分析,有助于研究BcTSA基因的功能,对提高马蓝有效成分的含量具有重要意义。     

猪LPL基因部分序列的克隆及多态性分析

脂蛋白脂酶是一种多功能蛋白,其主要作用是催化乳糜微粒和极低密度脂肪酸的甘油三酯水解.是影响脂肪沉积的关键酶之一.对猪LPL基因部分序列进行克隆测序,并利用PCR-SSCP方法对其进行分子扫描,寻找多态位点,分析不同基因型在不同猪种间的分布规律.χ2独立性检验表明,野猪、民猪、大白猪、长白猪、杜洛克之间不同基因型的分布差异极其显著(P＜0.01).     

猪LXRα基因的克隆、序列分析及表达研究

采用RT-PCR结合克隆测序的方法,从猪的肝脏组织中克隆出了猪基因的LXRα(Liver X Receptors α)cDNA序列,编码区长度1344bp,编码447个氨基酸,基于Pfam数据库发现存在一个锌指蛋白和核受体的配体结合区;系统发育分析发现猪的LXRα所在的哺乳动物类群非常保守,与鸡和斑马鱼所构成的类群存在较大遗传距离;在大白猪和杂种野猪的脂肪组织中检测表明LXRα基因的表达自3月龄至12月龄逐渐增加,并在9月龄达到最高,而杂种野猪在9月龄开始高表达,12月龄最高.研究结果表明LXRα基因可能是猪脂质代谢的重要分子标识之一.     

猪LXRα基因的克隆、序列分析及表达研究

采用 RT-PCR 结合克隆测序的方法,从猪的肝脏组织中克隆出了猪基因的 Liver X Receptors α cDNA 序列,编码区长度1344bp,编码447个氨基酸,基于Pfam数据库发现存在一个锌指蛋白和核受体的配体结合区;系统发育分析发现猪的LXRα所在的哺乳动物类群非常保守,与鸡和斑马鱼所构成的类群存在较大遗传距离;在大白猪和杂种野猪的脂肪组织中检测表明LXRα基因的表达随着月龄的增加也不断增加,并日趋稳定,而杂种野猪在9月龄开始高表达,12月龄最高。     

猪DDX21基因的克隆、序列分析及原核表达

DEAD-box解旋酶21(DEx D-box helicase 21,DDX21)是含DEAD-box的RNA解旋酶家族成员之一,不仅参与RNA的合成和加工过程,同时还参与机体的天然免疫应答,调控病毒的复制。为了研究猪DDX21基因的结构和功能,以猪肾传代细胞(PK-15)总cDNA为模板,根据GenBank公布的预测序列(XM_005657387.2)设计引物扩增猪源DDX21基因,并采用分子生物学软件将其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果显示,首次成功克隆了猪DDX21基因的cDNA序列(GenBank登录号为KX396051),其开放读码框全长为2 355 bp,编码784个氨基酸;与牛、斑马鱼、人、小鼠、大鼠和非洲爪蟾的氨基酸序列同源性分别为91.7%,57.5%,88.0%,82.3%,83.8%和48.9%;该基因编码的蛋白结构域和人、牛、小鼠、大鼠一样,其C端都具有保守的GUCT结构域;系统进化树分析表明猪DDX21与牛DDX21的亲缘关系最近。进一步构建原核表达质粒p ET28a-DDX21,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),对DDX21基因进行原核表达。经SDS-PAGE分析显示重组菌可表达分子量约为90 k Da的融合蛋白,与预期相符;在IPTG诱导浓度一定的条件下,重组菌的最佳诱导时间为5 h。猪DDX21基因的克隆和原核表达,为进一步研究DDX21蛋白的结构和生物学功能奠定了基础。     

牦牛ANXA5基因的克隆、序列分析及表达研究

为了深入地讨论牦牛ANXA5基因序列的特点,阐述其组织及细胞表达特性,通过采集牦牛不同组织样品,如心、肝、脾、肺、肾、子宫、卵巢、输卵管等,提取总RNA。采用PCR、生物信息学软件、实时荧光定量PCR、免疫组化等技术对牦牛ANXA5基因进行克隆、序列分析及表达特性研究。结果显示,牦牛ANXA5基因CDS区长为966 bp,共编码321个氨基酸。与黄牛比较,发现共有6个碱基突变存在于牦牛ANXA5基因中。黄牛与牦牛的核苷酸和氨基酸同源性大于99%,与其他哺乳动物进行氨基酸同源性比较,结果也均在90%以上,说明ANXA5基因在长期进化中保守。在牦牛的肺组织中,ANXA5基因表达量最高,与其他组织差异极显著(P<0.01);在子宫和输卵管组织中表达量次之。ANXA5在牦牛不同时期卵巢颗粒细胞中均有表达,且表达量随时间增长而逐渐升高。结果显示,培养72 h颗粒细胞中ANXA5表达量极显著高于培养24,36 h颗粒细胞(P<0.01);培养48 h颗粒细胞中ANXA5表达量极显著高于培养24 h颗粒细胞(P<0.01),显著高于培养36 h颗粒细胞(P<0.05),表明A...     

无毒基因在稻瘟病菌株007中的克隆鉴定及表达分析

为了能明确稻瘟病国际标准菌株race 007中包含的无毒基因及其可能的主效无毒基因,本研究设计5个常见的无毒基因特异性引物进行克隆鉴定,并分别检测液体培养条件下和侵染水稻过程中race 007菌株中5个无毒基因的表达情况。本研究发现,稻瘟病菌株race 007中含有PWL2、AvrPiz-t、Avr-pik、Avr-pita、ACE1 5个无毒基因,克隆鉴定的结果表明这5个无毒基因的变异不大。相比较于液体培养条件下,在侵染水稻的过程中,PWL2表达上调,ACE1、AvrPiz-t、Avr-Pik表达基本不变,而Avr-Pita基因表达出现了下调。因此PWL2基因表达变化较为显著,本研究进一步对PWL2启动子区域进行分析,结果表明该PWL2基因启动子区域存在着一些顺式作用元件来影响PWL2基因的表达。本研究表明,稻瘟病菌race 007含有5种常见的无毒基因且序列变异不大,而且PWL2基因的表达是受到调控并可能发挥主要的致病作用。     

芽孢杆菌蛋白酶基因apr的克隆、 表达及序列分析

【研究目的】克隆从新疆吐鲁番地区土样分离获得产蛋白酶菌株Bacillus tequilensis C9蛋白酶基因apr,建立蛋白酶基因异源表达体系。【方法】采用PCR技术克隆获得目的基因,利用生物信息学软件进行序列分析,构建pET-28a原核表达重组质粒,转化BL21大肠杆菌,37℃下IPTG诱导表达融合蛋白,测定酶活。【结果】蛋白酶基因apr全长1098 bp,与Bacillus subtilis aprE (AB734697)有98%的同源性,编码含有299个氨基酸残基的成熟蛋白,是易溶、亲水性较强的蛋白,属于Peptidases_S8_S53 superfamily蛋白家族,融合蛋白分子量为29 kDa,蛋白酶酶活为28.4 u/mL。【结论】试验为构建蛋白酶基因高效表达体系奠定理论基础。     

巨峰葡萄Rs基因的克隆鉴定、序列分析与时空表达特征研究

探究白藜芦醇合酶(Resveratrol synthase,Rs)在巨峰葡萄果实发育中的潜在作用。对其序列进行结构及功能分析,并鉴定其在果实不同发育时期的时空表达特异性。采用生物信息学分析及qRT-PCR的方法,对巨峰葡萄Rs基因序列进行分析,并对其结构和亚细胞定位进行预测,以及分析果实不同时期不同组织的表达情况。克隆得到的Rs基因cDNA全长1 539 bp,开放阅读框(ORF)为1 179 bp,编码392个氨基酸,预测蛋白分子质量42.88 ku,理论等电点(pI)为6.09,且该基因含有查耳酮和二苯乙烯合酶活性位点以及完整的芪合酶家族特征位点;蛋白互作预测发现,Rs和OMT2.1具有互作,后者可催化白藜芦醇生物合成紫檀芪;亚细胞预测结果表明,Rs基因主要在细胞质和叶绿体中表达;启动子分析发现,Rs基因表达可能受光照、MYB、真菌和激素的调控并存在一定的组织特异性。qRT-PCR表达分析显示,葡萄Rs基因在果皮和果肉中不同时期均有表达,但在花后25 d的青皮中表达量最高。结合Rs基因在白藜芦醇积累的作用,可以推测可能在果实发育前期的果皮中白藜芦醇有较高积累。巨峰葡萄Rs基因在进化过程中具有较高的保守性,其表达可能受环境、真菌和激素的调控且与OMT2.1具有互作效应。而且在不同的组织和时期存在一定的特异性。     

小麦TaWRKY44基因的克隆、表达分析及功能鉴定

WRKY是植物特有的转录因子基因, 在植物对外界胁迫响应及生长发育的过程中发挥重要作用。本研究克隆了一个新的小麦WRKY转录因子基因TaWRKY44, 获得其全长cDNA, 其中开放阅读框长度为897 bp, 编码298个氨基酸。半定量RT-PCR的结果表明, TaWRKY44在叶片中表达水平较高, 并且受干旱和低温胁迫诱导表达。转基因功能分析结果表明, TaWRKY44的拟南芥超表达株系叶片变小, 叶柄缩短, 并且叶片细胞也明显小于野生型。另外, 转基因系对ABA、干旱和盐等胁迫处理的敏感性也高于野生型, 说明该基因可能作为一个转录抑制子参与逆境胁迫信号转导过程。     

辣椒Arf GAP基因的克隆与表达分析

ADP核糖基化因子(Arf) GTP酶激活蛋白(GAPs)能够促使束缚于Arfs的GTP水解为GDP,通过转化具有活性的GTP束缚型为非活性的GDP束缚型从而达到调节Arfs的作用。本研究从辣椒幼苗叶片cDNA文库中筛选获得一个阳性克隆。核苷酸序列分析表明该基因编码一个含有408个氨基酸残基,分子量约为43.98 kD,含有一个保守的Arf GAP结构域,与葡萄、大豆中的AGD8-Like基因的同源性分别为73%和71%,与拟南芥AtAGD8同源性为65%,命名为CaAGD8。实时荧光定量PCR检测表明,与对照相比,CaAGD8基因的相对表达量在辣椒茎、叶、花及果实中表达量升高。     

O型口蹄疫病毒蛋白酶3C基因在哺乳细胞中的表达

为构建O型口蹄疫病毒(FMDV)蛋白酶3C基因的真核表达质粒,并在BHK-21细胞中进行表达,以RT-PCR扩增O型口蹄疫病毒蛋白酶3C基因,利用XhoⅠ和HindⅢ限制性内切酶将3C基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-),通过脂质体法转染重组质粒pcDNA3.1(-)-3C。PCR,双酶切鉴定及测序结果表明：重组质粒pcDNA3.1(-)-3C构建成功;Western-blot分析结果表明：重组质粒pcDNA3.1(-)-3C在BHK-21细胞中能够表达O型FMDV蛋白酶3C基因。该真核表达质粒的构建,为进一步研究O型口蹄疫空衣壳的体外组装以及O型口蹄疫空衣壳疫苗的开发建立了实验基础。     

牛IL-6基因原核表达及其对口蹄疫病亚单位疫苗的佐剂效应研究

为了研究荷斯坦奶牛白介素6(IL-6)基因作为佐剂对VP1蛋白免疫效果的影响,分别克隆IL-6基因和VP1基因,连接到载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-6P-1/BoIL-6、pGEX-6P-1/VP1、pGEX- 6P-1/BoIL-6/VP1。重组质粒在大肠杆菌RS21中高效表达,动物试验检测IL-6作为分子佐剂对豚鼠免疫应答的影响。结果表明：构建的重组质粒在原核系统中正确表达,以包涵体形式存在。表达的融合蛋白三次免疫豚鼠后,检测发现IL-6/VP1组能够诱导产生高水平的体液免疫反应和细胞免疫反应,与疫苗组及VP1+FCS组免疫效果相当。本实验证实IL-6作为分子佐剂能够提高VP1的免疫效果。     

巴西橡胶树HbSIP1基因启动子的克隆和序列分析

为研究橡胶焦磷酸酶基因的表达特征及其在天然橡胶生物合成中调控机理,根据巴西橡胶树焦磷酸酶基因HbSIP1序列,利用GenomeWalker方法对HbSIP1基因启动子序列进行了分离,对其序列进行了生物信息学分析,并构建了含有该序列的植物表达载体pSIP1-1381Z。结果表明：分离获得了1198 bp的HbSIP1基因启动子序列,该序列具有真核生物典型启动子结构特征,并含有众多应答激素和胁迫信号的调控元件。对HbSIP1的启动子区的克隆和分析,为进一步研究HbSIP1的功能和表达调控机制奠定基础。     

小麦wx-B1a基因片段的克隆及其RNAi载体构建

为了获得小麦wx-B1a基因的特异RNAi表达载体,以小麦品种‘京花1号’开花12天的籽粒为材料,用天根公司植物总RNA提取试剂盒提取总RNA,以wx-B1a基因(GenBank NO:AB019623)的cDNA序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR克隆了wx-B1a基因部分cDNA片段.Blastn结果显示,它与GenBank上报道的Triticum aestivum wx-1 gene (GenBank NO:EU719611.1)同源.通过酶切连接将此片段分别置于拟南芥FAD2的Intronl (GenBank NO:AJ271841)的上、下游,然后将此发夹结构置于小麦HMW-GS 1Dx5启动子的下游,从而构建了小麦wx-B1a基因的特异RNAi表达载体pBAC47p-wx-Bl aIR.从而为下一步转化高产强筋小麦品种培育优质面条专用小麦奠定基础.     

单核细胞增生李斯特菌新疆野毒株XS5 SigmaB操纵子的克隆、序列分析及其编码蛋白结构预测

为了解单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes LM.)新疆野毒株XS5 SigmaB操纵子的分子生物学特征。对LM-XS5的SigmaB操纵子部分基因序列进行了克隆与序列分析,预测该操纵子各基因编码蛋白质的二三级结构及功能活性位点,分析其同源性。结果表明：成功扩增出3000 bp的SigmaB操纵子片段,序列分析显示该片段中包含RsbV、RsbW、RsbX和SigmaB 4个基因,它们编码的蛋白质含有不同的功能活性位点,其中RsbV的5~102位AA为“STAS-抗-抗-SigamB因子”,RsbW的43~157位AA间为HATPase_c功能域,RsbX的32~198位AA间为PP2Cc超家族区域,SigmaB的8~264位AA为RNA聚合酶全酶中的SigmaB因子的区域。LM-XS5与其他3种革兰氏阳性菌的SigmaB基因的同源率在50%左右,与LM参考株的同源率在92.18%~100%之间。     

香蕉MaCSase基因的克隆和表达分析

旨在克隆香蕉(Musa acuminata L. AAA group cv. Brazilian)半胱氨酸合成酶(cysteine synthase, CSase)基因,并进行序列特征、器官表达特异性和逆境胁迫下表达特性分析。通过对香蕉根的cDNA文库的测序和分析,获得了一段香蕉半胱氨酸合成酶基因的片段,运用RACE扩增技术获得基因全长,命名为MaCSase,并进行序列分析,最后利用荧光定量PCR技术分析该基因在香蕉不同器官中的表达特异性及在外源胁迫下的表达特性。序列分析显示,该基因全长1367 bp,存在1个完整的开放阅读框1065 bp,编码355个氨基酸。通过和已知植物的半胱氨酸合成酶基因相比,同源性达到79%以上。其中与水稻、苜蓿、葱、玉米的CSase编码的氨基酸序列的同源性分别为86%、85%、84%、84%,器官特异性分析表明,MaCSase在香蕉的根、球茎、叶片、花和果实中均有所表达,其中在球茎中表达量最高。通过对其在高盐胁迫下的表达分析显示,该基因在香蕉根中的表达随着处理时间的增加呈现上升趋势,在胁迫6 h时被大量诱导。     

鸭感染禽坦布苏病毒血清学的检测与分析

为了解中国鸭群感染禽坦布苏病毒流行病学的情况,采用建立的间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA）对于2010年6月—2013年9月三年内采自福建、江西、浙江、广东、广西五省（区）发生产蛋异常鸭场的各品种开产种（蛋）鸭、后备种（蛋）鸭及肉鸭血样共6854份进行禽坦布苏病毒抗体的检测,并对结果进行了分析。结果表明：开产种（蛋）鸭、后备种（蛋）鸭及肉鸭中除肉用番鸭血清中未检出禽坦布苏病毒抗体外,其他品种鸭血清中禽坦布苏病毒抗体阳性率高低不一,揭示存在不同程度的禽坦布苏病毒感染,且感染谱扩大到肉鸭,为以上省（区）乃至中国鸭群需做好禽坦布苏病毒感染的预防提供了科学依据。     

棘孢木霉T4小分子疏水蛋白基因hyb2克隆及序列分析

为了深入研究生物防治菌棘孢木霉T4菌株小分子疏水蛋白hyb2的功能,基于已知小分子疏水蛋白基因hyb2部分cDNA序列设计引物,分别以棘孢木霉T4菌株菌丝体总mRNA和基因组DNA为模板,进行PCR扩增,克隆获得hyb2的全长cDNA和DNA序列,其GenBank接受号分别为JX014433和JX185070,cDNA序列编码区长度为321 bp,编码106个氨基酸。BlastP相似性分析表明该基因与深绿木霉的Tahyd5a (ABS59366)基因同源性最高为87%,SignalP信号肽分析表明N端第16和17个氨基酸中间有一个信号肽剪切位点(AFA||AP)。Pfam蛋白家族分析表明它属于hydrophobin_2 superfamily家族。将棘孢木霉T4菌株小分子疏水蛋白基因hyb2对深绿木霉ATCC74058基因组和绿色木霉Gv29-8基因组进行同源性搜索,在2个近缘种的基因组上分别获得9个和8个同源序列。其中,深绿木霉ATCC74058的hyb-a-7和绿色木霉Gv29-8的hyb-v-5疏水蛋白与棘孢木霉Hyb2相似性最高分别为87%和70%,2个序列分别位于深绿木霉ATCC74058染色体骨架5和绿色木霉Gv29-8染色体骨架22上。     

红花檵木CHS基因的克隆与序列分析

查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)是进入类黄酮和花色素苷次生代谢的第1个关键酶。根据植物查尔酮合成酶保守区序列设计引物,以红花檵木(Loropetalurn chinense var. rubrum)大叶红的嫩叶为材料,用RT-PCR方法,分离得到了一个查尔酮合成酶基因的cDNA（GenBank登录号为JQ609678）,将该基因命名为LcvrCHS1。该序列长927 bp,编码232个氨基酸残基。其核苷酸序列与GenBank已登录的同样来源的核桃、山茶属植物CHS序列同源性达83%,与其他科植物（绣球花、葡萄、桃、马铃薯、甘草、领春木属）CHS序列同源性也达到80%以上;其编码的氨基酸序列与山茶属、葡萄、鳄梨、洋梨、沙梨、映山红CHS基因编码的氨基酸序列同样具有高度同源性,同源性高达98%。