华南虎和东北虎β-干扰素基因的克隆与遗传进化分析

采集新鲜东北虎与华南虎的血液,提取基因组DNA,采用PCR技术扩增β-干扰素(IFN-β)基因,克隆到p MD19-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,进行菌液PCR鉴定,筛选阳性重组克隆。核苷酸序列分析证实,所克隆到的老虎IFN-β基因全长561 bp,编码187个氨基酸,核苷酸序列同源性为99.3%~99.5%。同时将核苷酸序列与其他几种哺乳动物进行遗传进化分析,其同源性在60.8%~98.4%。东北虎和华南虎及其他8种动物的IFN-β基因序列分析和系统进化分析表明,IFN-β基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高;老虎IFN-β基因的成功克隆,为进一步研究猫科动物IFN-β基因表达、生物学活性和应用奠定基础。     

水貂IFN-β基因的克隆与原核表达

从水貂基因组中通过PCR方法克隆得到β干扰素基因(IFN-β),将IFN-β成熟肽插入原核表达栽体pET32a,在E.coli BL21(DE3)工程菌中表达重组蛋白.结果表明,IFN-β片段长561 bp,与已报道的水貂IFN-β基因相比较同源性为100%,IFN-β成熟肽可编码179个氨基酸.重组质粒经ITPG诱导6 h后蛋白表达产物较高,表达量占菌体表达量的50%,分子质量约为34 ku,与预期结果相符.     

猪IFN-α1和IFN-β1基因的克隆与序列分析

从猪的肝细胞中提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增IFN-α1和IFN-1β基因,分别克隆到PMD18-T载体上。测序结果表明,克隆的IFN-α1核苷酸序列与GenBank上登录的猪IFN-α1核苷酸同源性为100%,与鼠、犬、人和牛IFN-α1基因同源性为71.1%~81.4%。克隆的IFN-1β核苷酸序列与Gen-Bank上登录的猪IFN-β1核苷酸同源性为99.6%,推导的氨基酸同源性为99.5%;与人、牛和马IFN-β1基因同源性为76.9%~80.4%。     

水貂IFN-α基因的克隆与原核表达

从水貂基因组中通过PCR的方法克隆得到干扰素α基因(IFN-α),将IFN-β成熟肽插入原核表达载体pET32a,在E.coliBL21(DE3)工程菌中表达重组蛋白。结果表明IFN-β片段长564 bp,与已报道的水貂干扰素-α基因相比同源性98%。IFN-α成熟肽可编码166个氨基酸。重组质粒经ITPG诱导6 h后蛋白表达产物较高,表达量占菌体表达量的50%,分子量约为36 ku,与预期结果相符。     

水貂α-干扰素基因的克隆、测序与遗传进化分析

根据GenBank发表的序列,应用DNAstart分析软件设计并合成一对引物用于扩增水貂α干扰素（IFN-α）基因,从病死水貂的脾脏中提取总RNA,RT-PCR扩增水貂α干扰素基因,获得了约564bp片段,将其克隆到pEasy-T1载体中,进行序列分析,证实该基因是水貂α干扰素基因。将测序结果与GenBank发表的水貂的IFN-α基因序列进行比较,核苷酸序列同源性为94.3%～95.5%,氨基酸序列同源性为89.3%～91.4%。同时将核苷酸序列、氨基酸序列与其他几种犬科动物进行遗传进化分析,其同源性分别在78.1%～99.3%之间和69.4%～100.0%之间。     

牦牛β-干扰素基因的克隆与表达

提取经植物血凝素（PHA）诱导培养的牦牛外周血淋巴细胞总RNA，采用RT-PCR技术扩增并克隆了牦牛IFN-β基因，经PCR和酶切鉴定及测序分析，再克隆到pGEX-4T-1质粒载体中，构建了原核表达重组载体，经IPTG诱导表达重组蛋白，可表达约41 ku的牦牛IFN-β融合蛋白，主要以包涵体形式存在。序列分析结果表明，牦牛IFN-β基因ORF为498bp，与乳牛IFN-β参考序列的同源性高达98．6％，与猪、马、猫、人IFN-β基因的同源性分别为72．5％、68．9％、66．1％和63．5％，而与狗、鼠、鸡等动物的同源性均不超过25％；分子遗传进化树分析也表明，牦牛与乳牛IFN-β基因的亲缘关系最近，而与鼠、狗、鸡等的亲缘关系较远，说明IFN-β基因有种属差异性。     

水貂 β-干扰素基因的克隆、测序与遗传进化分析

根据Genβank发表的序列,应用DNAstart分析软件设计并合成一对引物用于扩增水貂β干扰素（IFN—β）基因,从病死水貂的脾脏中提取总RNA,RT—PCR扩增水貂β干扰素基因,获得了约561bp片段,将其克隆到pEasy—T1载体中,进行序列分析,证实该基因是水貂β干扰素基因。将测序结果与GenBank发表的雪貂（EF581890．1）的IFN—β基因序列进行比较,核苷酸序列同源性为100．0％,氨基酸同源性为100．0％。同时将核苷酸序列、氨基酸序列与其他几种犬科动物进行遗传进化分析,其同源性分别在83．0％～100．0％之间和69．4％～100．0％之间。     

鹅α和γ干扰素基因的克隆及序列分析

从植物血凝素(PHA)刺激的鹅外周血白细胞提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增鹅IFN基因,将其克隆到pMD18-T载体中,进行序列分析.克隆到的鹅IFN-α和IFN-γ基因与GeneBank上已公布的鸭IFN核苷酸序列进行比较,其同源性分别为IFN-α96.70%、IFN-γ94.95%;氨基酸序列同源性分别为IFN-α93.72%、IFN-γ93.29%.这为进一步研究鹅干扰素的生物学特性和应用奠定了基础.     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%～100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

梅花鹿IFN-β1基因的克隆与分子进化分析

根据GenBank中牛干扰素-β1(IFN-β1)基因序列(E00137),设计并合成了1对引物,以梅花鹿肝脏组织DNA为模板,采用PCR技术扩增梅花鹿IFN-β1全基因,并克隆、测序。结果表明:梅花鹿IFN-β1基因全长561 bp,编码186个氨基酸,含有6个与二硫键形成有关的半胱氨酸,3个糖基化位点,成熟蛋白含有4个α螺旋,3个β折叠区,7个β转角。序列比较分析发现,梅花鹿IFN-β1基因序列与GenBank发表的23种IFN-β1基因核苷酸序列同源性为3.2%⁹1.1%,氨基酸序列同源性为21.9%91.1%,氨基酸序列同源性为21.9%⁷9.7%。梅花鹿与其他23种动物的IFN-β1基因序列分析和系统进化树分析表明,IFN-β1基因存在种属特异性。梅花鹿INF-β1基因的成功克隆,为进一步研究梅花鹿INF-β1基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。     

水貂FSH-β基因序列的克隆与测序

从水貂腿部肌肉中分离提取总DNA,经PCR扩增出水貂FSH-β基因DNA序列。PCR产物经凝胶回收纯化,连接到pMD-18T载体上,然后转化到感受态细胞JM109中。在含X-gal和IPTG的LB(Amp+)平板上筛选阳性克隆菌落,提取质粒作限制性酶切及PCR鉴定后,对目的片段进行测序。结果表明, PCR 扩增出的DNA片段碱基数为500 bp,通过Blast比对,分析了其与人、牛、猪、绵羊、鼠促卵泡激素核苷酸序列的同源性。     

水貂黑素皮质素受体-4基因部分序列的克隆测序

对水貂黑素皮质素受体-4(MC4R)基因进行了克隆和序列分析,以期为进一步开展水貂MC4R基因与其肥胖性状的相关分析及基因定位等研究提供理论基础。首先采用特定引物对水貂MC4R基因进行PCR扩增、克隆和测序,然后用DNAMAN软件拼接MC4R基因全序列,并进行序列的同源性分析。试验获得水貂MC4R基因序列816 bp。水貂MC4R基因序列与同一种属的水獭的同源性最高,达96%,而与犬、狐、大熊猫、河马、野猪、山羊、人及小鼠这些哺乳动物的同源性在89%～95%之间,另外,与贝加尔湖海豹和加州海狮的同源性也较高,均为94%。本研究成功克隆了水貂的MC4R基因,结果表明,其在物种间具有较高的保守性。     

鸡α-干扰素基因的克隆与原核表达

根据Genbank中发表鸡α-干扰素基因序列设计一对引物,采用PCR法从SPF鸡的全血白细胞中克隆了α-干扰素基因(ChIFN-α)。序列分析结果显示,与已发表的ChIFN-α的同源性在98.1%以上,与其他禽类的IFN-α同源性在67.4%以上,其中与火鸡IFN-α同源性在89.8%,而与鸭α干扰素同源性仅为67.4%。将该基因连接到原核表达载体pET-28a上,构建重组表达质粒,转入BL21,IPTG诱导后SDS-PAGE分析,可见一条约19ku的清晰蛋白带,结果表明克隆的ChIFN-α基因在原核中获得表达。     

水貂α-干扰素基因的克隆、测序和生物信息学分析

根据GenBank发表的序列,应用Primer5.0分析软件设计并合成1对引物用于扩增水貂α干扰素(α-IFN)基因,从刀豆素A(ConA)刺激的水貂外周血白细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增水貂α干扰素基因,获得了约510 bp片段,将其克隆到pMD18-T载体中,进行序列分析,证实是水貂α干扰素基因(MKIFN)。将测得的序列与GenBank中发表的水貂的α-IFN基因核苷酸比较,同源性为95%,氨基酸序列同源性为96%。这为进一步研究水貂干扰素的生物学特性和应用奠定了基础。     

三元猪β干扰素基因克隆与生物信息学分析

为了提高猪的抗病毒性,试验以三元猪(杜×长×大)为试验动物,提取猪肝脏的DNA,利用特异性引物PCR扩增三元猪β干扰素(IFN-β)基因,将其克隆到pGEM-T Easy质粒载体上,菌液PCR鉴定重组质粒后进行测序鉴定,同时对IFN-β进行了全面的生物信息学分析。结果表明:经PCR扩增获得了IFN-β全基因序列,其长度为682 bp;生物信息学分析显示三元猪IFN-β基因的开放性阅读框编码186个氨基酸残基,前21个为信号肽;三元猪IFN-β蛋白分子质量为21.97 ku,等电点为4.89;三元猪IFN-β与已报道的其他猪的IFN-β氨基酸序列具有较高的相似性;三元猪和马首先聚类,其次是人和猴,与鸡的同源性最低;三元猪IFN-β蛋白具有IFN-αβ的匹配区域,同时含有IFN-αβ受体复合物两个跨膜亚基IFNAR-1和IFNAR-2的结合位点,预测IFN-β蛋白属于IFN-αβ超家族。     

猪链球菌9型cps9G基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪链球菌9型(SS9)基因的核酸序列,设计一对引物,采用PCR方法从确诊为猪链球菌的阳性样品中扩增cps9G基因片段,将其克隆到pMD18-T载体上,转化DH5a感受态细胞,提取重组质粒pMD18T-cps9G,经PCR和酶切鉴定后测序,并与GenBank上SS9相应序列进行同源性分析.结果表明,经PCR扩增,鉴定为SS9的有8株.序列分析发现,8株SS9的cpsgG片段的核苷酸序列较稳定,该基因片段长度均为562 bp,彼此间的核苷酸同源性达96.8%～99.8%,亲缘关系密切;与GenBank上已发表的SS9参考毒株的同源性介于96.0%～98.6%.     

食蟹猴IFN-α基因的克隆及遗传衍化研究

为了提取食蟹猴外周血液中的DNA,利用PCR法扩增IFN-α基因,将扩增的IFN-α目的片段产物克隆到p MD18-T载体上构建重组质粒,经PCR和双酶切鉴定后进行基因序列的测定,对测定的结果用DNAStar软件进行序列分析。结果表明:食蟹猴的IFN-α基因ORF为567 bp,共编码188个氨基酸,前23个为信号肽;成熟蛋白的理论分子质量为22 ku,等电点为8.240,亲水区占多数;该蛋白主要由5段α-螺旋组成,其IFN-α基因与苏门答腊猩猩的同源性最高,在进化树中处于同一分支,为95.8%。     

广西水牛γ干扰素基因的克隆与序列分析

提取经刀豆素(ConA)诱导培养的水牛外周血淋巴细胞的总RNA,采用RT-PCR技术扩增水牛IFN-γ基因,将其克隆到pMD18-T载体上,并进行测序.序列分析结果表明,获得的IFN-γ基因全长为544个碱基,其开放阅读框(ORF)为501个碱基,编码166个氨基酸.与GenBank上已发表的水牛、乳牛的IFN-γ基因进行同源性比较,其核苷酸同源性均高于97%,氨基酸同源性均高于96%;与其他种类动物的IFN-γ的同源性相比,随其亲缘关系的远近有所降低.     

鸡IFN-β启动子荧光素酶报告载体的构建与活性检测

构建并鉴定鸡β干扰素(IFN-β)基因启动子荧光素酶报告基因载体并进行转录活性分析.通过PCR方法从鸡基因组DNA中克隆鸡IFN-β基因启动子,亚克隆到含萤火虫荧光素酶报告基因pGL3-basic载体上,构建鸡IFN-β基因启动子荧光素酶报告基因载体pChIFN-β-luc;用脂质体法将构建的报告基因载体瞬时转染鸡胚成纤维细胞系DF-1,并设置空白对照组和poly(I:C)处理组,检测荧光素酶的活性.经PCR扩增出鸡IFN-β基因启动子序列,双酶切及测序鉴定各重组体构建正确;转染后检测,pChIFN-β-luc具有转录活性,并且在poly(I:C)的刺激下其荧光素酶活性显著升高.本试验为进一步研究鸡IFN-β基因转录调控机制奠定了基础.     

绵羊黏膜趋化因子CCL28基因的克隆、序列分析与原核表达

利用同源序列克隆原理设计1对克隆引物,从绵羊结肠黏膜组织提取mRNA,通过RT-PCR获得CCL28基因,将PCR产物克隆、测序,并进行序列分析;再根据克隆的序列设计1对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出含BamHⅠ/XhoⅠ酶切位点的CCL28片段,双酶切后亚克隆至pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达载体pGEX-CCL28,转化宿主菌E.coliBL21（DE3）,经IPTG诱导进行表达,SDS-PAGE鉴定。克隆的绵羊CCL28基因包含完整的开放阅读框,克隆片段长444 bp,ORF为387 bp,编码129个氨基酸,与人、小鼠、猪、牛该基因的同源性分别为76.4%、61.4%、84.3%和92.9%,推测的氨基酸序列与人、小鼠、猪、牛的同源性分别为76%、63%、84%和93%,表达的融合蛋白分子量约为39 ku,并以包涵体形式存在。为下一步研究绵羊CCL28的生物学功能奠定基础。