阳性脂质体介导的转染法的研究

阳性脂质体介导的转染法是一种新的高效转染技术,以转染效率高,对外源核酸的大小无限制并可在体内和体外进行转染等优点已逐渐成为转染外源核酸进入真核细胞的重要方法.作者结合自己的试验结果及分析就阳性脂质体的组成、脂质体-DNA复合物(Lipoplex)的形成原理、基因转染的机制及影响转染效率的因素等作一综述.     

脂质体介导转染法原理及其研究近展

脂质体是由脂质双分子层组成的囊状栽体,阳离子脂质体介导的基因转染因其转染效率高,操作简单而倍受人们重视,本文就脂质体介导转染法原理及其主要方面的应用进展作一概述。     

鸡胚精原细胞体外转染EGFP方法的比较

以增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）为报告基因体外转染鸡胚胎精原细胞（Chicken embryonic spermatogonial cells,CESCs）,比较磷酸钙、脂质体（梭华-Sofast）、电穿孔3种方法转染EGFP的效率,以获得高效的体外转染方法。本研究分离孵化16d的鸡胚睾丸,获取CESCs,体外培养和传代扩增,传至第2代后进行碱性磷酸酶（AKP）活性和阶段特异性表面抗原-1（Stage specific embryonic antigen-1,SSEA-1）免疫荧光鉴定。运用磷酸钙、脂质体（梭华-Sofast）、电穿孔3种方法体外转染第2代CESCs,荧光细胞计数法分析转染效率。结果表明：与磷酸钙法、脂质体法相比,电穿孔法可获得更高的细胞成活率和转染率（68％ vs 39％、65％,19．70％ vs 2．92％、9．73％）,差异显著（P〈0．05）。因此得出,电穿孔法是将外源基因导入鸡胚精原细胞的适宜方法。     

脂质体介导转染法原理及其研究进展

脂质体也称人工细胞膜,是由脂质双分子层组成的,磷脂分子在水中可自动生成闭合的双层膜,从而形成一种囊状物被称为脂质小体.最初人们只是运用脂质体模拟膜的构造及功能,从而发现了膜的融合及内吞作用.最早证明脂质体能把DNA十分有效地引入动物细胞的实验是从鼠/人杂种细胞系(HGPRT-)中分离出的中期染色体包裹到脂质体中,并用以转染HGPRT-的细胞,结果转化率比裸露染色体高十多倍,而且转化子能稳定地表达HGPRT-的活性.脂质体法具有很多优点,操作简便,转化效率比较高,可以用于瞬时转染,也可以用在永久表达系的建立,对细胞类型的运用面广,对转染的核酸类型和分子量有很高的包容性,细胞毒性小,也可以用于体内的基因转染.因此脂质体转染法得到了越来越广泛的应用.     

脂质体介导转染法原理及其研究近展

脂质体也称人工细胞膜，是由脂质双分子层组成的，磷脂分子在水中可自动生成闭合的双层膜，从而形成一种囊状物被称为脂质小体，最初人们只是运用脂质体模拟膜的构造及其功能，从而发现了膜的融合及内吞作用。最早证明脂质体能把DNA十分有效地引入动物细胞的实验是从鼠／人杂种细胞系(HGPRT^-)中分离出的中期染色体包裹到脂质     

脂质体介导RNA干扰质粒转染鸡成骨细胞条件的优化

本试验的目的是优化转染条件,提高在阳离子脂质体LipofectamineTM 2000介导下鸡TRPV6基因RNA干扰(RNAi)质粒转染入成骨细胞的效率。将携带绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pSIREN-retroQ-shTRPV6在LipofectamineTM2000介导下转染至鸡成骨细胞,对转染前细胞融合度、质粒质量与脂质体体积比及转染时间进行优化,在荧光倒置显微镜下观察并计算转染效率,MTT法检测在不同质粒质量与脂质体体积比条件下成骨细胞的活性。结果表明,在转染前细胞融合达到90%以上,质粒DNA与脂质体比例为1∶2.5时转染效率最高,并且在转染后48 h转染效果最好,对细胞的毒性作用较小。本试验优化了脂质体介导转染鸡成骨细胞的条件,提高了转染效率,为用RNA干扰技术研究鸡TRPV6基因功能奠定了基础。     

脂质体法转染水牛肾脏成纤维细胞条件的优化

试验旨在研究脂质体介导基因转染水牛肾脏成纤维细胞时如何获得较高的转染效率。本研究将以绿色荧光蛋白基因为标记基因,利用Lipofectamine LTX介导外源DNA转染水牛肾脏成纤维细胞,探讨脂质体用量、质粒用量、质粒大小、转染时间、细胞初始接种密度对转染效率的影响。结果表明,4 μg pmaxGFP质粒DNA与4 μL脂质体转染6 h,其细胞活性达98%,可获得较满意的转染效率。     

“睡美人”转座子系统介导EGFP转染鸡SSCs条件优化的研究

利用"睡美人"转座子系统介导增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)报告基因,比较和优化了电穿孔转染条件和精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)对G418的耐受能力.结果表明,在SB与PT-EGFP的比为1:10,质粒浓度为15μg/mL,细胞处于对数生长期,且细胞密度为106~107/mL时,精原干细胞在电场强度为270V,脉冲时程为80μs,转染后在4℃静置10 min的条件下转染效率最高.浓度为400 μg/mL的G418对转染后的SSCs进行快速筛选6d时,出现了EGFP阳性克隆.     

脂质体法转染山羊骨骼肌特异细胞条件的优化

试验旨在通过脂质体转染法检测pIMAU-EGFP载体在山羊骨骼肌细胞中的表达情况,并探索其最佳的转染条件。在构建的适合携带外源基因的山羊骨骼肌特异表达载体pIMAU-EGFP基础上,以绿色荧光蛋白为报告基因,采用脂质体转染法检测了pIMAU-EGFP载体在山羊骨骼肌细胞中的表达,并对转染条件进行了摸索。试验结果表明,成功把测序验证正确的pIMAU-EGFP载体转染到山羊骨骼肌细胞中,筛选的最佳转染条件:脂质体与质粒的最佳比例为1：2,质粒浓度为3.5 μg/μL,细胞密度不低于80%,以转染24~36 h观察记录转染效率为宜。本试验初步建立了转染山羊骨骼肌细胞的方法,绿色荧光蛋白可作为报告基因优化脂质体转染条件,这将为快速和规模化筛选山羊肉质特性相关基因提供新思路和研究方法。     

脂质体转染胚盘细胞将外源质粒pEGFP-C2导入鹌鹑胚的研究

运用脂质体转染第Ⅹ期胚盘细胞的方法将外源质粒pEGFP C2经脂质体包裹后注射到鹌鹑种蛋Ⅹ期胚盘下腔,孵化种蛋.提取孵化6d的鹌鹑胚基因组DNA,进行PCR检测,嵌合体阳性率为84％,证实外源基因在胚胎中的表达.对孵化至出壳的G0代鹌鹑组织进行DNA提取并PCR分析,以及组织切片荧光检测,证实外源基因在G0代鹌鹑组织中成功表达.结果表明脂质体转染胚盘细胞是一种制备转基因鹌鹑行之有效的方法.     

山羊乳腺上皮细胞基因转染条件的优化

为了优化外源基因转入乳腺上皮细胞的条件,本研究采用组织块培养法,从山羊乳腺组织中分离并获得了纯化的乳腺上皮细胞,通过染色角蛋白和测定生长曲线对其进行了鉴定和检测。然后利用电穿孔法将PEGFPC1载体导入乳腺上皮细胞,分别比较了在不同电压(120、140、160、180、200V)、不同电击时长(5、10、15、20ms)以及2株细胞(GMEC1、GMEC2)的不同代数(第1代、第3代、第5代、第9代)条件下的转染效率,并利用优化条件对山羊乳腺上皮细胞进行人β-防御素3基因转染,经过G418筛选,最终获得单克隆细胞,同时对获得的单克隆阳性细胞进行体外诱导表达,并对诱导产物进行Western blotting鉴定。结果表明,不同遗传背景的细胞对转染效率的影响较小,而第1代培养的细胞转染效率要显著高于传代细胞,乳腺上皮细胞在电压180V、电击时长15ms、电击1次的条件下转染效率最高,优化条件下转染、筛选和扩增后获得稳定表达人β-防御素3蛋白的单克隆乳腺上皮细胞。研究工作为乳蛋白基因表达调控机制的研究及乳腺特异性表达载体的检测提供参考资料。     

猪乳腺细胞分离培养及EGFP基因转化

本研究旨在从猪乳腺组织中分离得到上皮细胞和成纤维细胞,并将EGFP基因导入这些细胞.利用乳腺细胞堵养体系从成年猪乳腺组织中分离培养上皮细胞和成纤维细胞,并利用脂质体介导转染技术将EGFP基因导入这些细胞.结果,从成年猪乳腺组织中成功分离培养出上皮细胞和成纤维细胞,获得转EGFP基因上皮细胞和成纤维细胞.上皮细胞呈短梭形或多角形,细胞之间紧密相靠,互相衔接,连接成片;细胞核呈圆形或椭圆形,核仁2～4枚,比较明显.成纤维细胞呈长梭形.结果表明,可以从猪乳腺组织中分离上皮细胞和成纤维细胞,EGFP可以在这些细胞中表达.     

鸡X期胚盘细胞电转染外源基因条件的探索

以EGFP为报告基因体外电穿孔转染鸡X期胚盘细胞,探讨适宜电转染条件以及影响鸡ES细胞存活率和转染率因素。分离鸡X期胚盘细胞进行培养、传代及鉴定,二代细胞设定不同的电压、脉冲时间、质粒浓度、细胞密度及孵育温度等条件转染。电击后10 min,0.4%台盼蓝染色,血细胞计数板计数,计算存活率。48 h后在荧光显微镜下计绿色荧光细胞数和总细胞数,计算转染率。结果表明:电转染鸡ES细胞的最优化电压为280 v,脉冲时间为75μs,质粒浓度为20μg/mL,转染前4℃、转染后25℃(室温)或4℃各静置10 min,细胞密度调整在1×105个/mL×106个/mL,尽量使细胞处于对数生长期。电穿孔法转染鸡ES细胞是简便有效的方法,利用优化条件转染ES细胞,可以满足进一步实验的要求。     

Arkadia表达载体转染肾小管上皮细胞条件的优化

本试验旨在优化泛素化酶Arkadia质粒表达载体pGPU6/GFP/Neo转染小鼠肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs)的条件,为研究Arkadia表达载体在小鼠马兜铃酸肾病(aristolochic acid nephrohathy,AAN)中的作用奠定基础。以小鼠RTECs为转染对象、脂质体Lipofectamine^TM 2000为转染介质,采用Real-time PCR和CCK-8法检测不同的质粒与脂质体比例条件下Arkadia mRNA的表达差异及对细胞活性的影响;同时,用Real-time PCR检测不同的转染时间条件下表达载体对Arkadia mRNA沉默效果的差异。结果显示,Arkadia-pGPU6/GFP/Neo载体的转染效率表现出了一定的剂量和时间依赖性。当质粒DNA∶Lipofectamine^TM 2000为0.66 μg∶2 μL、转染时间为24 h时,对Arkadia mRNA表达的抑制最明显并且对细胞的毒性最小。最终确定了Arkadia-pGPU6/GFP/Neo载体转染小鼠RTECs的最佳条件。     

溶葡萄球菌素基因乳腺特异表达载体的构建与检测及转基因核供体细胞的制备

本研究旨在构建溶葡萄球菌素基因牛乳腺特异表达载体(pEPB),转染牛胎儿成纤维细胞,为制备溶葡萄球菌素基因的转基因克隆牛提供核供体细胞.本研究以pEGFP-C1为载体骨架,通过PCR扩增牛2.6 kb的β-酪蛋白5′调控区及0.6 kb的3′侧翼区(poly A)序列作为调控序列,制备成含有绿色荧光和新霉素筛选标记的牛乳腺特异表达载体,经PCR和酶切鉴定正确后,用转染试剂FuGene HD反复转染牛pEPB乳腺上皮细胞3～5次,用催乳素诱导后,经免疫荧光分析,检测目的蛋白的表达.然后,用电转染法转染牛胎儿成纤维细胞,经G418筛选得到阳性细胞后,把阳性细胞扩大培养并提取其基因组,因为溶葡萄球菌素基因是外源基因,经PCR及Southern blot 检测来确定目的基因是否已经整合到细胞的基因组上.结果表明,溶葡萄球菌素基因在牛乳腺细胞中得到了表达,并整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组中,得到了转溶葡萄球菌索基因的核供体细胞.结果显示,本研究所获得的转基因牛胎儿成纤维细胞可作为体细胞核移植的供体细胞进行转基因克隆牛研究.     

3种转染试剂对牛原代骨骼肌卫星细胞转染条件的优化

为了选择适合牛原代骨骼肌卫星细胞的转染试剂与条件,本研究以带有绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pcDNA3.1-EGFP和pEGFP-C1作为外源基因,分别用Lipofectamine 3000、X-tremeGENE HP和FuGENE HD转染牛原代骨骼肌卫星细胞,通过荧光显微镜观察、实时荧光定量PCR及Hoechst 33342染色评价转染效率。结果表明,对于同一时期、同一转染试剂,pcDNA3.1-EGFP转染效果优于pEGFP-C1;不同转染试剂之间,Lipofectamine 3000和X-tremeGENE HP转染效果优于FuGENE HD。Lipofectamine 3000转染后分化72h肌管最明显,FuGENE HD次之,X-tremeGENE HP转染后细胞死亡较多。采用1.0μL Lipofectamine 3000、1.5μL Lipofectamine 3000和X-tremeGENE HP转染细胞后EGFP表达量极显著高于FuGENE HD (P<0.01),但这三者之间差异不显著(P>0.05)。细胞转染效率与EGFP定量结果基本一致,1.0、1.5μL Lipofectamine 3000转染效率较高,分别达26.07%和24.77%,极显著高于FuGENE HD(5.59%)和X-tremeGENE HP(10.87%)的转染效率(P<0.01),但二者之间无显著差异(P>0.05);X-tremeGENE HP的转染效率极显著高于FuGENE HD (P<0.01)。综合考虑转染试剂的用量、细胞毒性及经济效益,本试验初步认为牛原代骨骼肌卫星细胞转染宜采用Lipofectamine 3000,其与质粒DNA的比例为1∶1时转染效率最高。本试验结果可为原代细胞的转染提供重要的参考价值。