解淀粉芽孢杆菌HZ-1510壳聚糖酶基因的克隆、重组表达及其活性

为了研究壳聚糖酶的水解活性,实验进行了解淀粉芽孢杆菌HZ-1510壳聚糖酶基因编码序列的克隆,并构建了谷胱甘肽转移酶(GST)-壳聚糖酶融合蛋白表达质粒,在大肠杆菌中表达后提取、纯化得到重组蛋白,并通过生物信息学对该蛋白的信号肽、三维结构等进行了分析,最后以胶态壳聚糖溶液为底物研究了该重组壳聚糖酶的活性。结果显示,该壳聚糖酶基因的ORF长为837 bp,编码279个氨基酸,分子量为31.45 ku。在其氨基末端具有信号肽,切割点位于36和37位氨基酸之间。氨基酸序列同源性分析表明该壳聚糖酶属于GH46家族糖苷水解酶。酶的水解活性最适温度约为55°C,最适pH为5.5。而金属离子Fe3+、Ag+、Cu~(2+)、Ba~(2+)和K+对其水解活性都起抑制作用,但是Mn~(2+)、Ca~(2+)和Mg~(2+)对其活性起增强作用。0.1 mmol/L的Zn~(2+)对壳聚糖酶的活性起增强作用,2.0 mmol/L的Zn~(2+)对壳聚糖酶的活性起抑制作用。本实验研究了解淀粉芽孢杆菌HZ-1510壳聚糖酶在不同条件下的水解活性,为壳聚糖酶的工业应用奠定了理论基础。     

分子伴侣对壳聚糖酶OUC-Csn21c在枯草芽孢杆菌中表达的影响

壳聚糖酶广泛应用于甲壳类副产物的高值化应用,可酶解壳聚糖制备具有多种生理活性的壳寡糖。目前多通过基因工程手段对壳聚糖酶进行高效异源表达,本文选择枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800作为表达宿主,并通过表达分子伴侣PrsA和CsaA提高其胞外分泌量。结果发现,只有分子伴侣CsaA可使壳聚糖酶OUC-Csn21c胞外酶活提高21.83%,达到4.76 U/mL。进一步通过SDS-PAGE蛋白电泳对其提高胞外表达量的原因进行探究,发现分子伴侣CsaA可通过提高壳聚糖酶OUC-Csn21c的胞外分泌量来提高其胞外表达量。本研究可为壳聚糖酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达提供参考。[中国渔业质量与标准,2020,10(4):57-64]     

地衣芽孢杆菌几丁质酶在枯草芽孢杆菌中的重组表达及其制备氨基寡糖的研究

将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)来源的几丁质酶基因blchiA在枯草芽孢杆菌(B. subtilis)中进行重组表达,构建了枯草芽孢杆菌工程菌株(B.subtilisWS9/pHY300PLK-blchiA),发酵上清液的酶活为0.73 U·mL^-1。对重组酶BLCHIA的酶学性质进行表征,其在pH 6.0和60℃时表现出最佳活性,比活为3.68 U·mg^-1。10 mmol·L^-1的铜离子(Cu²⁺)和亚铁离子(Fe²⁺)对其活性有一定促进作用,在pH 5.0～8.0和50～60℃下稳定性较好。此外,研究表明重组酶对脱乙酰度>95%的壳聚糖的催化能力明显优于胶体几丁质,并且水解胶体几丁质和壳聚糖的产物类型具有明显差异,以胶体几丁质为底物主要生成几丁二糖,以壳聚糖为底物可生成聚合度为2～7的壳寡糖。研究获得的重组酶BLCHIA在壳聚糖降黏和制备不同聚合度的低聚糖方面具有良好的应用前景。     

链状亚历山大藻谷氨酰胺合成酶的分离纯化及酶学特性研究

本文以链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)为实验材料,通过离子交换、分子筛和疏水层析等纯化技术来分离纯化谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS),并对GS的理化特性进行研究。研究结果表明,GS分子量为430 kD,由8个分子量为55.6 kD的亚基组成;按照亚基分子量的大小判断,链状亚历山大藻GS属于GSⅠ类型。GS反应的最适pH和温度分别为8.0和25℃,Mg~(2+)离子参与的GS反应,GS活力表达最高,Cu~(2+)、K+、Zn~(2+)、Ni~(2+)、Ca~(2+)、Ce~(2+)、Mn~(2+)对GS活力均有一定的抑制作用,Fe~(2+)和Fe~(3+)则完全抑制了GS活力。     

三相流化床生物反应器同时产酶同时降解壳聚糖的研究

采用多孔聚酯泡沫块固定里氏木霉大三相流化床固定化反应器中同时产酶同时降解壳聚糖，结果表明，通过控制降解时间可以得到不同平均聚合度的降解物，在28℃，pH4.8，通气量2.5vvm条件下，重复利用菌丝降解2%（w/v)浓度壳聚糖，每批产生的壳聚糖酶活力平均达到150mU.mL^-1以上，壳聚糖平均降解率为72%以上，利用此固定化反应器，在45天内连续进行15批同时产酶降解试验，结果发现壳聚糖酶活和壳聚糖降解率能保持稳定。     

大口黑鲈hepcidin真核表达载体构建及表达的初步研究

将大口黑鲈(Micropterus salmoides)抗菌肽hepcidin cDNA定向插入真核表达载体pPICZαA,通过SacI酶切线性化重组表达质粒pPICZαA-hepcidin,电转化毕赤酵母P.pastoris GS115,PCR扩增筛选,甲醇诱导表达等进行了hepcidin真核表达工程菌株的构建及诱导表达。结果显示:hepcidin cDNA成功插入表达载体pPICZαA,并整合到酵母基因组中;经甲醇诱导,RT-PCR检测显示hepcidin cDNA在酵母细胞中成功转录。     

菲律宾蛤仔酶解产物的抑菌活性

以菲律宾蛤仔为原料,比较其胃蛋白酶、酸性蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解产物的抑菌活性;利用正交实验优化抑菌活性最强的酶解产物的制备工艺,并测定最优酶解条件下酶解产物的相对分子质量分布。结果表明,菲律宾蛤仔胃蛋白酶酶解产物的抑菌活性最强,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和副溶血弧菌均有一定的抑菌活性,其中对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌活性较高,对四联微球菌则未见明显的抑菌活性。胃蛋白酶的最优酶解工艺条件为：酶解时间2h,温度35℃,pH 2.0,加酶量3 000U/g,料水比1∶4;该条件下酶解产物的相对分子质量主要分布在5000以下。     

鲤生长激素酵母工程菌的分泌表达和产物纯化

取本室构建的鲤生长激素毕赤酵母工程菌GS115 (pPICZαA -GH) ,甲醇诱导 ,SDS -PAGE检测 ,证明重组鲤生长激素 (RecombinantCarpGrowthHormone ,rcGH)在酵母中得到分泌表达。重组酵母菌生长曲线显示 ,细胞从培养第 8小时进入对数生长期 ,至 32hOD660 升至峰值 11.5 ,此后OD660 缓慢下降。在以 10 0 %甲醛按 0 .5 %添加量诱导至 72h、pH为 6 .0时 ,rcGH表达量最高。凝胶扫描分析 ,分泌表达的rcGH占上清总蛋白的 36 .4 1% ,表达量为 30 0～ 4 0 0mg/L发酵液。经离子交换层析法纯化表达产物 ,纯度可达 95 %。纯化的rcGH注射奥尼罗非鱼 ,结果表明具有明显的促生长作用     

枯草芽孢杆菌表达柱状黄杆菌lip基因口服疫苗对草鱼免疫保护效果的研究

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种水产益生菌,最近也被用作口服疫苗的投递载体。本研究利用前期筛选到的柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)保护性抗原基因lip,与pBE2R载体连接后,以质粒的方式转入枯草芽孢杆菌WB800中,构建了重组菌株WB800 (pBE2R-lip)。聚丙酰胺电泳和免疫印迹实验表明,枯草芽孢杆菌WB800 (pBE2R-lip)能表达lip蛋白,其分子量约为32 kDa。利用枯草芽孢杆菌WB800 (pBE2R-lip)口服免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)后,通过酶联免疫吸附实验,在受免草鱼血清中检测到特异性抗体效价的上升,在人工感染实验中,受免草鱼的免疫保护率为52.4%。本研究表明,利用枯草芽孢杆菌能有效表达柱状黄杆菌的lip基因,以其作为口服疫苗能引起草鱼的免疫应答并提供免疫保护效果。     

传染性造血器官坏死病病毒参考蛋白的研制

为规避活病毒作参考物质存在的生物安全风险,本研究利用毕赤酵母表达系统表达了传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的糖蛋白来制备参考蛋白,作为IHNV免疫学检测参考物质。本研究选用IHNV糖蛋白基因(IHNV-G)为目的基因,根据Gen Bank中IHNV全基因序列设计特异性引物,以IHNV-uk株病毒核酸为模板,通过RT-PCR获得糖蛋白基因片段,将其克隆至真核表达载体p PICZαA,转入毕赤酵母感受态细胞GS115中,使外源基因与酵母基因融合,通过1%甲醇诱导表达外源蛋白,SDS-PAGE分析显示获得可溶性表达蛋白,分子量大于70 ku。经Western Blot和ELISA分析,该表达产物可以被IHNV多抗特异性识别。0.1531 mg的重组蛋白与0.3125TCID50 IHNV在ELISA实验中反应原性相当,–20°C可稳定保存2个月,说明其在一定程度上可替代病毒作为参考物质。该研究为IHNV ELISA检测试剂盒的开发奠定基础。     

甲壳低聚糖酶法制备工艺的优化

为制备具有较好水溶性和生理活性的甲壳低聚糖,本实验选用纤维素酶对壳聚糖进行降解,以还原糖浓度作为衡量降解效果的指标,通过单因素实验和正交实验优化酶解制备工艺,获得最佳酶解条件为:酶浓度1600U/g、温度55℃、反应时间7h、pH值5.4,在该条件下获得的酶解产物还原糖浓度为2.52mmol/L。得到的酶解液通过超滤分离,获得分子量小于10KDa的甲壳低聚糖,其产率达到69.51%。     

驼海燕内脏中蛋白酶的提取及其酶学性质的研究

以驼海燕为原料,用丙酮沉淀法制备蛋白酶粗酶,并对其酶学性质进行研究。试验结果表明,提取蛋白粗酶的最佳条件为:原酶液与丙酮的体积比为1∶1.6;蛋白酶反应的最适温度为45℃,最适pH值为8.1;pH为7～9时可保持较高的酶活力;蛋白酶的酶活力在20～50℃基本稳定。酶促反应结果表明,Na+、K+、Li+、Mg2+对蛋白酶活力具有促进作用,而Zn2+、Cu2+、Hg2+能抑制蛋白酶的活力,EDTA对蛋白酶活力的影响甚微。酶动力学方程表明,最大反应速度vmax=5.99U/mL,米氏常数Km=0.69g/mL。     

紫菜活性肽复合酶法制备与清除羟自由基作用

以条斑紫菜为原料,利用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶水解紫菜蛋白制备生物活性肽并研究清除羟自由基作用。采用单因素试验考察胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的比例、底物质量浓度、酶用量、水解温度、水解时间、pH对羟自由基清除率及水解度的影响,响应面法优化酶解条件,SephadexG-15凝胶层析法测定活性肽的分子质量分布。试验结果表明,复合酶最佳酶解工艺条件为胰蛋白酶与木瓜蛋白酶复合酶比例1.67,底物质量浓度20mg/mL,酶用量1.67%,pH 7.0,温度55℃,酶解4h,紫菜活性肽对羟自由基的清除率为80.6%,清除率为50%时的质量浓度为0.744mg/mL,分子质量大多分布于500～1500ku。     

Analysis of the α-amylase gene sequence and the enzyme activity of Indian rock oyster Saccostrea forskali

Indian rock oyster Saccostrea forskali is an important commercial species in Thailand. In this study, its full-length α-amylase (SfAmy) cDNA nucleotide sequence was investigated. The SfAmy cDNA was 1,689 bp long and contained a 1,563-bp open reading frame encoding 520 amino acid residues, including a 17-amino acid signal peptide. The molecular mass and the estimated isoelectric point (pI) of the deduced mature S. forskali α-amylase (SfAMY) were 55.948 kDa and 6.45, respectively. The deduced protein sequence showed 45–88 % identity to other mollusk AMYs. The molecular weight was confirmed by the weight of the purified native enzyme. The specific activities of crude and purified native enzymes toward 1 % starch were 29.53 and 187.42 U/mg. In addition, the obtained recombinant SfAMY also showed activity in digesting 1 % starch. The specific activities of the crude and purified recombinant proteins were 11.8 and 46 U/mg. Both enzymes showed optimal activity temperature at 40 °C but their optimum pH values were different, 6.0 for the native and 5.0 for the recombinant. The expression of SfAmy examined by RT-PCR showed the highest levels in the digestive gland but none was observed in the adductor muscle.     

Cellulase degradation of shrimp chitosan for the preparation of a water-soluble hydrolysate with immunoactivity

ABSTRACT:   Samples of colloidal chitin and chitosans with deacetylation degrees (DD) of 50, 65, 75 and 95% (DD50, DD65, DD75 and DD95, respectively) were prepared from shrimp chitin. The hydrolytic activity of cellulase on these samples increased with the increasing DD of chitosan, with DD95 being the most easily hydrolyzed. Colloidal chitin was hardly hydrolyzed. The optimal reaction temperature and pH for cellulase digestion of chitosan were 55°C and pH 5.2, respectively. During cellulase digestion of chitosan, the 9-h hydrolysate had the highest enhancing effect on the proliferation of a human hybridoma cell, HB4C5. This hydrolysate is composed of low-molecular-weight chitosan (LMWC), with a molecular mass of 20.0 kDa, and chitooligosaccharides, which are composed of sugars with a degree of polymerization of 1–6. In vitro , the 9-h hydrolysate increased both cell proliferation and immunoglobulin (Ig)M secretion of HB4C5 because of the presence of chitooligosaccharides for the former activity and LMWC for the latter activity. In vivo , samples of the chitosan hydrolysate, chitooligosaccharide mixture and LMWC significantly increased the levels of serum IgG and IgM, and enhanced concanavalin A- and lipopolysaccharide-induced proliferation of mouse lymphocytes.     

基于酶技术生产低黏度及超低黏度褐藻胶的工艺

为解决当前低黏度及超低黏度褐藻胶生产工艺中存在的不足,本实验以海带为原料,利用褐藻胶裂解酶降解制备低黏度及超低黏度褐藻胶,研究了分子量、p H、温度对黏度的影响,确定了碱消化的最佳条件,探究了酶解工艺中加酶量、酶解时间及原料的初始黏度对褐藻胶产品的影响。结果显示,通过控制加酶量(100~500 U/g),酶解30 min即可得到低黏度及超低黏度褐藻胶,其中加酶量为100~330 U/g时可得到低黏度褐藻胶,加酶量增加至330~500 U/g时,可得到超低黏度褐藻胶,且酶解法得到的褐藻胶样品分子量均一度高,工艺节水率高达10%~50%;同时研究发现酶解样品黏度与原料初始黏度相关性不大,只在较短时间内表现出相关性,该工艺具有较高的原料适用性。     

急性病毒性坏死病毒dUTPase基因的克隆、表达及其产物的酶学活性分析

根据已测定完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)基因组序列,设计特异性引物,以提取的发病扇贝组织总DNA为模板,PCR扩增得到编码AVNV dUTPase的开放阅读框ORF074,将产物克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建表达质粒pET32a-dut。然后,将其转化至E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE检测显示,诱导表达蛋白分子量约为46 ku,与预期表达蛋白大小一致。经Western-blotting及质谱分析鉴定,所表达蛋白即为重组dUTPase。表达产物经Co²⁺柱纯化后进行酶学活性测定。结果显示,重组dUTPase能特异性催化dUTP,EDTA可以抑制dUTPase的活性,而Mg²⁺可以增强其活性。     

鲣鳔蛋白抗氧化酶解物制备工艺

为有效提高鲣鳔蛋白的附加值,研究以DPPH自由基清除率为抗氧化活性评价指标,采用蛋白酶酶解制备活性多肽的工艺,选用菠萝蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶7种酶在各自最适的条件下酶解,筛选出复合蛋白酶为最适用酶,通过单因素实验分别研究加酶量、溶液初始p H、酶解温度和时间对酶解物抗氧化活性的影响,在此基础上,根据响应面法优化鲣鳔抗氧化酶解物的制备工艺。结果显示,最佳酶解工艺条件为加酶量8.53 U/mg,p H 5.54,温度50.03°C,时间5.07 h。此外,利用超滤法对最佳条件下制备的酶解物进行初步分级,得到分子质量分别为大于10 000 u、3000~10 000 u和小于3000 u的3段组分,且这3段组分对DPPH自由基的半抑制浓度IC50值分别为0.64、0.52和0.37 mg/m L。研究表明,最优条件下制备的酶解物的DPPH清除率达72.00%,与模型预测值71.60%接近,且其中小于3000 u的组分具有较强的DPPH自由基清除活性。     

金乌贼肌肉中三甲胺脱甲基酶的分离纯化及酶学性质

为了提取纯化金乌贼肌肉中的三甲胺脱甲基酶(TMAOase),本研究采用含有0.1 mol/L NaCl、pH 7.0、浓度为20 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)-醋酸缓冲液提取粗酶液,经透析、浓缩处理后,通过DEAE-52阴离子交换柱层析和Sephacryl S-300柱层析得到了纯化的TMAOase,并对其酶学性质进行了研究。结果显示,经Sephacryl S-300柱层析的TMAOase相比粗酶纯化了209.54倍;粗酶和纯化酶的最适温度分别为55和50°C,当温度高于最适温度时,酶活性开始出现显著下降,粗酶在80°C仍残留21.9%的活性;而纯化酶在80°C时,几乎检测不到酶活;粗酶和纯化酶的最适p H均为7.0,中性条件下表现稳定,在酸性和碱性条件下稳定性下降,p H为9.0时,粗酶残留60.7%的活性,而纯化酶的活性仅为20.5%。以双倒数作图法(Lineweaver-Burk法)测得纯化的TMAOase的Km值为22.8 mmol/L;经SDS-PAGE电泳分析,测得其分子量为21.3 ku;在化学物质中,柠檬酸和CaCl_2对酶活性具有显著的促进作用,H_2O_2和Na_2S对TMAOase活性有显著抑制作用。