牙鲆雌核发育近交系、杂交系的遗传分析与生长比较

建立牙鲆(Paralichthys olivaceus)雌核发育近交系和杂交系, 以两性生殖家系作为对照组, 对3个群体的遗传特征和生长进行比较。结果表明, 雌核发育近交系、杂交系和对照组的等位基因数分别为41、55、78, 平均等位基因数为1.7、2.3、3.3, 平均观测杂合度为0.419 2、0.654 9、0.916 7, 雌核发育杂交系的上述参数明显高于近交系, 但低于对照组。3个群体的平均纯合度分别为0.580 7、0.345 1、0.083 3, 个体之间的遗传相似度分别为0.831 2、0.826 1、0.672 7, 杂交系小于近交系, 但明显高于对照组(P<0.05)。在生长方面, 雌核发育杂交系比近交系和对照组生长快, 差异极显著(P<0.01)。从结果可以看出, 雌核发育杂交系具有比近交系高的杂合度, 但具有与近交系相似的遗传相似度; 生长上比近交系明显快, 表现出明显的杂交优势。结论认为雌核发育家系杂交方法可以作为一种育种手段, 用于发挥杂交优势和提高遗传相似度。

     

雌核发育牙鲆与普通牙鲆的肌肉营养成分比较

测定了牙鲆Paralichthys olivaceus幼鱼肌肉的水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分,分析了肌肉氨基酸和脂肪酸组成及含量,对普通牙鲆和雌核发育牙鲆肌肉的营养成分进行了比较。牙鲆肌肉中粗蛋白含量均较高,达到21.3%,鲜味氨基酸——谷氨酸在所有氨基酸中含量最高,占到总量的2.9%,且不饱和脂肪酸具有较高水平。测定结果表明,普通牙鲆雌、雄个体间肌肉营养组成和含量无显著性差异(P0.05),雌核发育牙鲆与普通牙鲆雌、雄间亦无显著差异(P0.05);雌核发育牙鲆与普通牙鲆肌肉相比,其营养组成无明显差别,同样具有营养丰富、组成均衡等优点,雌核发育对鱼类营养成分并无不良影响。     

牙鲆选育家系生长性状的因子分析

记录了2009年建立的12个牙鲆家系240日龄个体的体质量、全长、体长、头长、躯干长、吻长、尾柄长、尾长、体高,和尾柄高等10个生长性状,对这12个家系的生长性状进行了因子分析。结果表明：第一至第四公因子对变异的方差贡献率分别为81．36％、10．12％、5．3％,和1．31％,累积贡献率达98．1％,表明这4个公因子很好地反映了所控制的10个生长性状及其相互作用关系。贡献率最高的第一公因子包含了大多数生长性状,其因子得分排序在前两位的家系为F11和F4,与这2个家系生长性状表型值排序相一致,表明这两个家系具有结构较好的生长构成性状和较高的性状表型值,可作为培育快速生长型牙鲆新品种的候选家系,进行生产验证和推广养殖。     

牙鲆连续四代减数分裂雌核发育家系的遗传特征分析

为了研究纯合度和遗传相似度在牙鲆(Paralichthys olivaceus)连续四代减数分裂雌核发育家系中的变化规律,本研究利用分布在不同连锁群上的24个高重组率微卫星标记对牙鲆连续减数分裂雌核发育二代(G2)、三代(G3)、四代(G4)家系及普通家系对照组进行了遗传分析。结果显示,24个微卫星位点在对照组、G2、G3、G4家系中,分别检测到96、42、32和32个等位基因,平均等位基因数分别为4.00、1.98、1.33和1.33;期望杂合度分别为0.6416、0.3472、0.1694和0.1492;纯合度分别为0.3503、0.6528、0.8306和0.8508;遗传相似系数分别为0.5822、0.9238、0.9890和0.9988。24个位点中已有17个纯合,但尚有7个保持杂合状态。同时,将上述结果和已发表的减数分裂雌核发育一代(G1)家系的数据进行分析,结果表明,诱导连续减数分裂雌核发育不仅能提高个体的纯合度,同时也可提高子代个体间的遗传相似度;纯合度和遗传相似度在G1、G2和G3家系中能够得到逐步提高,代际之间差异显著(P<0.05);但在G4家系中趋于稳定,与G3家系差异不显著。G4家系的遗传相似性(0.9988)已高于连续20代全同胞交配所获得的理论值(0.9860),连续诱导减数分裂雌核发育是快速建立鱼类近交系的良好方法。     

不同模型估计牙鲆家系间生长性状遗传参数的比较分析

利用中国水产科学研究院北戴河中心实验站2006~2009年间牙鲆选育家系240日龄生长性状的测定记录,对4种不同动物模型估计的生长性状遗传参数进行了比较分析。不同模型分别包括了加性遗传效应、母体遗传效应和全同胞效应。利用MTDFREML程序采用非求导约束极大似然法(DFREML)估计各模型中的方差组分。用似然比检验对不同模型的差异进行检验。结果显示,对于牙鲆240日龄体重、体长和体高,母体遗传效应和全同胞效应都有显著的影响,应用模型Ⅳ进行分析,体重、体长和体高的遗传力分别为0.30、0.32和0.39。体重与体长、体高的正向遗传相关分别为0.93和0.95;体长与体高的正向遗传相关为0.90。     

比较3种饲料对牙鲆生长和消化率的影响

选取平均体重为(359±16)g/尾的健康牙鲆48尾,随机分成3组,每组2个重复。采用3种不同饲料进行投喂,比较牙鲆专用配合饲料对牙鲆生长速度、饲料效率及消化率的影响。经过42d的饲养,结果表明:自配饲料(A组)增重速度最快、饲料系数最低,尾相对增重率达到230.1%、饲料系数达到1.59。牙鲆每增重1.0kg所需饲料成本最低,与B组、C组相比分别节省了13.7%和18.9%。A组的干物质消化率为81.56%,比B组、C组分别高5.33%和9.39%。A组的蛋白质消化率为91.17%,比B组、C组分别高3.26%和7.51%。     

牙鲆骨骼生长性状与微卫星标记的相关性分析

利用106对牙鲆微卫星标记,对62尾双单倍体牙鲆的基因组DNA进行检测;用X射线检测仪对其骨骼进行成像,以骨骼图片测量体高和体长;用SPSS 13.0软件对双单倍体牙鲆的体质量、体长、体高进行相关分析和回归分析;用最小二乘法对微卫星标记与体质量、体长、体高作相关性分析。结果获得17个与体质量、体长、体高显著相关的标记,其中,Poli162TUF与体质量、体长、体高显著相关(P0.05);Poli72HFSM、Poli106TUF与体质量、体高显著相关(P0.05);Poli2023TUF、Poli1013TUF与体长、体高显著相关(P0.05);Po-li2042TUF、Poli1980TUF、Poli2045TUF、Poli2039TUF、Poli34TUF、PoGT17、HLJYP45、HLJYP81与体长显著相关(P0.05);Poli102TUF、Poli136TUF、Poli62MHFS、6-G3与体高显著相关(P0.05)。这些标记反映了牙鲆的生长优势性状,可作为辅助育种的参考标记。     

全雌牙鲆和普通牙鲆胚胎发育与鱼苗生长速度的比较

北戴河中心实验站应用异源真鲷精子,通过紫外线照射、冷休克诱导牙鲆雌核发育和高温诱导伪雄鱼,解决了牙鲆性别控制和全雌苗种规模化生产的关键技术问题,实现了牙鲆全雌苗种的规模化生产.全雌鱼苗比普通鱼苗生长速度快是公认的,但其生长速度差异的确切数据目前还没有报道,2008年我们设计了全雌苗种和普通苗种胚胎发育时间和苗种生长增长的测定试验.因条件限制,本试验仅做了胚胎发育和初孵仔鱼长到鱼苗全长5 cm这一阶段的比较试验.     

牙鲆连续三代抗鳗弧菌病家系的筛选与分析

为了培育牙鲆(Paralichthys olivaceus)抗鳗弧菌(Vibrio anguillarum)病的品系或品种, 2009和2012年利用中国牙鲆抗病群体、从日本和韩国引进的牙鲆群体以及2007年和2009年从大量牙鲆家系中选留的优良家系为亲本, 通过巢式杂交、三元杂交及雌核发育等方法, 分别于2009年和2012年建成牙鲆家系43个和65个, 选取2009年的33个家系和2012年的43个家系进行鳗弧菌感染实验, 共筛选出13个抗病家系, 其中3个家系的存活率极显著高于对照组(P<0.01), 另外10个家系的存活率显著高于对照组(P<0.05), 这13个家系包含F3家系、雌核发育一代和二代家系各1个, F2家系3个, 在以上6个家系中,除了1个F2家系, 其他家系的亲本均来自于抗病家系且鳗弧菌感染存活率的变异系数都低于10%。对连续三代抗病家系进行分析, 发现在上述13个抗病家系和2007年筛选出的3个抗病家系共16个抗病家系中有13个家系来自于中国牙鲆抗病群体相关, 结果表明, 部分F1、F2、F3和雌核发育家系较好地遗传了其亲本的抗病性能, 抗病性能稳定, 为培育抗鳗弧菌病的牙鲆品系或品种奠定了基础。

     

牙鲆体质量与形态性状的异速生长分析

为分析牙鲆（Paralichthys olivaceus）体质量与形态性状之间异速生长的遗传规律,通过人工受精的方法建立牙鲆19个全同胞家系,测量了牙鲆不同日龄的体质量和形态性状。采用逐步回归方法建立最优联合异速生长模型,将此模型镶嵌到体质量动物模型的每个遗传和环境效应中,进一步分析对多个形态性状异速生长遗传规律。静态异速生长分析表明：体质量与全长之间存在最大异速生长指数（1.415 5）,表现为正异速生长,剩余形态性状与体质量之间的异速生长指数为0.061 5~0.718 0,皆表现为负异速生长。全长与尾柄高之间异速生长指数的正遗传相关最大（0.907 8）;全长与尾柄长之间的负遗传相关最大（0.946 8）。不同模型通过统计标准比较,确定模型Ⅰ为进行牙鲆动态异速生长分析的最优随机回归模型。     

牙鲆连续两代减数分裂雌核发育家系的遗传特征

对牙鲆(Paralichthys olivaceus)减数分裂雌核发育二倍体(Meio-G1)再次诱导减数分裂雌核发育,获得连续两代雌核发育二倍体家系(Meio-G2),以Meio-G1亲本与1尾普通牙鲆雄鱼人工授精获得的家系作为对照组(control)。利用15个微卫星标记对3个家系进行遗传特征分析。结果显示,15个微卫星位点在Meio-G1、Meio-G2和对照组3个家系中,分别扩增到30、28、50个等位基因,平均等位基因数为2.0、1.9、3.3,平均观测杂合度(Ho)分别为0.875 3、0.774 2、0.908 3,平均纯合度分别为0.124 7、0.221 5、0.091 7。3个家系个体间的平均遗传相似系数分别为0.891 7、0.923 8、0.520 2,亲代与子代之间的平均相似系数分别为0.916 6、0.930 4、0.560 3。高重组率的Poli9-8tuf、Poli18tuf、Poli107tuf 3个位点在Meio-G1和Meio-G2中观测杂合度均为1.0,低重组率的Poli33tuf、Poli24MHFS两个位点在Meio-G1和Meio-G2中均全部纯合,观测杂合度为0。结果表明,Meio-G2的纯合度、个体间平均相似系数以及亲子之间的平均相似度均略高于Meio-G1,显著高于对照组家系,证明连续两代诱导减数分裂雌核发育,能提高鱼类纯合度和遗传相似度,具有固定母本遗传性状的作用。     

牙鲆减数分裂与有丝分裂雌核发育的遗传差异

利用同一尾牙鲆亲鱼的同一批卵子诱导减数分裂雌核发育二倍体和有丝分裂雌核发育二倍体,同时用牙鲆精子做人工授精制备普通二倍体,作为对照组。利用10对微卫星引物对普通二倍体和两种雌核发育二倍体进行遗传分析。结果表明,母本基因型在8个位点为杂合,2个位点为纯合。普通二倍体有6种基因型,等位基因均来自父母本的随机结合,类型丰富;母本与子代、子代个体之间的遗传相似系数分别为0.452 8和0.560 3,接近随机交配群体的遗传相似度。减数分裂雌核发育二倍体有3种基因型,除在1个位点出现异于母本的纯合基因型外,其他所有位点的基因型与母本完全一致;母本与子代、子代个体之间遗传相似系数分别为0.976 6和0.959 5,接近近交系的遗传相似度。有丝分裂雌核发育二倍体有2种基因型,且全部为纯合型;母本与子代、子代个体之间遗传相似系数分别为0.806 2和0.742 5,有丝分裂雌核发育二倍体全部为纯合个体。减数分裂雌核发育二倍体具有高度的遗传相似性,适于固定母本性状;有丝分裂雌核发育二倍体纯合度高,适于作为制备克隆的亲本;两者具有明显不同的遗传特性,均可作为特征不同的育种材料。     

真鲷精子诱导牙鲆减数分裂雌核发育

采用真鲷精子激活牙鲆卵子,经(0±0.5)℃冷休克处理,诱导了牙鲆减数分裂雌核发育。灭活真鲷精子,紫外线照射剂量3.4mJ/cm2时孵化率最低;随着照射剂量的增加,孵化率恢复,照射剂量73mJ/cm2时,孵化率最高,呈现典型的Hertwig效应。用流式细胞仪检测倍性,未经冷休克处理的胚胎全部为单倍体,经冷休克处理的均为二倍体,表明精子灭活有效。冷休克实验结果表明,冷休克起始时间2～5min均有效,以3min为最好;冷休克持续时间30～90min均有效,以45min为最好。综合两项因素,授精3min后,休克时间持续45min组的授精率和孵化率均为最高,与其他处理组差异显著(P<0.05)。RAPD分析结果显示,异源精子的遗传信息未在雌核发育二倍体的电泳图中出现,表明其遗传信息没有传递给子代。     

牙鲆遗传连锁图谱的构建

利用基因组测序得到的大量微卫星序列,以681383B为父本、6812E36为母本杂交获得的F1为作图群体,构建了牙鲆(Paralichthys olivaceus)微卫星标记(SSR)遗传连锁图谱。雌雄图谱共定位SSR标记529个,其中雄性连锁图谱包括418个标记,分布在24个连锁群上,总长度1 418.1 cM,标记平均间隔3.62 cM,图谱覆盖率为88.7%;雌性连锁图谱包括437个标记,分布在24个连锁群上,总长度1 298.1 cM,标记平均间隔为3.16 cM,图谱覆盖率为89.1%。牙鲆中密度遗传图谱的构建为QTL分析以及分子标记辅助育种进一步奠定基础,并可以有效推动牙鲆的遗传改良工作,推动牙鲆养殖业的可持续发展。     

ENU诱变草鱼及其雌核发育后代的微卫星遗传分析

为了获得雌核发育ENU诱变草鱼(Cetpharyngodon idellus)群体的相关遗传参数,实验采用Partec Cy Flow倍性分析仪测定ENU诱变草鱼群体(Q群体)和雌核发育ENU诱变草鱼群体(E群体)相对DNA含量分别为24.02和23.80,二者的DNA含量接近,均为二倍体。选取28个微卫星标记对Q群体和E群体多样性进行了检测。结果表明,E群体和Q群体的平均等位基因分别为3.7143、5.1786,平均有效等位基因分别为2.1857、4.0028,平均期望纯合度分别为0.5122、0.2814,平均期望杂合度分别为0.4878、0.7186,多态信息含量(PIC)平均值分别为0.4282、0.6606。从个体在微卫星位点的纯合率分析,在E群体中,每个个体的纯合度均小于1.00,说明没有完全纯合的个体。从每个微卫星位点在群体的纯合率分析,除了微卫星位点5476,HLJC118和HLJC81外,其他位点的纯合度以不同的速率得到明显的提高。综上所述,经过减数雌核发育方法,ENU诱变草鱼群体的各微卫星位点的纯合度以不同的速率得到提升,遗传多样性明显降低,此方法可以获得纯合度较高的雌核发育ENU诱变草鱼个体,为ENU诱变草鱼良种选育提供了重要的遗传数据资料。     

牙鲆和大菱鲆养殖群体的分子标记和遗传变异

用１６个１０碱基随机引物对养殖牙鲆（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）和大菱鲆（Ａｃｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ ｍａｘｉｍｕｓ）进行基因组随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）遗传分析。发现：（１）多个引物具有种的特异性扩增带。其中引物Ｓ７扩增的６９０和１１６０ｂｐ带,引物Ｓ２扩增的６８０ｂｐ带为牙鲆的种的特异性谱带;而引物Ｓ７扩增的６５３和８８９ｂｐ带,引物Ｓ２扩增的６５０、８７０、９９０及１１     

牙鲆的胚胎发育

在牙鲆胚胎玻璃化冷冻中,为了准确选择胚胎的冷冻时期,掌握胚胎发育进程,同时为牙鲆苗种培育提供一定的依据,对海水工厂化养殖牙鲆的胚胎发育进行了研究。牙鲆受精卵培养在14-16℃、盐度29．9的海水中,利用Olympus显微镜对牙鲆胚胎发育过程连续观察,对各个胚胎时期的发育时间进行了记录,并对每一时期的特征用Olympus照像机进行了拍摄。实验记录了从受精卵到出膜后5d的29个具体发育时期的特征和发育时间,拍摄了30张具有代表性的胚胎和鱼苗图片,将牙鲆胚胎发育划分为卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、肌节期、尾芽期、心跳期、胚体转动期、出膜前期、出膜期10个连续的典型时期。在此培养条件下牙鲆胚胎历时93h完成整个胚胎发育,孵化出膜,再经96h的胚后发育卵黄囊完全吸收,之后进入变态期,向成鱼转化。