中华绒螯蟹Akt基因的cDNA克隆、序列分析及表达特征

为研究Akt基因在中华绒螯蟹蜕壳前后肌肉生长过程中的功能,应用RACE技术克隆得到编码中华绒螯蟹Akt(命名为Es Akt)的全长为2 200 bp的c DNA序列,包括159 bp的5′非翻译区(5′-UTR)、496 bp的3′非翻译区(3′-UTR)和长度为1545 bp编码514个氨基酸的编码序列。蛋白质结构域分析显示Es Akt含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的3个特征性保守结构域。多序列比对和系统发育分析显示,Es Akt与中国明对虾、凡纳滨对虾的Akt序列一致性都为0.889,在系统发育树中节肢动物Akt形成一个分支。应用荧光定量RTPCR技术分析Es Akt在性成熟中华绒螯蟹各组织及幼体不同蜕壳时期不同部位肌肉组织中转录水平上表达量的变化。结果显示,Es Akt在性成熟个体的肝胰腺、眼柄、表皮、卵巢、精巢、心脏、螯足、鳃、三角膜等组织中均有表达,其中卵巢、眼柄和精巢中表达量较高,肝胰腺中表达量最低。在幼体不同蜕壳时期不同部位的肌肉中,Es Akt表达量变化不同,步行足肌肉组织中Es Akt m RNA无显著的统计学差异。腹部肌肉组织中Es Akt m RNA水平在蜕壳前晚期D3~D4期表达量显著高于蜕壳后A~B期和蜕皮间期C期。螯足肌肉在蜕壳前晚期D3~D4期急剧下调,蜕壳后A~B期开始表达量显著升高,直至蜕皮间期C期。研究表明,Es Akt在中华绒螯蟹蜕壳过程中不同部位肌肉组织中的表达量变化与蜕壳周期密切相关,说明Es Akt参与中华绒螯蟹蜕壳诱导的肌肉萎缩、生长及重建过程。     

中华绒螯蟹Smad3(EsSmad3)的cDNA克隆、序列分析及表达特征

为了研究Smad基因在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)蜕壳前后肌肉生长过程中的功能,应用RACE技术克隆得到编码中华绒螯蟹Smad3(命名为Es Smad3)的cDNA全长序列2021 bp,包括36 bp的5′非翻译区(5′-UTR)、656 bp的3′非翻译区(3′-UTR)和编码442个氨基酸的开放阅读框。蛋白质结构域分析显示EsSmad3含有MH1和MH2两个特征性保守结构域。多序列比对显示,EsSmad3与人、斑马鱼、黑腹果蝇中的同源蛋白序列一致性分别为0.679、0.691、0.619。应用荧光定量RT-PCR技术分析EsSmad3在性成熟中华绒螯蟹各组织及幼体不同蜕壳时期不同部位肌肉组织中转录水平上表达量的变化。结果显示,Es Smad3在性成熟个体的肝胰腺、眼柄、表皮、卵巢、精巢、心脏、螯足、鳃、三角膜等组织中均有表达,其中眼柄和精巢中表达量较高,心脏和肝胰腺中表达量最低。在幼体不同蜕壳时期的不同部位的肌肉中,Es Smad3表达量变化不同:步行足肌肉组织中EsSmad3 mRNA表达在蜕壳间期高于蜕壳前D_(3–4)期和蜕壳后A~B期,但无显著的统计学差异(P0.05)。螯足肌肉在蜕壳前晚期D_(3–4)期急剧下调(P0.05),蜕壳后A~B期开始表达量显著升高(P0.05),直至蜕皮间期C期。腹部肌肉组织中EsSmad3m RNA水平在蜕皮间期C期显著高于蜕壳后A~B期,这种上调一直持续到蜕壳前晚前期D_(3–4)。上述结果表明,Es Smad3在中华绒螯蟹蜕壳过程中不同部位肌肉组织中的表达模式与蜕皮周期密切相关,推测Es Smad3参与了中华绒螯蟹蜕壳诱导的肌肉萎缩、生长及重建过程。     

中华绒螯蟹冬季暂养关键技术

正中华绒鳌蟹(Eriocheirsinensis),又称河蟹、毛蟹、清水蟹、大闸蟹,是一种在淡水中生长育肥、在海水中进行生殖繁衍的洄游性甲壳类动物,主要分布在我国东部各海域及通海的河流、湖泊中。其肉质细嫩、味道鲜美,被视为水中珍品,深受广大消费者的青睐,但是河蟹一般在9—10月上市销售,此时的河蟹正值生殖蜕壳的尾期,上市的河蟹中有部分正准备蜕壳,刚刚蜕壳完成的河蟹也正处在软壳阶段,肌肉不充实,蟹黄不饱满,水分较多,商品价值低。如果进行冬季暂养,待其性腺发育成熟、肌肉充实、膏肥黄多时销售,既可以避开秋季河蟹集中上市期,延长上市时间,还可以调节市场供求矛盾,提高河蟹反季销售带来的经济效益。现将中华绒螯蟹冬季暂养关键技术总结如下。     

中华绒螯蟹蜕皮过程中肌肉、肝胰脏和甲壳中钙和磷含量的变动

对中华绒螯蟹蜕皮间期和蜕皮后24h、48h和96h肌肉、肝胰脏及甲壳中钙和磷的含量进行了测定。蜕皮后肌肉中钙的含量较间期低，但从24h到48h有所增加。肝胰脏中钙的含量在蜕皮后各时间内无显著变化，甲壳中钙的含量在蜕皮后24h到96h呈增加趋势。甲壳的矿化作用在蜕皮后96h已接近完成。蜕皮后肌肉中磷的含量较间期高，以后变化不明显。蜕皮后肝胰脏中磷的含量高于间期，甲壳中含量较间期低。蜕皮后肌肉中钙磷比迅速降低，肝胰脏中钙磷比在蜕皮后24h无明显变化，但在蜕皮后24h至96h迅速降低。中华绒螯蟹蜕皮后外表皮对钙的矿化速度显著快于磷的矿化速度。     

中华绒螯蟹蜕皮过程中鳃组织主要成分及N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性变化

为探讨中华绒螯蟹蜕皮过程中的生理生化变化,采用生物化学和原子吸收方法,测定了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)蜕皮过程中鳃组织糖原、蛋白质、无机离子含量及N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性,结果显示:鳃组织糖原含量从蜕皮间期C期至蜕皮前D0期基本稳定,从蜕皮前D1期开始逐渐减低,直至蜕皮后A-B期降至最低。蛋白质含量从蜕皮间期C期至蜕皮前D1期保持稳定,在蜕皮前后(蜕皮前晚期D3-4期和蜕皮后A-B期)含量较高。鳃组织Ca2+含量由蜕皮间期至蜕皮前D3-4期含量降低,而于蜕皮后A-B期恢复到蜕皮间期水平。Mg2+含量在蜕皮过程中无显著变化,而Cu2+和Zn2+含量在蜕皮后A-B期显著高于其他时期。鳃组织N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性在蜕皮前D0和D3-4期显著高于其他时期。结果表明:中华绒螯蟹蜕皮过程鳃组织主要成分和N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性变化和蜕皮周期密切相关。     

不同水温对个体养殖系统中华绒螯蟹幼蟹蜕壳生长和摄食率的影响

为探讨不同水温对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)幼蟹蜕壳、生长和摄食率的影响,本研究应用恒温的河蟹个体养殖系统,分析不同水温(10、15、20、25、30℃)对中华绒螯蟹幼蟹的成活率、蜕壳次数、蜕壳间隔、蜕壳增重率、肥满度和摄食率的影响。结果显示:在133 d的试验中,各饲养水温的中华绒螯蟹成活率均在89%以上;10℃和15℃水温的实验蟹只蜕壳1次,20℃和25℃水温组的实验蟹蜕壳2次,30℃水温组的实验蟹蜕壳3次;五个水温组的平均蜕壳间隔分别为109.39、67.92、46.63、43.69、38.01 d;蜕壳增重率随水温升高呈总体增加的趋势,30℃水温组的蜕壳增重率显著高于其他水温组;平均绝对生长率和相对生长率均随着水温的升高而逐步增大,且各水温组间差异显著;肥满度随水温的升高而逐渐下降;五个水温组的平均日摄食率分别为1.58%、1.97%、3.54%、4.79%和5.25%。腿部肌肉切片观察发现,低水温组(10、15、20℃)的肌纤维直径显著大于高水温组(25、30℃)。结果表明:随着饲养水温的增加,河蟹的蜕壳速度加快,增重率增加,肥满度下降,摄食率增加,以30℃水温时的河蟹生长最佳。     

中华绒螯蟹Y-器官在蜕皮周期中的超微结构

以光镜和电镜观察处于蜕皮周期不同阶段的中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis),结果显示,中华绒螯蟹具Y-器官(YO)1对,卵圆形,直径1 5～2 0mm,苍黄色,位于头胸部鳃腔前端,大颚外侧内收肌腹缘,邻近头胸甲内侧上皮。YO细胞排列成索状,细胞索之间为血窦,YO的细胞索由一种细胞构成,细胞核质比高。YO细胞具有类似脊椎动物合成类固醇激素的典型超微结构特征,蜕皮前期YO细胞的光面内质网、管嵴状线粒体和游离核糖体丰富;蜕皮后期和蜕皮间期的内质网、线粒体和游离核糖体明显减少;青春蜕皮后的YO出现大面积细胞凋亡,YO趋向退化。     

中华绒螯蟹细胞色素CYP2基因的克隆与表达分析

为研究细胞色素CYP2基因在中华绒螯蟹蜕皮及生长发育中的作用,本试验通过逆转录聚合酶链式RT-PCR反应以及cDNA末端快速扩增RACE技术获得了中华绒螯蟹CYP2基因cDNA全长。用实时荧光定量PCR技术,分析该基因在中华绒螯蟹蜕皮过程中各组织的相对表达量。试验结果显示,中华绒螯蟹CYP2的cDNA全长1772bp,编码491个氨基酸序列,包括一个84bp的5′端非编码区,一个212bp的3′端非编码区、一个1475bp的开放阅读框,经BLAST比对,该核苷酸序列与岸蟹、三疣梭子蟹的相似性分别为66%、64%。实时荧光定量PCR结果显示,中华绒螯蟹蜕皮前,CYP2基因在鳃中的表达量相对最高;在肝胰脏、肌肉中表达量略低于鳃;在Y器官、眼柄、胸神经节、脑神经节、肠中少量表达;在心和胃中表达量最低。中华绒螯蟹在不同的蜕皮时期中,通过荧光定量试验得出,肝胰脏中CYP2基因表达量在蜕皮前期和蜕皮期最高;眼柄中CYP2基因表达量从蜕皮期到蜕皮后期有上升趋势;鳃中CYP2基因表达量在蜕皮前期最高;Y器官、脑神经节和肠中CYP2基因表达量在蜕皮期最高;肌肉中CYP2基因表达量在蜕皮前期最高;胸神经节和胃中CYP2基因表达量在蜕皮后期最高;Y器官中CYP2基因在蜕皮前期表达量高于蜕皮后期和蜕皮期。以上试验结果表明,CYP2对中华绒螯蟹蜕皮生长中的调控可能起到重要作用。     

环境条件对中华绒螯蟹大眼幼体蜕壳生长的影响

试验结果表明,黑暗条件下大眼幼体蜕壳数量少、成活率低;光照可刺激并促进大眼幼体的蜕壳与生长,但长时间光照会影响Ⅰ期到Ⅳ期幼蟹的蜕壳生长;泥土和隐蔽物作为栖息环境有利于提高中华绒螯蟹幼体的成活率;苗种质量是提高中华绒螯蟹大眼幼体到Ⅳ期幼蟹成活率的关键。     

中华绒螯蟹肌肉组织特性及其肉质嫩度的比较

摘要：采用肌原纤维小片化指数(MFI)、胶原蛋白（总胶原蛋白、热溶性胶原蛋白、热残留胶原蛋白）和肌纤维直径3种评定方法,分别测定了4地区中华绒螯蟹肌肉的组织特性,并初步探讨了采用综合指数法比较肉质的嫩度。结果表明,中华绒螯蟹肌肉的肌纤维小片化指数为50～90;肌纤维直径为350～560 μm;总胶原蛋白含量为0.1～0.18 g•(100 g)-1;热溶性胶原蛋白含量为0.03～0.12 g•(100 g)-1;热残留胶原蛋白含量为0.04～0.1 g•(100 g)-1。与牛肉相比,中华绒螯蟹肌肉的肌纤维较粗,胶原蛋白含量较低。3种评定方法均可以划分出不同地区河蟹间肌肉嫩度等级,但各指标间的嫩度排序有差异。肌纤维直径的分辨率最高,而胶原蛋白的分辨率最低。采用综合指数法评定肉质嫩度从大到小的顺序为：B> C> A> D（雄）;A> C> B> D（雌）。     

Post-molt processes of cuticle formation and calcification in the Japanese mitten crab <Emphasis Type="Italic">Eriocheir japonicus</Emphasis>

This study examines the following in the Japanese mitten crab: (1) the structure of the exoskeleton with special reference to its calcification; (2) the progression of post-molt cuticle formation and calcification. In the crab, the structure and calcification state of the exoskeleton at the molt and during the inter-molt stage were similar to those of other crustaceans. During the inter-molt, the exoskeleton consisted of four cuticle layers; the outermost epicuticle, the exocuticle, the endocuticle and the innermost membrane layer. Intense calcification was observed in the exo- and endocuticle. At the molt, the synthesis of the epi- and exocuticle was already complete, and the addition of the endocuticle began after the molt. Calcification of the exocuticle initiated soon after the molt, but there was a delay between endocuticle matrix synthesis and calcification. Histology showed that the process of calcification was similar to that in other crustaceans. However, calcium concentrations within the exoskeleton continued to increase and never reached the levels of the inter-molt stage at the end of the experiment. This suggests that the Japanese mitten crab is relatively slow to calcify compared to other crustaceans.     

Morphological and biochemical changes in the muscle of the marine shrimp Litopenaeus vannamei during the molt cycle

Morphological changes and biochemical composition of abdominal muscles over the molt cycle were investigated in juvenile Litopenaeus vannamei. Eight molt stages were characterized and clear uropod images are presented. Molt frequency was highly correlated with the age of the shrimp. Juvenile shrimps appeared to molt faster at one month of age (4.6 ± 0.5 days/cycle), slow to 11.8 ± 1.7 days/cycle at three months of age, and reach a long molt cycle at six months (17.2 ± 2.7 days/cycle). Myofiber cross-sectional images revealed specific morphological changes in abdominal muscle associated with each molt stage. Expanded fiber size was observed during intermolt stages. Water content and total soluble proteins were balanced throughout the molt cycle. Total DNA concentration increased in intermolt and premolt, while total RNA concentration remained stable except in late-premolt stages. SDS-PAGE analysis showed high levels of actin and myosin in postmolt, reaching a plateau in intermolt and declining in premolt. These results suggest the occurrence of muscle fiber rearrangement in both the premolt and postmolt stages. Abdominal muscle buildup occurs mostly during the intermolt stage.     

日本沼虾蜕皮过程中头胸甲外骨骼超微结构的改变

采用HE染色及石蜡切片的扫描电镜观察方法,描述了日本沼虾(Macrobrachium nipponense)蜕皮间期(C期,intermolt stage)及新旧表皮更替变化剧烈的蜕皮前晚期(D4期,late premolt stage)和蜕皮后期(postmolt stage)A-B期头胸甲外骨骼的形态结构变化特点。结果显示,日本沼虾外骨骼分为上表皮、外表皮、内表皮三层,D4期出现新的上表皮和外表皮,B期出现新内表皮,外表皮强嗜碱性而内表皮弱嗜酸性。扫描电镜观察发现,C期头胸甲内、外表皮均为几丁质-蛋白质纤维构成的平行板层结构且板层内有发达的孔道系统(pore canals,pc),但内外表皮板层间排列紧密程度不同,外表皮板层切面边缘较整齐,结构致密,板层内pc大小均一、近似圆形,内表皮板层切面边缘粗糙,结构较疏松,板层内pc大小不等、多为梭形。在蜕皮前后,新外表皮结构变化显著,与C期相比,D4期新外表皮超微结构与旧内表皮结构相似,而在A期,外表皮超微结构由疏松变为致密,这可能与蜕皮后表皮的钙化相关。本研究旨为阐明沼虾的蜕皮机制提供基础资料。     

Influence de la temperature sur la croissance et la mue de Palaemon serratus en fonction de leur taille

The effects of temperature on growth and on the duration of the molt cycle and inter-molt stages of Palaemon serratus were examined in relation to body size under controlled conditions in the laboratory.Over the size range studied, the best temperature for growth is 22° C, but when the temperature differs from this optimum, young shrimps are less affected than old ones. Growth of the smallest shrimps is depressed especially by extremely low temperatures; on the contrary, high temperatures act negatively on the growth of old animals.The duration of the molt cycle is directly and linearly related to shrimp length; increasing temperature shortens it according to a hyperbolic curve, with a greater effect on the largest animals.Neither body size nor temperature affects significantly the relative durations of the molt stages.     

日本沼虾表皮几丁质合成酶基因克隆及表达分析

为了解日本沼虾几丁质合成酶（Chs）基因在蜕皮过程中的作用,本实验采用RACE技术首次从表皮中克隆了几丁质合成酶基因（MnChs）cDNA全长,并用生物软件对其序列进行生物信息学分析,RT - PCR技术检测该基因的时空表达模式。结果表明,其cDNA全长5133 bp,5′UTR为 283 bp,3′UTR为 159 bp,开放阅读框（ORF）长度为4701 bp,编码1566个氨基酸,分子量为179.57 KDa,理论等电点为6.09,包含两个几丁质合成酶的标签序列EDR和QRRRW及Chitin-synth-C结构域。经BLAST比对,与日本仿长额虾、淡水枝角水蚤Chs相似性分别为89 %和63 %。RT - PCR结果显示,在蜕皮周期各阶段,不同组织MnChs的表达量差异显著：头胸甲在A期达到最高,胃肠在D0和D4期均较高,尾扇和肌肉在D4最高,肝胰腺则普遍较低。结果表明,MnChs基因转录物不仅存在于表皮,在其它组织也有分布,且mRNA水平的变化与蜕皮周期有关,作为几丁质生物合成的关键酶,推测该基因的表达在新外表皮和内表皮的形成中发挥重要作用。     

三疣梭子蟹微卫星标记与生长相关性状的相关性分析

选用35个多态性微卫星标记,对三疣梭子蟹人工选育快速生长自交家系F2代(以2008年莱州湾群体雄蟹为父本和海洲湾群体雌蟹为母本交配产生F1代,随机选取F1代后代进行交配产生F2代自交家系)的110个个体进行遗传多样性研究。结果表明:35个位点共检测出87个等位基因,各位点等位基因数为2~4个不等,平均有效等位基因数为2.2个,观测杂合度平均值为0.646 5,期望杂合度平均值0.513 0,多态信息含量平均值0.449 1。经卡方检验,多数位点显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)偏离Hardy-Weinberg平衡。采用SAS 9.1中的一般线性模型(general linear model,GLM)对微卫星标记与生长相关性状(全甲宽、甲宽、甲长、体高、体质量、第Ⅱ侧齿间距、第Ⅰ步足长节长、大螯长节长)进行连锁分析。结果表明,Pot08位点与体质量、全甲宽、甲长、体高、第Ⅱ侧齿间距显著相关(P<0.05),Pot42位点与体质量、甲长、大螯长节长、第Ⅰ步足长节长显著相关(P<0.05),Pot53位点与全甲宽、甲宽、大螯长节长显著相关(P<0.05),与第Ⅱ侧齿间距极显著相关(P<0.01),Pot57位点与第Ⅰ步足长节长显著相关(P<0.05),PTR8a位点与第Ⅰ步足长节长、体高、甲长显著相关(P<0.05),与体质量、第Ⅱ侧齿间距、全甲宽、甲宽极显著相关(P<0.01),PTR30位点与体质量和甲长显著相关(P<0.05),PTR131位点与体质量、全甲宽、甲宽显著相关(P<0.05)。其中,位点PTR8a可作为以体质量为选育目标的首选标记。     

三疣梭子蟹“中宁1号”的形态性状增长规律

以1~6月龄三疣梭子蟹"中宁1号"为材料,采用Logistic、Gompertz和von Bertalanffy3种模型分别拟合了体质量、体长、全甲宽、甲宽、体高、大螯长节长、大螯不动指长及第一步足长节长共8个形态性状的生长特征,旨在寻找各性状的最佳生长模型,并对其增长规律进行研究。结果表明:三疣梭子蟹体质量性状生长过程以Logistic生长模型(R2=0.999)的拟合效果最佳;除体质量外的其它7个性状则均以von Bertalanffy生长模型(R2为0.990~0.994)拟合效果最好;各性状模型经ANOVA检验后均具有统计学意义(P0.01)。根据各性状的最佳生长模型得出各性状的极限值分别为体质量231.44 g、体长84.45 mm、全甲宽164.44 mm、甲宽128.47 mm、体高43.69 mm、大螯长节长59.96 mm、大螯不动指长90.89 mm、第一步足长节长37.20 mm。体质量的快速生长区间及拐点分别为2.14~3.91月龄及3.02月龄;其它7个性状快速生长区间的始速点为0月龄,终速点为2.05~2.35月龄,拐点在1月龄左右。各性状间的生长速率、生长加速率、相对增长率与绝对增长率存在一定差异。总之,体质量性状生长过程符合"慢-快-慢"的特征,其它性状则表现为"快-慢"的特征。以上结果可为三疣梭子蟹"中宁1号"选择育种及养殖生产提供参考依据。