盐蒿提取液抗食源性致病菌活性及其抑菌机理

以5种常见的致病菌为试验对象,采用体外抑菌试验筛选出盐蒿提取液作用效果最好的致病菌,并通过研究盐蒿提取液对致病菌作用前后细菌培养液的OD260、电导率、碱性磷酸酶(AKP)活性和细胞超微结构的变化,初步探讨盐蒿提取液对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的抑菌机制。结果显示,盐蒿提取液对5种致病菌均有抑菌活性,但对单增李斯特菌抑制效果最好,最小抑菌浓度(MIC)为0.062 5 mg/ml,对5种致病菌抑制效果表现为:单增李斯特菌金黄色葡萄球菌大肠杆菌肠炎沙门氏菌鲍氏志贺氏菌。单增李斯特菌经盐蒿提取液处理后,细菌培养液260 nm的吸光度、电导率和AKP活性均增大,表明盐蒿提取液可破坏单增李斯特菌细胞壁和细胞膜的结构,导致细胞通透性增加,进而使细胞内容物外泄,使细胞生长受到抑制,进而导致死亡。     

绿色魏斯氏菌对单增李斯特菌毒力特性的影响

[目的]本文旨在研究绿色魏斯氏菌与单增李斯特菌共存对单增李斯特菌的生长能力、毒力基因表达及细胞黏附能力的影响,揭示乳酸菌与单增李斯特菌之间的交互作用机制。[方法]采用膜隔离装置,取4℃贮藏条件下放置0、12、24、48和96 h的菌悬液分别测定单增李斯特菌和绿色魏斯氏菌的数量,同时提取单增李斯特菌的RNA进行反转录和荧光定量PCR,分析单增李斯特菌6种主要毒力基因(hly A、prf A、bsh、act A、sig B和inl A)的表达情况。利用Caco-2细胞进行绿色魏斯氏菌与单增李斯特菌的竞争、排斥和置换试验,观察单增李斯特菌对Caco-2细胞的黏附效果。[结果]产细菌素绿色魏斯氏菌C1可降低单增李斯特菌的数量,而不产细菌素绿色魏斯氏菌C2对单增李斯特菌的生长影响不大。C1和C2的代谢产物使单增李斯特菌6种毒力基因表达量下调,且C1导致的下调趋势比C2大。C1主要通过置换和竞争作用来抑制单增李斯特菌对Caco-2细胞的黏附,而C2的作用较弱。[结论]产细菌素绿色魏斯氏菌C1比不产细菌素绿色魏斯氏菌C2能够更好地控制单增李斯特菌的生长,抑制相关毒力基因的表达,并主要通过置换和竞争作用来抑制单增李斯特菌对Caco-2细胞的黏附。产细菌素绿色魏斯氏菌C1可作为单增李斯特菌的防控菌株。     

麝香草酚对单增李斯特菌的抑制作用

为开发以麝香草酚为主要成分的新型抑菌剂。采用微量肉汤稀释法测定麝香草酚对单增李斯特菌的最小抑制浓度和最小致死浓度分别为156.25μg/ml和312.50μg/ml。通过扫描电镜观察发现,经过麝香草酚处理后单增李斯特菌细胞出现穿孔式膜损伤。进一步研究结果表明,麝香草酚分别处理1 h、2 h和3 h后,单增李斯特菌胞外的碱性磷酸酶、葡萄糖和核酸含量显著高于对照。SDS-PAGE电泳分析结果显示,麝香草酚处理6 h后单增李斯特菌胞内蛋白含量降低,说明麝香草酚处理使得单增李斯特菌细胞通透性增加,导致细胞内的物质流失到细胞外。碘化丙啶(PI)染色结合倒置荧光显微镜观察结果显示,麝香草酚处理造成了单增李斯特菌细胞膜的破损,并最终导致菌体细胞死亡。     

来源于四种生鲜肉的单增李斯特氏菌的RAPD聚类分析

为了研究保定、石家庄及周边地区生肉来源的单增李斯特菌株彼此之间的亲缘关系,揭示不同来源、不同时间、不同地域的单增李斯特菌流行变化规律,为该病原菌的检测、防治以及溯源提供依据。对从生鲜肉分离出的129株食源性单增李斯特菌进行RAPD扩增,用NYSYS-PCversion 2.1分析软件采用不加权成对算数平均法(UPAMA)进行聚类分析。采用单一引物(RP1)对129株生肉来源的单增李斯特菌进行RAPD聚类分析,得到了129株单增李斯特菌的DNA指纹图谱,绘制出其亲缘关系的聚类树状图。结果表明:129株生肉来源的单增李斯特菌可分成6个基因聚类,其中第Ⅱ类为保定、石家庄地区的主要流行种群;对单增李斯特菌遗传多态性及其随时间、地域及其菌株来源的变化进行分析,表明该地区生肉来源的单增李斯特菌由于取样时间、地点不同,其基因聚类差异明显,相同时间、相同地点的单增李斯特菌株之间亲缘关系较近。本研究表明四种生肉来源的单增李斯特菌具有广泛的遗传多态性;单增李斯特菌的流行具有明显的时间性、地域性。     

基于MALDI-TOF/TOF技术的单增李斯特菌四种血清型的快速鉴别

单增李斯特菌是一种重要的人畜共患病致病菌,其传统血清型鉴定方法具有耗时长、操作繁琐等缺点,现行的多重PCR方法无法精确判定其血清型。基于基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF）的快速、准确、高通量等特点,应用该技术建立了单增李斯特菌4种血清型的鉴别方法,以实现食品样品中单增李斯特菌4种血清型的高通量快速甄别。采用优化的MALDI-TOF/TOF条件对4种血清型的单增李斯特菌标准菌株和分离菌株进行检测,发现单增李斯特菌4种血清型的质谱特征峰。选取最优的支持向量机算法,建立基于1/2a、1/2b、1/2c和4b血清型差异的判别模型,运用该模型鉴别4种血清型的单增李斯特菌。初步建立了单增李斯特菌4种血清型的MALDI-TOF/TOF快速鉴别方法。以4种血清型的单增李斯特菌标准菌株为阳性对照、144株食品分离株为检测对象,运用该方法对单增李斯特菌1/2a、1/2b、1/2c、4b四种血清型鉴定符合率分别达到92.7%、90.3%、100%、100%,多重PCR方法的符合率为71.4%、87.0%、96.2%、95.0%。可见,建立的MALDI-TOF/TOF方法可对4种血清型的单增李斯特菌快速鉴别。与多重PCR方法相比,该方法具有快速、高通量、重现性好等特点,可用于食品中单增李斯特菌血清型的快速鉴定。     

食品中单增李斯特菌检测技术研究进展

单增李斯特菌是一种重要的人畜共患食源性致病菌,如何有效控制食品(尤其是即食食品)中的单增李斯特菌,是食品安全的重要任务,其中快速、准确的检测技术是关键因素之一.作者对单增李斯特菌的传统检测法、免疫学检测法和分子生物学检测法进行综述,并对目前国内单增李斯特菌检测过程中所存在的问题进行探讨,以期为今后的研究提供参考.     

快速检测生鲜肉中三种食源性致病菌

为同时快速检测生鲜肉中鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌和福氏志贺氏菌3种食源性致病菌,降低检测成本,制备了特异性单克隆抗体和多克隆抗体,研制出能够同时检测以上3种致病菌的胶体金免疫层析试纸条。结果表明,本试验成功筛选出3株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株2E3、2E7和2E8,3种单克隆抗体效价均在1.28×10~6以上,3种多克隆抗体效价均在2.00×10~6以上。制备的胶体金免疫层析试纸条对鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌和福氏志贺氏菌3种食源性致病菌的特异性良好,灵敏度均为1×10~4CFU/g。     

超高压对单增李斯特菌生物被膜形成的影响

为探究超高压处理对单增李斯特菌被膜形成能力的影响。以2株4b血清型的单增李斯特菌(Wa X12、ATCC13932)为研究对象进行超高压处理(100~500 MPa,15 min,20℃),通过24孔板结晶紫染色方法对2株菌生物被膜形成能力进行检测,结合荧光显微镜和扫描电镜来观察生物被膜形成情况。Wa X12比ATCC13932形成被膜的能力强。100 MPa压力处理显著增强Wa X12的被膜形成能力(P0.05),200 MPa压力处理使ATCC13932被膜形成量显著增多(P0.05),而大于300 MPa的超高压处理使2株菌的被膜形成量均显著减少(P0.05)。荧光显微镜和扫描电镜观察结果与结晶紫染色结果相符,超高压处理对2株单增李斯特菌被膜形成能力均有影响。小于200 MPa压力处理后单增李斯特菌被膜形成能力增强,并在48 h后被膜形成量达到最大值。     

猪霍乱沙门菌RPA-LFS快速检测方法的建立

为建立一种快速、准确的猪霍乱沙门菌现场检测方法,针对猪霍乱沙门菌侵袭蛋白A(Invasion protein A,invA)基因序列设计特异性引物和探针,优化反应条件,建立重组酶聚合酶等温扩增结合侧向流层析试纸条（RPA-LFS）检测方法。结果表明：建立的方法在39℃等温条件下15 min内即可特异性检出猪霍乱沙门菌,与金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌无交叉反应,该方法对猪霍乱沙门菌的最低检出限为1 CFU/反应;应用该方法对50份猪肉样本进行检测,与PCR方法检测结果一致。建立的猪霍乱沙门菌现场RPA-LFS检测方法敏感性高、特异性强、反应快速、操作简便的特点,可应用于猪霍乱沙门菌的临床快速检测。     

叠氮溴化丙锭对食品中单增李斯特氏菌检测结果的影响

为研究叠氮溴化丙锭(PMA)在单增李斯特氏菌检测中的作用,利用实时荧光PCR方法检测不同浓度PMA处理的单增李斯特氏菌标准菌株CMCC 54004的死菌和活菌核酸的扩增情况。结果显示,1.0 mg/ml PMA能有效抑制单增李斯特氏菌死菌核酸的扩增。经过PMA处理后单增李斯特氏菌死菌与未经PMA处理的检测结果间差异极显著,而PMA处理后CMCC 54004活菌与未经PMA处理的检测结果间差异性不显著。通过对PMA处理的CMCC 54004死菌、活菌、不同比例死菌与活菌混合液以及其在不同食品基质下的检测结果的比较,进一步证实,1.0 mg/ml PMA在单增李斯特氏菌检测中能有效减少死菌核酸的影响,提高检测结果的可靠性。     

酸性电解水对低温条件下单增李斯特菌杀灭效果

单增李斯特菌是能在低温下生长的一种微生物。冷藏即食食品和冷冻食品加工设备中单增李斯特菌的生长是主要的食品安全问题。酸性电解水(AEW)是一种新型高效、安全且无残留的非热灭菌技术。AEW用于灭活4℃条件下的浮游态、生物膜态及冷藏金针菇样品上单增李斯特菌。通过检测AEW处理前后菌落总数变化、生物被膜、生物被膜结构参数以及毒力基因表达,进一步分析样品实验等。结果表明,当电解质NaCl浓度为0.10%,处理时间为1 min、30 min时,4℃和37℃下的单增李斯特菌菌落总数、生物被膜清除率存在极显著差异,相同处理时间,AEW较难杀灭4℃条件下的单增李斯特菌及难清除其生物被膜,本研究为评估冷链中食品和冷藏食品及食品加工设备的安全性提供了新的理论基础,对冷藏食品使用抗菌剂提出更高要求。     

12种中草药对8种畜禽肠道病原菌的体外抑菌试验(简报)

采用平板打孔法和改良的试管二倍稀释法分别测定了12种中草药水提物对8种畜禽肠道病原菌的抑菌直径和最小抑菌浓度(MIC).结果表明:12种中草药水提物对8种供试菌既有不同的抑菌谱,又有不同的抑菌效果,抑菌圈的大小与MIC值存在一定的平行关系.其中,对8种畜禽肠道病原菌(大肠杆菌O2、O139、O8、O78、鸡白痢沙门氏菌、猪伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌)抑菌直径最大的分别为黄芩、乌梅、黄芩、艾叶、乌梅、黄芩、乌梅、乌梅;对上述8种病原菌抑菌效果最好(MIC最小)的分别为五倍子和诃子;五倍子;五倍子和黄芩;石榴皮、五倍子、黄芩、黄连和艾叶;黄芩和黄连;黄芩;石榴皮和五倍子;五倍子和黄芩.     

博落回提取物对猪场常见4种病原细菌的体外抗菌活性研究

【目的】研究博落回提取物(Macleaya cordata extract,MCE)的体外抗菌活性,为其在动物生产中的使用和添加提供试验依据。【方法】以金黄色葡萄球菌、猪霍乱沙门氏菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌为受试菌,采用抑菌圈法测定MCE对4种受试菌的抑制效果;运用微量稀释法测定MCE对4种受试菌的最小抑制质量浓度(MIC)和最小杀菌质量浓度(MBC);通过时间—杀菌曲线法,测定MCE对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀菌效果。【结果】MCE对4种革兰氏阳性和阴性受试菌均有一定的抑制作用,抑制能力由强到弱依次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌和铜绿假单胞菌,MIC分别为64、64、128和512μg/mL,MBC分别为128、128、256和1 024μg/mL;MCE对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外杀菌速率随质量浓度升高而增快,其中8、4、2倍于MIC的MCE分别在2、12、24 h可将2种受试菌完全清除,而1倍MIC的MCE在24 h后仍有少量细菌存活。【结论】MCE对受试菌均有一定的抑制效果,对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外杀菌速率呈现质量浓度依赖性。     

重庆市部分超市鸡肉中单增李斯特菌的耐药性与分子特征分析

为了解重庆市部分地区超市鸡肉中单增李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)的耐药性、毒力基因分布和分子特征,为LM监测程序的建立提供一定的数据支撑,以该地区5个超市鸡肉中分离鉴定的24株LM为研究对象,选用19种抗生素开展药敏试验;用PCR方法检测菌株携带的毒力基因,并开展血清型分型以及多位点序列分型(Multilocus sequence typing, MLST)研究.结果显示：24株分离株对苯唑西林(96.0%)、头孢噻肟(41.7%)和多粘菌素B(37.5%)的耐药率较高,多重耐药率为29.2%; 24株单增李斯特菌中23株均检测出10个毒力基因,仅1株在inlB基因上出现基因缺失.血清型分型结果表明：24株单增李斯特菌大多为1/2型,另有4株致病性较强的4b型菌株. MLST分型共鉴定出11个序列型(Sequence type, ST),其中易引起单增李斯特菌病的常见ST型(ST87,ST9,ST2)菌株占50%(12/24),并发现1个新的ST型ST1011.该研究结果说明该地区超市鸡肉中单增李斯特菌的污染比较严重,耐药情况普遍,且分离株多是致病性较...     

陕西杨凌区市售食品中单增李斯特菌污染状况的调查与分析

【目的】了解陕西杨凌辖区生猪肉、生羊肉、生鸡肉、速冻饺子和即食食品等5类食品中单增李斯特菌的污染情况及其耐药性和血清型,为确保食品安全提供依据。【方法】随机采集杨陵2家超市及1家农贸市场的食品样本共计95个,其中包括生猪肉27份、生羊肉11份、生鸡肉38份、速冻饺子6份和即食食品13份,按照国标GB/T4789.30-2008进行单增李斯特菌的分离培养,用PCR方法进行单增李斯特菌的确证,并用多重PCR法对确证菌株进行血清型测定,采用琼脂稀释法进行药敏性试验。【结果】95个样本中,单增李斯特菌的分离率为13.7%(13/95),其中以即食食品分离率最高,为30.8%(4/13);其次是生鸡肉和生羊肉,分别为21.1%(8/38)和9.1%(1/11);而速冻饺子和生猪肉均未检出单增李斯特菌。超市采集样品中单增李斯特菌污染的检出率较高,为23.6%,农贸市场采集样品中未检出单增李斯特菌。不同温度贮存的样品中,4 ℃贮存样品单增李斯特菌污染的检出率最高,为31.6%,-18 ℃条件贮存样品的检出率为5.9%,而常温贮存样品中未检出单增李斯特菌。单增李斯特菌对头孢西丁、红霉素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、四环素、氯霉素、头孢哌酮的耐药率分别为100%,11.1%,14.8%,26%,4%和3.7%,对庆大霉素、环丙沙星、阿米卡星100%敏感。单增李斯特菌分属5个血清型群体,其中17(63.0%)株为1/2b或3b型,6株(22.2%)为1/2a或3a型,1株(3.7%)为1/2c或3c型,1株(3.7%)为4b、4d或4c型,2(7.4%)株为4a或4c型。【结论】陕西杨凌辖区即食食品和生鸡肉是主要污染单增李斯特菌的食品品种,该单增李斯特菌菌株存在一定程度的多重耐药现象,主要为1/2b或3b及1/2a或3a血清型,对消费者的健康有一定的潜在的危险。     

单核细胞增生性李斯特菌mpl基因的克隆及其原核表达载体的构建

研究对单增李斯特菌Mpl蛋白进行了基因克隆及表达载体的构建.通过PCR方法对标准株单增李斯特菌菌株mpl基因进行扩增,并将其克隆至pET32 a(+)上构建表达载体.经DNA序列测定分析,扩增出的基因与GenBank发表的单增李斯特菌mpl基因序列EF183452和EF183453的同源性为99.7%,氨基酸同源性为1...     

单增李斯特菌的快速检测方法研究进展

单增李斯特菌是一种重要的人兽共患病病原体,其检测已成为食源性疾病预防与控制的重点内容。单增李斯特菌快速检测技术的研究对我国食品安全工作具有极其重要的意义。本文对国内外单增李斯特菌的多种快速检测方法及其检出限进行对比,探讨了快速检测单增李斯特菌在未来的发展方向。     

羊肉中单核细胞增生性李斯特菌的分离与鉴定

单核细胞增生性李斯特氏菌(单增李氏杆菌)是人类一种重要的食源性致病菌.本文从内蒙古某单位送检的羊肉中分离到了一株单增李氏杆菌,并对该菌进行了系统鉴定.首先采用单增李氏杆菌的传统检验方法对该菌进行鉴定,结果发现该菌的菌落形态、菌型特征、生化特征均与单增李氏杆菌相符;再经VITEK全自动细菌鉴定仪、API Listeria...     

冰鲜鸡肉中致病菌三重PCR检测方法的建立

【目的】建立在鸡肉生产一线具有较强操作性,并可同时检测沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157的三重PCR方法。【方法】利用该3种致病菌的特异性基因invA、HlyA、rfbE设计3对引物,在确定方法特异性和抗干扰能力的基础上,用优化后的反应体系对反应灵敏度进行测定,模拟并检测在鸡肉中常见腐败菌和鸡肉基质对检测方法的干扰影响作用下,在前增菌程序的辅助下该方法的实际样品检测灵敏度。【结果】该方法特异性和抗干扰能力强,3种致病菌测序结果的同源性分别达到100%、99%和99%,反应体系的最佳退火温度为51℃,灵敏度试验中3种致病菌同时检出的检测线达到103 CFU/mL,单重的灵敏度达到101 CFU/g,模拟实际样品检测中,经过20 h的前增菌后,三者同时检出的灵敏度达到101 CFU/g,单重PCR的灵敏度达到100 CFU/g;对60份屠宰线上的鸡胴体样品和32份超市鸡肉样品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157的检出率分别为20%、3.3%、21.7%(屠宰线样品)和25%、21.9%、6.25%(超市样品)。【结论】成功建立了可同时检出鸡肉中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157的三重PCR方法,可为生产一线的致病菌检测提供参考。     

同时检测四种病原菌的PCR方法研究

(目的)为建立一种同时检测四种常见动物源致病菌的PCR方法.(方法)本研究针对大肠杆菌的(16s-23s rRNA)基因、金黄色葡萄球菌的(nuc)基因、单增李斯特氏杆菌的(hlyA)基因以及沙门氏菌的(invA)基因分别设计合成了四对特异性引物,PCR扩增的目的基因片段分别为662 bp、484 bp、372 bp、284 bp,并对多重PCR反应条件进行了优化.(结果)建立的多重PCR方法具有敏感、特异、准确、快速的优点,检测时间为4h左右.(结论)为研发同时检测人畜共患病食源性主要致病菌即大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏杆菌及沙门氏菌的试剂盒奠定了基础.