荔枝LcMYB1异源表达促进矮牵牛和番茄花色苷的积累

为分析荔枝LcMYB1的功能,以白色‘W115’矮牵牛和‘Micro-Tom’番茄为材料,利用农杆菌介导法将LcMYB1在矮牵牛和番茄中异源表达,观测转基因植株表型。结果表明：与‘W115’相比,转基因矮牵牛的叶片和花瓣中积累了花色苷,且矮牵牛花色苷生物合成结构基因PhCHS和PhDFR、调控基因PhAN1的表达显著上调;与野生型‘Micro-Tom’番茄相比,转基因番茄的叶片和花药中积累了花色苷,且相应组织花色苷生物合成结构基因SlDFR、调控基因SlAN1和SlJAF13的表达显著上调,虽然果实中没有积累花色苷,但SlAN1和SlJAF13表达也显著上调。LcMYB1在矮牵牛和番茄中异源表达时通过上调花色苷生物合成关键结构基因和调控基因bHLH的表达诱导花色苷积累。因此,荔枝LcMYB1是花色苷生物合成中的关键转录因子,具备异源转化利用的潜力。     

杜鹃红山茶ACO1的克隆及其表达分析研究

根据山茶（Camellia japonica）同源序列设计特异性引物,利用同源克隆和3°,5°-RACE技术,从杜鹃红山茶（C. azalea）花芽组织中克隆出ACC氧化酶（ACC-oxidase, ACO）基因,命名为CaACO1,基因全长1232 bp,开放阅读框963 bp,编码320个氨基酸。实时荧光定量PCR分析发现,ACO1在杜鹃红山茶不同组织中均得到表达,其中茎尖ACO1表达量最低,其次花芽、叶芽、根尖,表达量较高的是真叶和花器官,随着叶片成熟和花器官发育ACO1表达量均逐渐增加。结果表明,该基因可能参与杜鹃红山茶叶片发育,并且与花器官衰老密切相关。ACO1在参试的8个山茶品种花器官发育过程中的表达模式基本一致,但不同品种间的表达量存在差异。相关性分析发现ACO1表达量与花型、花色、花径和花瓣数4个形态指标均无显著相关性。     

香蕉MaARF2基因的克隆及序列表达分析

利用RT-PCR方法从巴西蕉（Musa acuminata L. AAA group, cv. Brazilian）中克隆MaARF2基因,并对其进行序列及表达分析。基因克隆结果获得该基因编码片段,命名为MaARF2,全长2655 bp,编码884个氨基酸,分子量为97 917.38 Da,理论等电点pI为6.64,序列富含丝氨酸、脯氨酸,亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸并均匀分布在整个肽链中;通过Motif Search工具发现了ARF基因所特有的B3、Auxin_resp、AUX_IAA family结构域;多序列比对和进化树分析表明,MaARF2基因编码的蛋白与其他植物中ARF基因编码的蛋白具有较高的一致性。qRT-PCR结果表明,MaARF2在香蕉根、茎、叶、花和果实中均表达, 其中叶片中表达水平最高,果实表达量最低;MaARF2在低温、盐和干旱胁迫后表达量均上调,表明其可能参与调控香蕉低温、盐和干旱胁迫响应的过程。本研究首次在香蕉中克隆了MaARF2基因,为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

杧果炭疽病菌漆酶基因Cglac3序列特征及其在两个侵染相关基因突变体中的表达分析

本研究运用同源克隆技术克隆了杧果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的Cglac3漆酶基因,并采用实时荧光定量PCR分析了该基因在侵染过程、漆酶基因LAC1突变体、外切葡聚糖酶基因CgCBH1突变体中的差异表达情况。结果表明,杧果炭疽病菌漆酶Cglac3基因大小为1842 bp,含3个内含子,大小分别为56、51、58 bp。Cglac3开放读码框编码558个氨基酸,蛋白分子量为61.38 kDa,等电点（PI）为4.50。与未侵染对照0 h的表达量相比,Cglac3在6 h孢子萌发形成附着胞时表达量迅速升高,在12 h侵入寄主后达到最高,之后在菌丝扩展、叶片显症过程中出现波动,但均远高于0 h的表达量,显示Cglac3在侵染的不同阶段均发挥着重要的作用,可能是胶孢炭疽菌的重要致病因子之一。与野生型相比,Cglac3表达量在杧果炭疽病菌漆酶基因LAC1敲除突变体中下降了74%,在外切葡聚糖酶基因CgCBH1敲除突变体中下降了56%;在CgCBH1缺失敲除突变体中,LAC1的表达下降了68%,与Cglac3的表现趋势一致,说明Cglac3的表达受LAC1调控,外切葡聚糖酶基因CgCBH1也会影响Cglac3和LAC1的表达。     

柱花草磷饥饿响应基因SgPHR1和SgPHR2的克隆与表达分析

低磷胁迫是限制作物生长和产量的重要因素之一。磷饥饿响应因子PHR（phosphate starvation response）是植物磷信号调控网络中的关键因子,具有调控植物磷平衡的生物学功能。本研究在柱花草（Stylosanthes guianensis）中克隆到转录因子SgPHR1和SgPHR2基因。SgPHR1和SgPHR2基因cDNA全长分别为1413 bp和849 bp,编码470和282个氨基酸残基,蛋白分子量分别为51.4 kD和30.9 kD。SgPHR1和SgPHR2均为SANT家族成员,包含MYB蛋白结构域和CC蛋白结构域,并具有多个潜在的磷酸化位点。亚细胞定位预测表明,SgPHR1和SgPHR2均定位于细胞核中。实时定量PCR结果表明,SgPHR1基因在柱花草根和叶中的表达量高于茎中的表达量,而SgPHR2基因在叶中表达量显著高于根和茎。缺磷（-P）和缺氮（-N）处理均显著增强了SgPHR1和SgPHR2在柱花草根中的表达。不同缺磷时间处理结果进一步表明了SgPHR1和SgPHR2在转录水平上响应低磷胁迫,暗示SgPHR1和SgPHR2可能参与了柱花草对低磷胁迫的应答。本研究结果为解析柱花草响应低磷胁迫的分子机制提供了候选基因。     

巴西橡胶树HbGRF基因的克隆、物理定位及表达分析

生长调控因子（growth-regulating factors,GRF）是植物特有的一类转录因子,该转录因子家族成员数目较多,在植物生长发育过程中发挥着重要作用。以巴西橡胶树优良品种‘热研7-33-97’为材料,通过RT-PCR方法进行HbGRF基因的克隆;利用生物信息学的方法对其蛋白序列、理化性质、基因结构、进化关系进行分析;利用IS-PCR技术和FISH技术对其进行物理定位分析;采用qRT-PCR对橡胶树中HbGRF基因的表达模式进行研究。结果表明：在橡胶树雌花中克隆到3个GRF基因,分别命名为HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3,分子量分别为65.663、41.188、52.858 kDa,其编码的蛋白长度分别为609、384、494 aa,均为不稳定蛋白;3个基因均具有GRF完整的特征结构域WRC和QLQ,分别属于3个不同亚族。基因物理定位结果表明,HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3基因分别位于橡胶树染色体的第11号长臂、第5号短臂和第9号长臂上,基因到着丝粒的平均百分距离是77.65、42.66和65.27。表达结果显示,橡胶树3个HbGRF基因在茎尖、雌花等生长旺盛的组织中表达量较高,用外源赤霉素和脱落酸处理后,发现表达量呈上升趋势,经过48 h后表达量和初始值基本持平,3个基因在茎尖、雌花中有明显的表达特异性,可能在橡胶树花芽分化及雌花的发育过程中起到了重要作用。该结果为研究橡胶树HbGRF基因的功能及作用机制奠定了理论基础,为橡胶树精准育种提供了分子细胞学依据。     

木薯MeLHCB4基因的克隆及表达分析

本研究采用RT-PCR技术克隆了木薯叶绿素a/b结合蛋白基因MeLHCB4编码区序列。通过生物信息学对其基因结构、基因编码蛋白的理化性质等进行分析,并对不同物种的LHCB4氨基酸序列进行比对和构建进化树。结果表明,木薯MeLHCB4基因的CDs序列全长858 bp,编码285个氨基酸,蛋白理论相对分子质量约为30.9 kDa,理论等电点为5.47,该蛋白属于稳定的亲水性蛋白,预测该蛋白可能定位于细胞核或细胞质中。实时荧光定量PCR检测该基因的表达模式发现,MeLHCB4基因主要在木薯叶片和茎中表达,受到茉莉酸甲酯（JA）、水杨酸（SA）和乙烯前体（ACC）等激素的诱导表达,推测其可能参与了JA、SA、ACC信号途径。细菌性枯萎病病原菌侵染木薯叶片12 h后,MeLHCB4的表达量显著提高,表明MeLHCB4参与了木薯对病原菌的响应过程。     

芒果SEPALLATA3基因的生物信息学与表达分析

SEPALLATA3（SEP3）属于MADS-box基因家族,与植物的成花时间和花器官分化有关。在本研究中,从芒果转录组数据中挖掘获得了2个MiSEP3s基因,分别命名为MiSEP3-1和MiSEP3-2。生物信息学分析显示,MiSEP3-1和MiSEP3-2基因的基因组DNA长度分别为4189 bp和3721 bp,2个基因的开放阅读框长度一致均为732 bp,编码244个氨基酸,蛋白质分子量分别为59.29 kD和59.28 kD。2个MiSEP3s的氨基酸序列中含有典型的MADS结构域和K-box结构域。启动子序列分析显示,2个MiSEP3s基因启动子均包含光响应元件、激素响应元件、逆境响应元件和转录因子结合位点,但调控元件种类和数量存在差异。基因表达模式分析显示,2个MiSEP3s基因在营养期的茎、叶和芽中表达量较低,但在成花转变后期的芽中持续上调表达,在花中达到表达高峰。该结果为MiSEP3基因功能的研究提供参考。     

油棕甾醇合成关键酶基因DWF5的克隆及表达分析

DWARF5（DWF5）基因,编码7-脱氢胆固醇还原酶（7-dehydrocholesterol reductase）,是甾醇合成的关键酶,通过调控甾醇的合成参与植物油体（oil bodies,OBS）的形成。为了探究DWF5基因对油棕果肉中油体发育的影响,以‘热油4号’为材料,提取油棕果肉的RNA,以反转录的cDNA为模板进行基因的全长克隆,获得2个EgDWF5基因并分别命名为EgDWF5-1和EgDWF5-2。运用生物信息学的方法对其理化性质、结构特点和亲缘关系等进行分析预测,利用实时荧光定量PCR对其在油棕的根、茎、叶、花及花后不同时期的果实进行表达水平分析。结果表明：EgDWF5-1和EgDWF5-2基因编码的氨基酸数量分别为434个和374个,相对分子质量为49.71 kDa和42.68 kDa,等电点为8.61和8.69,其蛋白不稳定指数为38.60和38.13,脂肪族指数为98.80和96.68,总平均亲水性为0.347和0.313,均具有疏水性。EgDWF5与水稻和玉米亲缘关系最近,与其他物种关系较远。qRT-PCR分析表明,EgDWF5基因在油棕的各个器官均有表达,其中EgDWF5-1基因在果肉中高表达,显著高于根、叶、花等部位,其表达趋势为花后12~18周升高,至20周时达到最高后表达量逐渐降低,这与油棕果肉中油体的发育趋势基本一致。EgDWF5-2基因在根和茎中高表达而在果肉中表达量低,其果肉中表达趋势为花后12~18周逐渐降低。因此,推测EgDWF5-1参与调控油棕的油体发育,EgDWF5-2未参与该调控而可能在油棕的生长发育中发挥功能。本研究为进一步探索EgDWF5基因调控油棕中油体的形成机制奠定基础。     

LcMYB1激活荔枝花色苷生物合成关键基因LcDFR和LcUFGT1的启动子区域分析

花色苷含量是荔枝果实呈现鲜红色的重要次生代谢产物,前人研究结果表明,LcMYB1通过调控关键基因的表达而影响荔枝果皮中花色苷的积累,其中LcDFR和LcUFGT1是荔枝果皮花色苷生物合成的关键基因,但是LcMYB1如何影响基因的表达,是否与结构基因启动子结合以及具体结合区段目前还不清楚。本研究通过克隆和分析LcDFR和LcUFGT1的启动子区域并对其进行分段处理,利用双荧光素酶和酵母单杂交实验,探究LcMYB1与LcDFR和LcUFGT1的启动子的结合区域。结果表明,LcDFR起始密码子上游1927 bp和LcUFGT1起始密码子上游1584 bp的启动子上分别有3个可能的MYB结合位点;双荧光素酶和酵母单杂交实验均显示LcMYB1可以结合LcDFR基因起始密码子上游904 bp到1425 bp包含有1个MYB-CORE元件的区域,LcMYB1与LcUFGT1基因启动子结合的区域是起始密码到上游610 bp,此区域包含有2个MYB-CORE元件。研究结果进一步证实了LcMYB1通过与基因LcDFR和LcUFGT1启动子结合发挥调控作用,并缩小了结合位点的范围。     

甘蓝型油菜抗草甘膦基因遗传转化及抗性鉴定

为自主研发抗除草剂的甘蓝型油菜,从细菌（Isotericola variabilis）中克隆I.variabilis-EPSPS*基因,使油菜产生草甘膦抗性。通过农杆菌介导法将I.variabilis-EPSPS*转入甘蓝型油菜自交系育127,获得转I.variabilis-EPSPS*基因单株E₁。草甘膦耐受性结果表明,转I.variabilis-EPSPS*基因T₁代在不同浓度草甘膦的培养基中能够正常生长,而非转基因对照生长严重受阻。I.variabilis-EPSPS*成功整合于油菜基因组并可稳定遗传,草甘膦处理后表达量增加,而且在草甘膦浓度改变时仍保持稳定表达。在温室用41%草甘膦异丙胺盐商品制剂（农达）600倍稀释液（1/3田间生产推荐中剂量）处理转I.variabilis-EPSPS*基因E₁的T₁植株,体内莽草酸累计量远低于非转基因对照。通过对角果长、每角果粒数和千粒重等农艺性状考察发现,转基因植株和对照相比无显著性差异。田间喷施农达400倍液（1/2田间生产推荐中剂量）,发现转基因E₁T₁植株正常生长而对照全部死亡。鉴于I.variabilis-EPSPS*基因在转基因油菜中能够稳定遗传并赋予了油菜草甘膦除草剂抗性,认为该抗草甘膦转基因油菜是一份新种质。     

艾纳香脱氢酶基因家族的生物信息学分析

采用RT-PCR和RACE（Rapid amplification of cDNA ends）技术,从艾纳香（Blumea balsamifera (L.) DC.）叶片中克隆到4条编码艾纳香脱氢酶（BbADH1、BbADH2、BbADH3、BbADH4）基因的cDNA序列,并对4条核苷酸及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果显示:4条艾纳香脱氢酶序列开放阅读框均在900 bp左右,蛋白质等电点（pI）值在5.0~9.0之间,含量最多的氨基酸为亮氨酸（Leu）,最少的为色氨酸（Try）,具有明显的疏水区和亲水区,N端未发现信号肽,且无跨膜区;同源性比对结果显示,艾纳香BbADH蛋白与其他植物中ADH蛋白具有高度的相似性,且具有脱氢酶的特征功能域;系统发育分析表明,艾纳香（B. balsamifera (L.) DC.）BbADH1和BbADH3同处于一个分支,且与胡杨（Populus euphratica Oliv.）PeADH物种亲缘关系较近,而艾纳香BbADH4和BbADH2处于不同分支,且分别与葡萄（Vitis vinifera）VvADH和烟草（Nicotiana tabacum）NtADH物种亲缘关系较近。     

Occurrence of resistant strains of Botrytis cinerea to anilinopyrimidine fungicides in table grapes in Chile

Effort to control gray mold caused by Botrytis cinerea failed in a table grapevine (Vitis vinifera) vineyard near Santiago, Chile where cyprodinil (Vangard 50 WP), a new fungicide of the anilinopyrimidine group, had been applied alone up to four times per year during two growing seasons. A relatively high frequency (38.5%) of resistant isolates of B. cinerea (EC₅₀ for mycelial growth inhibition varied from 2.9 to 4.84 μg ml⁻¹) may explain the partial loss of field control efficacy obtained. Resistance was correlated with a complete loss of in vivo sensitivity to cyprodinil. Resistant isolates of B. cinerea showed cross resistance to the anilinopyrimidines fungicides mepanipyrim and pyrimethanil. Cyprodinil partially impaired conidia germination and differentially affected conidial germination of resistant and sensitive isolates. Significant differences (p<0.05) in growth rate, sclerotia production and osmotic sensitivity were found among isolates of B. cinerea, but no correlation could be drawn between these biological differences and resistance or sensitivity. This indicates a disruptive selection characteristic of monogenic resistance. Thus, strategies were implemented to avoid the further development and spread of resistance in B. cinerea to the anilinopyrimidine fungicides. To our knowledge this constitutes the first mention of resistance in B. cinerea populations to anilinopyrimidine fungicides in South America.     

蓖麻RcWD40家族鉴定与表达分析

植物中的WD40蛋白家族通过蛋白质-蛋白质及蛋白质-DNA的互作,参与生物过程,该家族的重要成员TTG1在拟南芥中抑制种子脂肪酸的过早积累。为揭示油料作物蓖麻中RcWD40基因家族及RcTTG1基因的表达特征,利用生物信息学手段在全基因组水平鉴定到182个RcWD40家族成员,其中RcWD40-181为RcTTG1基因,并对它们的系统发育、保守结构域及表达模式等进行分析。根据进化树结构和保守域组成分别将RcWD40家族成员分为8个cluster和28个亚家族。此外,转录组分析显示RcWD40在蓖麻的花、叶、根、茎以及各发育时期种子中具有多样的表达模式,预测家族基因可能调节这些组织的生长发育。启动子区域转录因子结合位点及种子发育表达分析结果预测RcTTG1可能承担与AtTTG1相似的脂肪酸积累负调节功能。     

Grape cane waste as a source of trans-resveratrol and trans-viniferin: High-value phytochemicals with medicinal and anti-phytopathogenic applications

Grape cane waste was investigated as a potential source of high-value phytochemicals with medicinal and anti-phytopathogenic applications. Extraction yields of trans-resveratrol and trans--viniferin from Vitis vinifera cv. Pinot Noir grape cane were 3.45 ± 0.04 and 1.30 ± 0.07 mg g⁻¹ dw, respectively. The analyte extraction efficiencies were investigated using protic and aprotic solvents. Yields varied 22-fold over the range of solvent systems investigated, demonstrating the importance in solvent polarity and hydrogen bonding capability for efficient extractions. The current study suggests that these compounds can be quantitatively extracted from grape cane residue using low-cost, environmentally benign, and non-toxic aqueous alcoholic solvent systems such as ethanol:water mixtures. With current commercial values of trans-resveratrol and trans--viniferin between US$ 2000 and US$ 3000 per kg, established stilbene yields from cane waste could represent an agricultural coproduct valued at US$ 2000–US$ 3000 per hectare of production. At present levels of worldwide wine grape production, the extraction of trans-resveratrol and trans--viniferin from grape cane waste may reach a global economic value of >$30 billion.     

茉莉花JsMYB108和JsMYB305基因的克隆及其对TPS基因的激活作用

基于茉莉花叶转录组（GenBank登录号为GHOY00000000）筛选了2个在花瓣中及夜间优势表达,且与其他物种中香气调控转录因子同源度高的MYB基因进行克隆并分析了它们在花朵开放中的表达模式。2个MYB基因编码序列长度分别为864 bp和588 bp,编码287 aa和195 aa个氨基酸残基。分别与拟南芥AtMYB108及AtMYB24亲缘关系相近,与油橄榄（Olea europaeavar. sylvestris）MYB108-like protein和MYB305-like protein相似度最高,分别命名为JsMYB108和JsMYB305。JsMYB108和JsMYB305在夜间表达量显著高于白天,与4个茉莉花萜类合成酶基因JsTPS表达特征一致。为探究JsMYB108和JsMYB305是否参与萜类香气调控,将其构建至植物表达载体pK7FWG2.0（35 S启动子,GFP报告基因）中,利用茉莉花茎段愈伤组织遗传转化体系检测其对愈伤组织中4个JsTPS基因表达水平的影响。结果显示：转化了JsMYB108和JsMYB305的愈伤组织内能检测到GFP荧光和2个MYB基因转录本;JsMYB108可显著提高JsTPS2表达水平,JsMYB305可显著提高4个JsTPS基因的表达,暗示JsMYB108和JsMYB305可能不同程度地参与了萜类合成的调控。该研究结果为今后茉莉花香气调控的深入研究提供参考。     

茶树花Cu/Zn-SOD酶活性及其基因表达分析

为研究Cu/Zn-SOD基因在茶树花不同发育阶段、不同品种间的表达规律以及Cu/Zn-SOD基因表达量与酶活性之间的关系,本研究将‘龙井43’品种茶树花分为4个发育阶段,选择15个品种的茶树花为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术对3个Cu/Zn-SOD基因表达水平进行定量分析,同时测定Cu/Zn-SOD酶活性。结果表明:在茶树花的4个发育阶段中,第4阶段Cu/Zn-SOD酶活性最低,与其他3个阶段具有显著差异;不同品种的茶树花Cu/Zn-SOD酶活性有较大差异,其中‘紫鹃’茶树花Cu/Zn-SOD酶活性最高,其次是‘黄金芽’和‘白叶1号’,‘黄观音’的Cu/Zn-SOD酶活性最低。茶树花不同发育阶段中Cu/Zn-SOD基因表达水平存在较大差异,细胞质型Cu/Zn-SOD1基因表达水平远高于叶绿体型Cu/Zn-SOD2和过氧化物酶体Cu/Zn-SOD3;不同品种茶树花Cu/Zn-SOD基因表达水平有较大差异,Cu/Zn-SOD1基因在‘黄牡丹’茶树花中表达量最高,Cu/Zn-SOD2基因在‘白叶1号’和‘黄观音’茶树花中表达量最高,Cu/Zn-SOD3基因在‘紫鹃’茶树花中的表达量最高。相关性分析得知‘龙井43’茶树花不同发育阶段Cu/Zn-SOD酶活性与Cu/Zn-SOD基因表达量之间的相关性不明显,而不同品种茶树花的Cu/Zn-SOD酶活性与Cu/Zn-SOD3基因表达量存在显著相关性。本研究初步明确了Cu/Zn-SOD酶活性较高的茶树品种和茶树花适宜的采摘时间,为茶树花SOD进一步研究提供参考。     

基于转录组的荔枝泛素结合酶基因家族的鉴定及表达分析

泛素结合酶在泛素化级联反应中居于中心位置,是连接泛素活化酶和泛素连接酶的桥梁,在泛素化系统中发挥着关键作用。本研究基于荔枝转录组数据库,利用生物信息学方法对转录组数据库泛素结合酶UBC基因家族进行鉴定,最终得到28个LcUBC基因家族成员。通过荧光定量PCR技术对LcUBC基因家族在‘妃子笑'荔枝不同组织中进行时空表达分析,并对花穗对照和烯效唑处理花穗发育的不同时期进行表达分析。结果表明：LcUBC基因家族成员对应所编码的氨基酸数分布在85~1146 aa之间,等电点大小在4.03~9.61之间,5个LcUBC蛋白为稳定蛋白,其余均为不稳定蛋白。2个LcUBC蛋白定位于细胞质,2个LcUBC蛋白定位于细胞质和细胞核,1个LcUBC蛋白定位于内质网,其余蛋白均定位于细胞核。系统进化分析结果表明,LcUBC蛋白分为10个亚家族;28个LcUBC基因家族成员在不同组织的表达量存在差异;烯效唑处理‘妃子笑'荔枝花穗与对照相比,烯效唑处理21 d后,LcUBC基因家族成员的多个基因表达量较高。这是在转录组水平分析LcUBC基因家族成员,本研究结果对今后该基因家族的分类、克隆和功能研究提供了参考依据。