拟轮枝镰孢ATMT突变体库的构建及分析

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的拟轮枝镰孢ATMT(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠(cefotaxime sodium,Cefo)和氨苄青霉素钠(ampicillin sodium,Amp)对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B(hygromycin B)的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因(GFP)、潮霉素抗性基因(HPH)的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150μg·mL~(-1)时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150μg·mL~(-1)时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP(登录号:LC420351.1)的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。     

拟轮枝镰孢ATMT突变体库的构建及分析

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记的拟轮枝镰孢ATMT（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠（cefotaxime sodium,Cefo）和氨苄青霉素钠（ampicillin sodium,Amp）对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B（hygromycin B）的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因（GFP）、潮霉素抗性基因（HPH）的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150 μg·mL ^-1时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150 μg·mL ^-1时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP（登录号：LC420351.1）的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。 【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。     

农杆菌介导的芒果胶孢炭疽菌遗传转化及致病性缺陷突变体的筛选

构建含潮霉素抗性基因和GFP基因的双元载体p CAMBgfp,以其为转化载体用农杆菌EHA105介导的方法对芒果胶孢炭疽菌Cg-8菌株进行遗传转化,以潮霉素抗性和GFP荧光来筛选阳性转化子。然后,通过离体接种芒果叶片和果实观察病斑大小筛选致病性缺陷转化子。结果获得500个阳性转化子,转化效率为平均106个孢子可获得400个左右同时具有潮霉素抗性和GFP荧光的阳性转化子,且其经多次在无潮霉素的培养基上传代后能得到稳定遗传。随机挑选其中13个突变体进行PCR检测,均可扩增出潮霉素基因目的条带,致病性分析从中筛选得到8个致病性减弱或缺失突变体。     

农杆菌介导苹果炭疽病菌的遗传转化及转化子鉴定

【目的】优化农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导转化苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的技术体系,并对转化子进行筛选鉴定,比较其生物学特性和致病性差异。【方法】以苹果炭疽病菌LXS010101分生孢子为转化受体,利用携带重组双元载体的农杆菌进行转化;对获得的转化子进行遗传稳定性测定、PCR检测及Southern blot分析;选取一定数量的转化子,比较其菌落形态、生长速率及分生孢子发育等主要生物学性状及致病性的差异。【结果】苹果炭疽病菌的最优转化体系为：病菌分生孢子悬浮液浓度1×105个/mL,共培养温度和时间分别为22℃和24 h,共培养基中添加200 μmol•mL-1乙酰丁香酮,其转化效率达到1×105个孢子可获得439个转化子。随机选取30个转化子进行鉴定,发现T-DNA已整合进炭疽病菌基因组中,在所检测的转化子中都是以单拷贝的形式整合,且能够稳定遗传。与野生型菌株相比,转化子的菌落形态没有发生明显变化,但23.33%的菌株生长速率显著减低;转化子ATJ-3和ATJ-15不能产生分生孢子,在28个产孢菌株中,分生孢子萌发率显著减低的菌株占39.29%,附着胞形成比例显著减低和形态异常的菌株占25.00%。致病性测定结果显示,11个转化子的致病力显著降低,其中菌株ATJ-19完全丧失致病能力。【结论】优化的苹果炭疽病菌遗传转化技术体系,可用于炭疽病菌致病相关基因的克隆及致病分子机理的研究。     

根癌农杆菌介导致病疫霉转化体系的建立

为建立低成本、快速、高效的根癌农杆菌介导的致病疫霉转化体系,以菌株 HK0919为材料,从抗生素筛选浓度、共培养转膜方式、乙酰丁香酮（AS）浓度、共培养时间和共培养温度等方面对致病疫霉的转化体系进行了研究。综合各因素优化结果,建立的转化体系条件为：以1．0μg/mL的潮霉素B进行转化子筛选,采用玻璃纸作为共培养介质,AS浓度为200μmol/L,培养6 d,温度为22℃。在此条件下的转化效率为每106个游动孢子获得50～60个转化子。随机选取10个转化子,利用特异性引物对潮霉素抗性基因hph进行PCR扩增,转化子均能扩增出800 bp左右的预期条带;同时,利用根癌农杆菌vir基因特异引物对转化子进行 PCR扩增,排除了转化子被农杆菌污染所致的假阳性;转化子继代培养5代后,仍能在含潮霉素 B的黑麦培养基上生长。说明外源T DNA已成功整合到致病疫霉基因组中,并能稳定遗传。     

根癌农杆菌介导的新暗色柱节孢菌遗传转化

火龙果是一种新兴的热带水果,随着种植面积的不断增大,病害问题日趋严重,其中危害最大的是火龙果溃疡病,导致火龙果溃疡病的病原菌为新暗色柱节孢菌（Neoscytalidium dimidiatum）。为了研究新暗色柱节孢菌的遗传变异与基因功能,必须建立有效的遗传转化体系,但目前国内外未见相关报道。本研究通过构建含有gpdA启动子、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein）和潮霉素（Hygromycin）抗性基因为筛选标记的双元表达载体,对新暗色柱节孢菌的孢子进行根癌农杆菌介导的遗传转化,成功获得了阳性转化子。通过荧光显微镜观察表明,阳性转化子菌丝能够产生绿色荧光,野生型菌丝不能产生绿色荧光;PCR检测证明了转化子基因组中整合了潮霉素抗性基因。因此,本研究成功实现了根癌农杆菌介导下绿色荧光蛋白基因在新暗色柱节孢菌中的稳定遗传表达,为研究新暗色柱节孢菌对火龙果溃疡病的致病机制奠定了技术基础。     

农杆菌介导的黄瓜炭疽菌遗传转化

建立并优化了农杆菌介导转化瓜类炭疽菌(Colletotrichum lagenarium)获得T-DNA插入突变体体系,包括农杆菌使用浓度、农杆菌与炭疽菌孢子共培养时间、抗生素配合使用抑制农杆菌污染等.所用的转化载体pBIG2RHPH2-GUS-GFP除了抗生素选择标记外还携带有融合GFP-GUS报告基因.转化106个孢子平均可获得约150～200个潮霉素抗性转化子.PCR检测表明,所有潮霉素抗性转化子菌株都能从其基因组DNA中扩增到转化载体中的GUS基因片段,而且都能产生GFP荧光或GUS染色阳性.转化子菌株经过连续继代培养后保持稳定.随机对36个转化子菌株进行致病性测定,发现1个转化子菌株对黄瓜致病性下降,1个丧失致病性,而大多数表现为野生型致病性.农杆菌介导转化瓜类炭疽菌体系的建立,为进一步构建大库容量的T-DNA插入突变体库、致病性突变体筛选以及致病性相关基因的克隆鉴定奠定了基础.     

层出镰刀菌T-DNA插入突变体库的构建与分析

苹果再植病害(Apple replant disease,ARD)是世界苹果主产区广泛发生的病害。前期研究表明,层出镰刀菌是造成苹果再植病害的重要致病菌之一,但其分子致病机制尚缺乏研究报道。本研究的目的是建立农杆菌介导的层出镰刀菌的遗传转化体系,并获得大规模的遗传稳定的层出镰刀菌ATMT突变体库,为研究该菌的分子致病机理奠定基础。对影响农杆菌介导转化效率的主要因子进行单因子条件测验,得到其最优转化体系为:抑制H10菌丝和孢子生长的潮霉素的浓度为100μg/mL,层出镰刀菌的分生孢子浓度为107个/mL,农杆菌OD600值为0.3,AS浓度为200μg/mL,共培养时间为48h,共培养温度为26℃。利用这一体系构建了3000个转化子的突变体库,并对随机选择的200个突变体进行潮霉素抗性基因的PCR检测,并经过在PDA培养基上5代培养,验证了T-DNA插入片段的稳定性。     

根癌农杆菌介导火龙果溃疡病菌遗传转化体系的构建及转化子筛选

为了探究火龙果溃疡病病原菌的致病机理,笔者利用农杆菌介导的遗传转化技术,分析了根癌农杆菌浓度、分生孢子萌发时间以及共培养温度等3个主要因素对遗传转化效率的影响,建立火龙果溃疡病菌的遗传转化技术体系,并对转化子进行筛选。结果表明,当农杆菌浓度OD₆₀₀=0.5、分生孢子萌发时间24 h、共培养温度25℃时遗传转化效率最高(833个转化子/106分生孢子);随机挑选200个转化子进行筛选,获得3株菌落形态与野生型菌株差异较大的转化子,4株产孢量减少的转化子,5株产孢量增加的转化子,6株致病力下降的转化子。     

建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02的绿色荧光蛋白基因标记

【目的】开展建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02的绿色荧光蛋白标记研究,直观观察尖孢镰刀菌在建兰植株上的侵染为害,明确病原菌的致病过程,为开展建兰茎腐病原菌的相关研究提供良好技术手段。【方法】采用农杆菌介导法对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02进行绿色荧光蛋白(GFP)转化,并检测转化子的遗传稳定性。【结果】GFP基因可被成功导入到尖孢镰刀菌F-02中并获得表达,转化子在蓝色光源激发下,菌丝和分生孢子均能稳定散发绿色荧光;转化子10次继代培养后菌落生长良好,菌丝和分生孢子仍可稳定散发出绿色荧光,对寄主植物的致病力也未发生改变,【结论】GFP基因可在建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02中稳定存在,并对其致病力没有影响。     

Development of Highly Efficient Transformation System of Yeast-Like Conidia of Tremella fuciformis

Tremellafuciformis is one of higher basidiomycetes. Its basidiospore can reproduce yeast-like conidia, which is also called the blastospore by budding. The yeast-like conidia of T. fuciformis is monokaryotic and easy to culture by submerged fermentation similar to yeast. Thus, it is a good recipient cell for exogenous gene expression. In this study, the expression plasmid pAN7-1 （containing promoter gpd-An derived from Aspergillus nidulans and selectable marker gene hph conferring resistance to hygromycin B） and plasmid pLg-hph （containing promoter gpd-Le derived from Lentinula edodes and selectable marker gene hph） were transformed into the yeast-like conidia of T. fuciformis by PEG-mediated protoplast transformation, respectively. The primary putative transformants were selected by the sandwich screening method with the selective medium containing 50 μg mL^-1 hygromycin. The putative transformants were obtained from the primary putative transformants transferred on PDSA plates containing 100 μg mL^-1 hygromycin for second round selection. Experimental results showed that the optimal concentration of PEG 4000 for mediating protoplast transformation was 25%. PCR and Southern blotting confirmed that the selectable marker gene hph was integrated effectively into the genome of the yeast-like conidia of T. fuciformis with plasmid pLg-hph transformation. Its transformation efficiency was 110 transformants per μg DNA, and the hph gene was integrated into the genome of some yeast-like conidia with plasmid pAN7-1 transformation. However, its transformation efficiency was only 9 transformants per μg DNA. The presence of hph gene in the genome of transformants after 5 generations of sub- culturing on PDSB medium was confirmed by PCR, suggesting that the foreign gene hph was stable during subculture.     

香蕉枯萎病菌4号生理小种农杆菌介导遗传转化体系的建立及T—DNA插入突变体的筛选

【目的】通过农杆菌介导的遗传转化（ATMT）方法,建立香蕉枯萎病4号生理小种的高效转化体系,构建病原菌的突变体库并进行筛选,为已突变基因提供分子标记,在分子水平上对香蕉枯萎病菌的功能基因进行深入研究。【方法】通过单因子变量（试验材料、真菌孢子浓度、农杆菌预诱导终浓度、IM诱导培养基pH、共培养介质、共培养时AS浓度、共培养温度）试验,研究影响农杆菌介导的遗传转化效率的关键因素,并通过形态观察与致病性试验筛选突变体。【结果】得到的最佳转化条件为：农杆菌预诱导浓度OD600=0.8,病原菌孢子浓度106 CFU/mL,转化受体材料为分生孢子,共培养培养基pH 5.4,共培养温度25 ℃,共培养培养基中AS浓度200 μmol/L,共培养介质为硝酸纤维素膜。通过条件优化,转化效率可达到800-900个转化子/106个孢子。【结论】通过农杆菌介导的遗传转化成功将GFP基因转入病原菌中并表达,构建了病原菌的T-DNA插入突变体库,并通过筛选得到多个表型和致病性发生变化的突变体,为香蕉枯萎病菌基因组功能注释的研究奠定了基础。     

施肥对洞庭湖平原水稻土团聚体特征及其有机碳分布的影响

【目的】团聚体是土壤重要的物理属性,也是土壤有机碳的主要固存场所。研究长期不同施肥对洞庭湖平原红壤性水稻土团聚体数量、稳定性、分形特征及其有机碳含量及分布的影响,为区域双季稻田施肥管理提供理论依据。【方法】以国家稻田土壤肥力与施肥效应长期试验为平台（1986—2013）,运用湿筛法获得不同粒级水稳性团聚体,分析对照（不施肥,CK）、单施氮磷钾肥（NPK）、低量有机肥与氮磷钾肥配施（LOM,有机肥氮比例为30%）和高量有机肥与氮磷钾肥配施（HOM,有机肥氮比例为60%）4种处理影响下耕作层（0—20 cm）土壤粒径＞0.25 mm的水稳性团聚体数量（WR_0.25）、平均重量直径（MWD）、几何平均直径（GMD）、分形维数（D）及其有机碳含量与分布的变化特征。【结果】除粒径＞5 mm的土壤团聚体外,水稳性团聚体含量和团聚体对土壤有机碳的贡献率均随团聚体粒径减小呈现逐渐增加的趋势,而团聚体有机碳含量则呈现逐渐降低的变化趋势,其变化特征在不同处理间表现一致。长期不同施肥对2—5 mm和0.5—2 mm团聚体含量影响最大,与对照相比,施肥处理中上述两粒级团聚体含量分别增加35.5%—64.5%和6.2%—14.7%。施肥后团聚体的WR_0.25、MWD、GMD分别增加8.6%—12.5%、7.1%—15.1%、13.7%—28.4%,而D值降低2.3%—3.5%,说明长期施肥增强团聚体稳定性,改善团聚体结构。单施氮磷钾肥和氮磷钾肥配施有机肥均可显著提高各粒级团聚体中有机碳含量（P＜0.05）,并始终表现出HOM强于LOM、LOM强于NPK的处理效应,与对照相比,HOM处理各级团聚体中有机碳含量较对照提高了22.1%—36.6%。水稳性大团聚体是土壤有机碳的主要载体,不同处理间＞0.25 mm团聚体中有机碳的分量占土壤有机碳的比例表现出HOM（83.5%）＞LOM（81.6%）＞NPK（79.2%）＞CK（69.9%）的顺序。施肥各处理均可显著提高＞5 mm、2—5 mm、0.5—2 mm三级团聚体中有机碳对土壤有机碳的贡献率,且主要影响土壤有机碳在2—5 mm和0.5—2 mm两级团聚体中的分配率。＞0.5 mm的各级团聚体含量与土壤有机碳含量呈极显著正相关（P＜0.01）,说明施肥后土壤新增有机碳主要向＞0.5 mm的水稳性团聚体中富集。【结论】长期实行NPK平衡施肥及与有机肥配施有利于洞庭湖平原红壤性水稻土水稳性团粒结构的形成及大团聚体中有机碳的积累,与单施氮磷钾肥处理相比较,施用有机肥特别是高量有机肥与化学氮磷钾肥配施更有利于土壤良好结构体的形成和固碳能力的增强,是更优的稻田施肥模式。     

玉米大斑病菌REMI体系的建立及突变体分析

 【目的】建立高效的玉米大斑病菌REMI遗传转化体系,进而利用该技术创制突变体,为克隆病菌生长发育和致病性相关的基因奠定基础。【方法】摸索玉米大斑病菌原生质体制备的菌龄、酶系统及酶解条件、原生质体收集方式、转化子最适潮霉素B筛选浓度以及转化使用的质粒,建立该病菌高效的REMI转化体系;利用PCR技术对潮霉素B抗性转化子进行筛选并对部分突变体进行分析。【结果】培养20 h的幼嫩菌丝,用浓度分别达到 1.25%的Lyallzyme、Snailase和Drislase 3种酶混和液酶解4 h、离心速度为3 000 r/min时原生质体产量最大;当潮霉素B浓度为50 μg?mL-1时,野生型菌株的分生孢子萌发和菌落生长完全受到抑制,可选用该浓度作为转化子的筛选浓度;使用pAN7-1转化效率较高,对利用该体系转化获得的大量转化子进行PCR检测中筛选出了部分产孢量和致病力变化的突变菌株。【结论】建立了玉米大斑病菌的REMI遗传转化体系,将为玉米大斑病菌突变体库的建立和致病相关基因的克隆奠定基础。     

玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因 StPKS 功能分析

 【目的】利用RNA干扰技术初步探讨玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因（StPKS）的功能。【方法】本试验将玉米大斑病菌StPKS基因片段连接到pSilent-1载体中,构建StPKS基因的RNA干扰载体pSilent-StPKS1-2。通过聚乙二醇介导的方法转入玉米大斑病菌野生型菌株01-23的原生质体,利用潮霉素筛选得到转化子,采用半定量RT-PCR方法分析转化子StPKS基因的表达情况,显微观察转化子与野生型菌丝形态的差异。【结果】本研究构建的StPKS基因RNA干扰载体对沉默该基因表达是有效的,经潮霉素抗性筛选,得到了30株阳性转化子,对其中5株黑色素积累下降、菌落颜色变浅的转化子进行了半定量PCR分析发现,5株转化子的StPKS基因表达量均有所下降;显微观察发现5株转化子的菌丝形态很不规则,发生了膨大、变形、分枝等现象。【结论】StPKS基因在DHN黑色素合成途径中起作用,其表达量下降会减少黑色素的产生,试验同时发现该基因与菌丝形态密切相关。     

紫杉二烯合酶基因在灵芝中的表达

【目的】论文旨在研究紫杉二烯合酶基因（ts）在灵芝中的表达情况,为利用灵芝作为生物反应器表达紫杉醇及其中间产物提供科学理论依据。【方法】制备灵芝菌株的原生质体：把培养好的灵芝菌丝用0.6 mol•L-1的甘露醇溶液洗涤两次后,加入1%溶壁酶溶液,30℃水浴酶解3 h,离心去上清液得到纯的灵芝原生质体,用0.6 mol•L-1的甘露醇溶液把原生质体的浓度调整到108个/mL备用;外源基因（ts）的转化：在含有灵芝原生质体的缓冲液各加入含有ts基因和潮霉素抗性基因hph的真核表达载体pgGIgpd-TS和pBgGI-hph 1.0 μg,冰浴30 min;加入0.5 mL PEG buffer,在室温下放置20 min;将离心收集的原生质体涂布在不含有潮霉素的再生平板上,25℃培养5-7 d后,待长出白色菌落后,往平板表层覆盖一层含有潮霉素的PDA半固体培养基,于25℃培养;转化子的鉴定：以灵芝的菌丝基因组DNA和RNA为模板,进行PCR和RT-PCR扩增,鉴定ts基因在灵芝中的表达情况;目标产物的检测：对提取的产物采用不分流进样的方式进行气相质谱联用（GC-MS）检测,进样温度250℃,初始温度100℃,保留1 min,每分钟升高8℃,加热到300℃,保留2 min。【结果】经潮霉素初步筛选后,在含有潮霉素抗性的平板上长出白色的菌落,灵芝原种作为阴性对照的平板上没有长出菌落,说明潮霉素基因被成功转入了灵芝并得到了初步的表达;PCR鉴定结果表明20个拟转化子中有4个转化子同时整合了ts基因和hph基因,两个基因的共转化率为20％;RT-PCR鉴定结果表明,4个灵芝转化子实现了外源ts基因的转录;提取转ts基因灵芝的菌丝产物;经过GC-MS测定分析表明,与原种相比,含有ts基因的灵芝工程菌株有一个明显的差异峰,对该峰进行离子碎片分析表明,该物质为紫衫二烯,说明在含有ts基因的灵芝菌丝体中含有目标产物紫衫二烯。【结论】灵芝作为大型真菌,首次被证实可以通过代谢工程生产合成紫杉醇过程中的中间产物紫杉二烯,为以后紫杉醇的生产提供一个潜在的可能,对今后开展灵芝的分子生物学研究具有重要意义。     

蛋白激酶A催化亚基VdPKAC1对菌丝型大丽轮枝菌V07DF2培养性状及致病力的调控

【目的】通过同源重组敲除技术,解析菌丝型大丽轮枝菌中蛋白激酶A催化亚基基因VdPKAC1在调控微菌核发育、产孢及其致病力方面的作用。【方法】利用Invitrogen公司的Gateway®技术构建VdPKAC1的同源重组敲除质粒。该质粒的潮霉素抗性基因盒两端分别为靶标基因5′和3′端各1 kb的DNA序列。通过农杆菌AGL-1的介导,将该质粒的T-DNA区域整合到来源于棉花的菌丝型大丽轮枝菌V07DF2菌株中。从6个随机选择的含有潮霉素抗性基因片段的转化子中,通过靶标基因的PCR检测,获得了5个VdPKAC1基因敲除突变体。经过Southern杂交检测,选择了3个敲除突变体材料（2B5、C5和HH2）进行突变表型的观察和分析。在液体PDB培养7 d后观察敲除突变体与野生型菌株的黑色素产生情况;在固体PDA培养28 d后,观察敲除突变体与野生菌株的菌丝生长和休眠结构形成情况。此外,利用棉花根提取物对液体Cazpek-Dox培养7 d的各菌株分别进行诱导处理,在处理24、72 h后分别统计分生孢子数量,以此对敲除突变体和野生菌株的分生孢子产生能力进行评估。最后,将孢子浓度为1×107个/mL的突变体和野生菌株的分生孢子液灌根接种2叶期的棉花,测定其致病力。【结果】Southern杂交结果表明,在上述5个敲除突变体中,只有2B5和C5两个菌株为T-DNA单拷贝插入,而其他菌株均存在T-DNA异位整合的情况。在PDA培养条件下,3个敲除突变体（2B5、C5和HH2）与野生型相比具有黑色素合成增加,气生菌丝更加发达的特点。其中,敲除突变体2B5和C5在平板培养条件下还形成了野生型菌株没有的、与典型微菌核形态不同的深褐色“链状休眠菌丝体结构”。在棉花根提取物的诱导处理下,3个敲除突变体产生的分生孢子数量少于野生型菌株。另外,致病力分析结果表明,敲除突变体材料仍然具有一定的致病力,但却显著弱于野生菌株V07DF2。【结论】在大丽轮枝菌中,通过蛋白激酶A介导的环腺苷酸信号途径控制多种重要性状,而VdPKAC1是这一途径中的重要成员。以前的报道证实,VdPKAC1负调控微菌核的数量,而本研究利用菌丝型菌株V07DF2在PDA培养基上不产生微菌核的这一特性,通过同源重组原理敲除该负调控基因,成功获得可以在PDA上产生休眠结构的菌丝型大丽轮枝菌菌株的突变体。这些突变体材料将为大丽轮枝菌微菌核发育信号途径及其调控基因的发掘提供平台和基础。     

稻曲病菌T-DNA插入突变菌株B1241侧翼基因克隆

【目的】分析稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)致病力减弱的T-DNA插入突变菌株B1241的生物学性状和致病力,并结合分子生物学手段研究其T-DNA插入位点的侧翼基因,以解析突变基因在稻曲病菌生长和致病过程中的作用,从而为阐明稻曲病菌致病机制提供理论基础。【方法】以野生菌株P1作为对照,观察并检测突变菌株B1241的菌落形态、生长速率、孢子形态、产孢量等生物学性状;采用注射接种的方法将菌丝和孢子的混合液接种于水稻穗苞中,统计每穗发病的病粒数,分析B1241的致病性变化;突变菌株B1241在不含有潮霉素的PSA平板上转接5代之后,PCR检测T-DNA插入的稳定性并通过Southern杂交分析B1241中T-DNA插入的拷贝数;利用HiTail-PCR获得T-DNA插入位点的侧翼序列,经NCBI比对得到侧翼基因;运用RACE-PCR克隆插入位点侧翼基因全长;qRT-PCR分析侧翼基因的表达情况。【结果】经生物学特性观察及田间接种发现,与野生菌株P1相比,突变菌株B1241在固体培养基MM、PSA和TB3上的菌落和孢子形态以及生长速率无显著差异,其致病力、产孢能力均呈极显著下降。B1241在不含潮霉素的PSA平板上转接5代之后,仍能扩增到GFP和HPH基因,说明T-DNA已经稳定地插入到其基因组中。Southern杂交结果显示T-DNA在该突变菌株中以单拷贝的形式插入。经扩增并比对侧翼序列,T-DNA的插入位点处少了28 bp的稻曲序列,有37 bp在T-DNA及稻曲病菌基因组中都没有比对到。NCBI比对发现,侧翼基因Uvt-1241与UV-8b菌株的UV8b-7878基因同源,开放阅读框长2 317 bp,包含81和106 bp的2个内含子,编码709个氨基酸。经RACE-PCR获得基因全长2 650 bp,5'非编码区长度为14 bp,3'非编码区长度为319 bp。T-DNA插入在基因Uvt-1241的启动子区域,位于起始密码子之前516 bp处。qRT-PCR分析结果表明,Uvt-1241在该突变体中表达量下降。该基因编码一个糖基水解酶18家族的蛋白,同时含有一个保守结构域D××D×D×E。【结论】稻曲病菌突变菌株B1241中,T-DNA插入到基因Uvt-1241的启动子区域,从而导致该启动子功能部分缺失,基因表达量下降,使得突变菌株的生长、产孢等生物学特性及致病力发生改变,由此推测该基因可能在稻曲病菌生长及致病过程中起着重要的作用。