脱甲河流域水体溶解有机碳时空分布特征

以亚热带脱甲河农业小流域为研究对象,利用高温催化氧化法和顶空平衡-气相色谱法对脱甲河水系4级河段(S1、S2、S3和S4)溶解有机碳(DOC)浓度与环境因子进行了1年周期(2014年12月至2015年11月)的连续观测,并初步探讨了DOC浓度与环境因子间的相关关系。结果表明:脱甲河DOC浓度范围在0.46~9.54 mg·L~(-1)之间,均值为3.09±0.01 mg·L~(-1);在季节变化上,DOC浓度表现为夏季春季冬季秋季;在空间分布上各级河段DOC浓度随河流级别的增加逐渐增大,变化范围为(1.36±0.07)~(4.25±0.21)mg·L~(-1),4级河段间DOC浓度出现了显著差异(P0.01),表明外源输入可能是不同河段DOC浓度变异的主要原因;DOC浓度与河水溶存二氧化碳(CO_2)浓度、盐度、温度、溶解总固体(TDS)及电导率(EC)呈极显著正相关(P0.01),与溶解氧(DO)呈显著负相关(P0.05),而与pH值变化无显著关系。研究表明,不同强度的水体理化性质及外源输入是造成DOC浓度差异的主要原因,研究结果可供亚热带其他农业小流域水系DOC浓度时空分布及影响因素研究参考。     

马占相思人工林土壤温室气体排放日变化规律研究

【目的】探索马占相思Acacia mangium人工林土壤温室气体排放日变化规律,确定最佳观测时间。【方法】采用静态箱-气相色谱法,对华南地区马占相思人工纯林土壤3种温室气体CO_2、CH_4、N_2O通量进行连续观测。【结果】马占相思人工林土壤3种温室气体具有明显的日变化特征,马占相思人工林土壤为CO2和N2O的排放源及CH_4的吸收汇,其通量日变化幅度分别为:401.33~555.59 mg·m~(-2)·h~(-1)、24.50~34.72μg·m~(-2)·h~(-1)和-10.96~-41.88μg·m~(-2)·h~(-1)。地表CO_2、CH_4通量和5 cm深土壤温度呈极显著(P0.01)或显著(P0.05)相关,地表N_2O通量同温度的相关性不显著。【结论】通过对矫正系数分析,综合考虑3种温室气体以及取样的可操作性,华南地区马占相思人工林雨季的最佳观测时间为09:00时左右。     

贵州草海上覆水与沉积物中砷的分布特征及扩散通量估算

对草海不同区域沉积物上覆水及孔隙水、附近河流和雨水中砷的含量与分布特征进行了分析,并利用一维孔隙水扩散模型估算了砷在沉积物-水界面的扩散通量。结果表明:草海出口砷含量为1.59μg·L~(-1),明显高于流入草海的水体端元(平均值0.32μg·L~(-1))和雨水(0.37μg·L~(-1))中砷浓度;草海上覆水中砷的空间分布表现为挺水植物区(2.99~3.45μg·L~(-1))沉水植物区(1.79~2.34μg·L~(-1)),垂直分布上无明显变化,挺水植物区上覆水体中的砷以As(Ⅲ)(H_3AsO_3)形态存在,沉水植物区上覆水体中的砷以As(Ⅴ)(HAsO~(2-)_4)形态存在;而沉积物和孔隙水中总砷含量垂直方向上波动较大,规律与上覆水相似,均表现为挺水植物区沉水植物区,其中挺水植物区沉积物砷含量为19.86~36.45 mg·kg~(-1),平均值27.84 mg·kg~(-1),沉水植物区沉积物砷含量为13.05~32.32 mg·kg~(-1),平均值19.79 mg·kg~(-1);草海挺水植物区和沉水植物区三处取样点在沉积物-水界面的扩散通量分别为73.84μg·m~(-2)·d~(-1)和18.99、11.45μg·m~(-2)·d~(-1),均表现为沉积物孔隙水中的砷向上覆水释放,揭示沉积物可能是草海水体中砷重要的输入源。     

典型农业流域池塘甲烷浓度及扩散排放特征

为探究农业流域池塘水体CH4动态变化特征,以巢湖北岸典型农业流域——烔炀河流域为研究对象,选取4种不同景观池塘(排污塘、灌溉塘、养殖塘和自然塘),基于为期近1 a的逐月野外调查,探明农业流域不同景观池塘甲烷溶存浓度及其排放特征。结果表明：受人为活动干扰较低的自然塘CH4浓度[(0.41±0.29)μmol·L^-1]及其扩散排放通量[(0.54±0.49)mmol·m^-2·d^-1]相对较低,但农业活动以及生活污水排放等致使流域内养殖塘、排污塘和灌溉塘成为大气CH4的热点排放区域,其扩散排放通量分别是自然塘的6.0、3.0倍和2.2倍。不同景观池塘CH4排放均表现出明显的时间变化,但因受外源碳氮等生源要素累积以及人为活动干扰等影响,其CH4变化特征有所不同。统计分析表明该流域池塘CH4变化总体上受水温、溶解氧和污染负荷(有机质和营养盐等)等因素驱动。综上,烔炀河农村流域池塘水体是大气CH4的显著排放源,年均CH4溶存浓度和扩散排放通量分别为(1.30±0.78)μmol·L^-1和(1.64±1.50)m...     

油菜-水稻复种系统一次性施肥对CH_4和N_2O净排放的影响

【目的】探究一次性施肥技术对油菜-水稻复种系统CH_4和N_2O排放及其特征的影响并分析其影响因素,综合计算全球增温潜势,以期了解一次性施肥技术对温室气体排放的贡献大小,从而为温室气体减排提供科学依据和技术参考。【方法】针对长江中下游地区典型的油菜-水稻复种模式,在荆州太湖港农场(30.36N,112.08E)油菜-水稻复种试验田设置了5个处理:对照处理(CK)、农民习惯施肥处理(FP)、优化施肥处理(OPT)、一次性尿素基施处理(UA)和一次性控释肥基施处理(CRF),重复3次。采用静态暗箱-气相色谱法对整个油菜-水稻季的CH_4和N_2O排放通量进行监测,并测定土壤种植前后的理化性质与作物产量。【结果】(1)N_2O和CH_4的排放均具有明显的水稻季排放高、油菜季排放低的季节动态变化规律。各处理N_2O排放通量在油菜季的变化范围为-4.08—35.51μg N·m~(-2)·h~(-1),水稻季则为-16.52—193.30μg N·m~(-2)·h~(-1),年平均排放通量3.66—23.70μg N·m~(-2)·h~(-1);各处理CH_4的通量变化在油菜季的排放量为-0.08—0.05 mg C·m~(-2)·h~(-1),水稻季则为-0.54—4.81 mg C·m~(-2)·h~(-1),年平均排放通量0.42—0.66 mg C·m~(-2)·h~(-1);(2)N_2O年排放总量从高到低依次是FP、CRF、OPT、UA、CK,分别为1.31、1.19、1.04、0.82、0.37 kg N·hm~(-2),排放系数介于0.14%—0.25%,均低于IPCC的推荐值1%。两个一次性施肥处理的UA和CRF相比同等施氮量的OPT处理,均能有效减少CH_4年排放量29.0%和29.9%, UA处理同时能减少21.2%的N_2O年排放总量,而CRF处理却增加了14.8%的N_2O年排放总量;(3)在同等施氮量的条件下,一次性施肥CRF比OPT显著增加油菜产量10.6%,而对水稻产量的影响不显著。温室气体排放强度呈现油菜季低,而水稻季高的特征,油菜和水稻季中各处理差异均不显著,油菜季中CRF和UA的排放强度最低为0.038 kgCO_(2-eq)·kg~(-1),OPT最高为0.057kgCO_(2-eq)·kg~(-1),水稻季UA最小为0.07 kgCO_(2-eq)·kg~(-1),FP最高达到了0.13 kgCO_(2-eq)·kg~(-1);(4)综合两种气体的全球增温潜势(100 a),用GWP表示,在相同施氮量下,两个一次性施肥处理UA和CRF的GWP均较OPT处理减少了28.0%和18.2%(P0.05),一次性基施尿素对降低温室效应更有效。【结论】对于长江中下游典型农田而言,一次性基施普通尿素或一次性基施控释尿素的措施,可以在保持作物产量的同时,降低了农田温室气体排放,可作为水稻-油菜复种系统的一种环境友好型施肥推荐技术。     

岩溶湿地和稻田的土壤酶活性与CO_2和CH_4排放特征

【目的】探究土地利用变化对湿地土壤酶活性和温室气体排放之间关系的影响。【方法】以会仙岩溶湿地为研究样点,以湖泊湿地和其相邻的稻田为研究对象,采用比色法和静态暗箱法分别测定水稻整个生育期内主要土壤酶的活性及CO_2和CH_4的排放,并对二者之间的关系进行分析。【结果】稻田土壤的β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、蔗糖酶、几丁质酶、脲酶和碱性磷酸酶活性均高于湖泊湿地,高出幅度为11.8%—32.7%。稻田CO_2和CH_4排放通量分别为255.9—789.7和-0.41—1.74 mg·m-2·h~(-1),平均值分别为445.8和0.42 mg·m~(-2)·h~(-1),低于天然湖泊湿地。与湖泊湿地相比,稻田CO_2和CH_4排放总量分别降低了22.3%和83.3%,而增温潜势(GHGs,含N2O)降低了29.6%。相关性结果显示,CO_2排放通量与β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、蔗糖酶和几丁质酶活性呈显著负相关关系,CH_4排放通量与6种土壤酶活性显著负相关(P0.05)。【结论】在会仙岩溶湿地系统中,天然的湖泊湿地转变为稻田可显著提高土壤酶活性,同时降低CO_2和CH_4的排放量,有利于微生物碳利用率的提高和土壤碳的封存。     

施肥量对福州平原稻田CH_4和N_2O通量的影响

为阐明施肥量对福州平原稻田CH_4和N_2O排放的影响,以不施肥处理为对照(CK),采用静态箱—气相色谱法,分析了常规施肥和倍增施肥稻田CH_4和N_2O通量及其影响因子。结果表明,CK、常规施肥和倍增施肥处理下稻田CH_4累积排放量依次为7.67、9.23和10.69 g·m~(-2),平均通量依次为3.47、4.18和4.84 mg·m~(-2)·h~(-1),倍增施肥显著促进稻田CH_4排放(P0.05);稻田N_2O排放量依次为-0.03、-0.05和-0.06 mg·m~(-2),平均通量依次为-13.99、-22.77和-28.10μg·m~(-2)·h~(-1),施肥量对N_2O排放的影响不显著(P0.05)。电导率与稻田CH_4通量呈极显著正相关(P0.01);常规施肥电导率与稻田N_2O通量呈显著负相关(P0.05)。土壤p H、Eh、温度和含水率等环境因子与不同施肥处理下稻田CH_4和N_2O排放量相关性存在差异。CK、常规施肥和倍增施肥观测期内所产生的综合增温潜势分别为2 515.03、2 989.07和3 450.45 kg·hm~(-2),倍增施肥处理显著提高稻田温室气体综合增温潜势。     

中国兰花苞基因组DNA的提取及优化

采用改良CTAB法提取国兰花苞基因组DNA。优化部分如下:(1)在裂解细胞核前加入洗净液(0.4 mol·L~(-1)葡萄糖+3%可溶性PVP+10 mmol·L~(-1)β-巯基乙醇);(2)抽提时加入1/4体积的无水乙醇;(3)用等体积异丙醇沉淀DNA的同时加入1/2体积NaCl(5 mol·L~(-1))。结果表明,采用该法提取的DNA浓度介于216.5～245.8 ng·μL~(-1)之间,1.78D_(260 nm)/D_(280 nm)1.81,浓度和纯度均能满足常规分子生物学研究的需求。     

黄土台塬不同林型土壤主要温室气体通量特征

为研究纯林、混交林土壤二氧化碳(CO_2)、甲烷(CH_4)和氧化亚氮(N_2O)排放特征,有效评估不同林型组成所产生的温室气体差异。本文以黄土台塬7种典型纯林及其混交林为研究对象,采用静态箱-气相色谱法,比较各林型土壤CO_2、CH_4和N_2O的排放规律及其对环境因子的响应。结果表明:研究区各林型土壤均为CO_2、N_2O的排放源,CH_4的吸收汇。不同林型土壤温室气体排放差异显著,在土壤CO_2年均排放中,沙棘刺槐混交林最高(130.73 mg·m~(-2)·h~(-1)),油松最低(51.33 mg·m~(-2)·h~(-1));在土壤CH_4年均吸收中,油松最高(60.82μg·m~(-2)·h~(-1)),侧柏最低(36.67μg·m~(-2)·h~(-1));在土壤N_2O年均排放中,沙棘刺槐混交林最高(4.42μg·m~(-2)·h~(-1)),油松最低(-0.06μg·m~(-2)·h~(-1))。各林型土壤CO_2与土壤温度呈正相关,与土壤含水量呈负相关;侧柏和沙棘刺槐混交林土壤CH_4吸收与土壤温度呈正相关,随0～5 cm土壤含水量的增加呈先增加后减少的规律;刺槐和油松土壤N_2O与土壤温度为显著正相关,其他林型与土壤温度及含水量无明显相关性。研究表明:土壤温室气体排放与林型组成有关,受环境因子影响,各温室气体表现出不同的排放特征。     

不同添加剂对牛粪CO_2和CH_4排放的影响

【目的】针对禽畜粪便温室气体排放问题,通过添加改良剂等措施从而达到减少温室气体的排放。【方法】以牛粪和牛尿为原料,开展了为期30 d的室内模拟储存试验,监测了牛粪储存期间CO_2和CH_4排放的动态变化,研究了2%硫酸锌、1%氢氧化镁+4%磷酸、10%氯化钙和1%沸石对牛粪CO_2和CH_4排放的影响。【结果】单施粪尿处理CK(对照组)的CO_2排放通量最大峰值出现在第8天,为20.590μmol·m~(-2)·s~(-1),CH_4排放通量最大峰值出现在第24天,为0.735μmol·m~(-2)·s~(-1)。硫酸锌处理的CO_2排放高峰期延迟了22 d,氢氧化镁+磷酸、氯化钙和沸石处理的CO_2排放高峰期提前了2～3 d。对于CH_4的排放,硫酸锌和氯化钙处理的高峰期分别提前了15和17 d,氢氧化镁+磷酸组合处理的高峰期延迟了3 d,沸石处理的高峰期则与CK处理出现在同一天。相比于CK处理,氢氧化镁+磷酸组合处理的CH_4平均排放通量降低了22.9%,但CO_2平均排放通量增加了4.5%;硫酸锌、氯化钙和沸石处理的CH_4平均排放通量分别降低了28.0%、90.4%和5.1%,且CO_2平均排放通量分别降低了47.9%、83.1%和1.7%。【结论】由此可见,氢氧化镁+磷酸不宜作为添加剂应用于牛粪温室气体减排措施当中,而硫酸锌和沸石对牛粪CO_2和CH_4的减排效果不如氯化钙显著,因此氯化钙可作为一种优良的添加剂施加在牛粪中,以达到减少温室气体排放的目的。     

肌注氟苯尼考在鸭疫里氏杆菌感染鸭体内的药动学特征

【目的】研究并比较肌注氟苯尼考在2周龄健康和鸭疫里氏杆菌感染鸭体内的药代动力学特征。【方法】240只鸭随机分为2组,各120只鸭,其中一组用鸭疫里氏杆菌腿部感染,分别以30 mg·kg~(-1)体重单剂量肌内注射氟苯尼考,采血点为给药前和给药后5、10、15、20、30、45 min和1、1.5、2、4、8、10、14 h。采用高效液相色谱法(HPLC)测定血浆氟苯尼考的浓度,采用紫外检测器检测,检测波长为223 nm,流动相为乙腈和水,其体积比为26和74,流速为1 m L·min-1,色谱柱为Agilent C18(4.6 mm×150 mm,5μm),进样量为20μL。药动学分析软件Win Nonlin 5.2.1以非房室模型拟合处理血药浓度-时间数据,计算相关的药动学参数,并用统计学软件SPSS17.0对药动学参数进行t检验统计学分析。【结果】氟苯尼考在健康鸭体内的峰浓度(Cmax)为(22.88±3.11)μg·m L-1,表观分布容积(Vd/F)为(2.39±0.81)L·kg~(-1),体清除率(ClB/F)为(0.64±0.11)L·h-1·kg~(-1),消除半衰期(t1/2β)为(2.57±0.51)h和药时曲线下面积(AUC)为(47.28±7.87)μg·m L-1·h;氟苯尼考在感染鸭体内的峰浓度(Cmax)为(19.77±1.82)μg·m L-1,表观分布容积(Vd/F)为(2.44±0.46)L·kg~(-1),体清除率(ClB/F)为(0.63±0.08)L·h-1·kg~(-1),消除半衰期(t1/2β)为(2.74±0.54)h和药时曲线下面积(AUC)为(48.11±6.62)μg·m L-1·h。统计分析氟苯尼考在健康鸭和感染鸭的药动学参数,结果表明,除了Cmax差异显著(P0.05),其他参数差异均不显著(P0.05)。【结论】两者的主要药动学参数相比较,感染鸭体内的Cmax显著低于(P0.05)健康鸭体内的C_(max),其他参数无显著性差异。氟苯尼考以30 mg·kg~(-1)体重肌内注射在健康和感染鸭体内具有吸收迅速,峰浓度高,体内分布广泛,消除较快的特点。     

沼液施用对土壤温室气体排放的影响

采用静态箱-气相色谱法,于2010年7月（夏季）、2011年3月（冬季）进行了不同沼液施用量对土壤二氧化碳（CO2）,甲烷（CH4）和氧化亚氮（N2O）气体排放影响的研究。试验期间,沼液施用设为大量施沼液（夏季为28.36 gm-2,冬季为1.94 gm-2）,正常施沼液（夏季为9.45 gm-2,冬季为0.65 gm-2）和不施沼液等3个水平。结果表明:①夏季或冬季,处理对土壤二氧化碳排放影响均不显著。②夏季沼液施用8 h内,处理间对土壤甲烷排放具极显著差异（P＜0.001),其中大量施沼液时通量最大为3.98 mgm－2h－1;正常施沼液时通量最大为1.25 mgm－2h－1,8 h后处理间无显著差异（P＞0.05）。冬季在大量施沼液时,初期土壤甲烷排放通量明显高于正常施沼液及不施沼液,最大为0.28 mgm－2h－1;随后处理间土壤甲烷排放通量无显著差异。③夏季沼液施用20 h内,处理间对土壤氧化亚氮排放具极显著差异（P＜0.001）,最大值达1 641 gm－2h－1;处理间呈显著差异（P＜0.05）,大量施沼液、正常施沼液和不施沼液时土壤氧化亚氮排放通量分别为224～349,70～137,33～57 gm－2h－1;冬季则处理间土壤氧化亚氮排放无显著差异。图3参19     

NaCl浓度和pH对甘薯蛋白肽乳化特性的影响

【目的】明确不同NaCl浓度和pH对甘薯蛋白肽乳化特性的影响,为甘薯蛋白肽在食品工业中的应用提供理论依据。【方法】测定不同NaCl浓度（0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mol·L^-1）和不同pH（3、5、7和9）条件下,甘薯蛋白肽乳化液的显微结构、乳化颗粒平均粒径（d_4,3）、乳化活性、乳化稳定性、流变学性质和甘薯蛋白肽的表面疏水活性。【结果】与未添加NaCl的相比,添加浓度为0.2 mol·L^-1的NaCl时,甘薯蛋白肽乳化液的d_4,3由54.19 μm增大至59.70 μm;乳化活性指数由86.29 m²·g^-1显著降低为56.35 m²·g^-1（P＜0.05）;乳化稳定性指数由14.84 min降为13.19 min。然而,随着NaCl浓度的增大,甘薯蛋白肽乳化颗粒均一程度降低,d_4,3进一步由0.2 mol·L^-1时的59.70 μm增加至69.72 μm;而乳化活性由56.35 m²·g^-1逐渐降低至32.32 m²·g^-1,乳化稳定性呈先升高后降低的趋势,在0.4 m²·g^-1时达最大值,为15.55 min;初始表观黏度增大,并有剪切变稀现象发生;表面疏水活性降低。此外,随着pH增加,乳化颗粒均一程度升高,d_4,3由pH 3时的64.45 μm减小至pH 9时的51.21 μm;而乳化活性由pH 3时的3.99 m²·g^-1升高至pH 9时的120.47 m²·g^-1,乳化稳定性呈先降低后升高的变化趋势,pH 3时其最佳值为29.13 min;初始表观黏度降低,并有剪切变稀现象发生;表面疏水活性升高。【结论】甘薯蛋白肽的乳化特性与NaCl浓度和pH密切相关,添加≥0.2 mol·L^-1 NaCl降低了甘薯蛋白肽的乳化活性和稳定性,而增加pH可有效提高甘薯蛋白肽的乳化活性。     

铝胁迫诱导根系分泌异羟肟酸及其对玉米抵御铝毒害的作用

【目的】通过对铝诱导玉米根系分泌异羟肟酸的研究,为揭示玉米的耐铝机制提供理论依据。【方法】选用玉米品种郑单958和泰玉11号,采用水培方法,设置铝胁迫试验,测定它们在铝胁迫下根伸长量、根尖铝含量、根尖胼胝质含量、根系异羟肟酸的分泌量、异羟肟酸解铝毒的相关指标等,分析玉米的抗铝性、铝对根系分泌异羟肟酸的影响及异羟肟酸的解铝毒作用。【结果】与对照（不加铝）处理相比,10 μmol·L^-1铝（AlCl₃）处理后郑单品种幼根伸长显著受阻而根尖铝含量和根尖胼胝质积累量显著增加。根伸长量降低了47.77%,根尖铝含量和根尖胼胝质含量分别增加了226.64%和60.74%。相反,铝处理对泰玉品种幼根伸长、根尖胼胝质积累的影响不显著。虽然20 μmol·L^-1铝（AlCl₃）处理44 h后泰玉品种根系柠檬酸分泌量比对照（不加铝）处理显著增加了41.28%,但处理24 h内2个玉米品种根系柠檬酸分泌量与对照（不加铝）处理的差异不显著,即24 h内铝不能诱导玉米根系分泌柠檬酸。而铝处理24 h后,铝能诱导泰玉根系分泌异羟肟酸（丁布和门布）,且异羟肟酸的分泌量随着铝浓度（10、15和20 μmol·L^-1）的增加和处理时间（3、6、9、12和24 h）的延长而显著增加,但铝（10、15和20 μmol·L^-1）不能诱导郑单品种根系分泌异羟肟酸。与光照条件相比,在黑暗条件下20 μmol·L^-1铝（AlCl₃）诱导泰玉品种异羟肟酸的分泌量显著增加而根伸长也随之显著改善,丁布和门布的分泌量分别增加了40.81% 和72.02%,根伸长量增加了33.15%。与单独20 μmol·L^-1铝（AlCl₃）处理相比,铝溶液中添加丁布（3 mg·L^-1）和门布（3 mg·L^-1）后玉米初生根伸长量显著增加而根尖铝含量显著降低。添加丁布和门布后,郑单品种根伸长量分别增加了14.16%和13.85%,泰玉品种分别增加了16.16%和11.33%;郑单品种根尖铝含量分别降低了39.94%和43.54%,泰玉品种分别降低了39.92%和42.10%。另一方面,20 μmol·L^-1铝（AlCl₃）处理显著增加泰玉品种根和叶片中的异羟肟酸含量。然而,铝胁迫下郑单叶片中的异羟肟酸含量显著降低。【结论】玉米对铝的抗性与异羟肟酸的分泌有关,铝诱导玉米根系分泌异羟肟酸是玉米抵御铝毒害的一种有效机制,而植株叶片中的异羟肟酸含量可能与异羟肟酸的分泌有关。     

上庄河污染河水原位生物修复试验

采用渔网、浮水植物(李氏禾Leersia hexandr,粉绿狐尾藻Myriophyllum aquaticum)和生物漂带构建软隔离区,结合人工增氧对浙江省温州市上庄河经雨水管排放污水进行原位处理。结果表明:污水化学需氧量、氨氮、总氮和总磷分别为100.20~178.80,10.50~17.89,12.15~21.47和2.19~3.17 mg·L-1,处理后主体河段溶解氧、化学需氧量和总磷平均为5.50,34.3和0.29 mg·L-1,达GB 3838-2002《地表水环境质量标准》之Ⅴ类水标准;氨氮和总氮平均为3.41和4.43 mg·L-1。软隔离区内氮的去除主要为植物吸收氨氮,氨氮和总氮的平均去除率达70.26%和71.41%,曝气区好氧微生物的硝化作用使氨氮和总氮进一步下降20.51%和5.74%;总磷的去除主要通过软隔离区内植物的吸收作用和曝气区微生物的同化作用,原位修复处理后总磷平均降至0.29 mg·L-1,去除率达88.1%。     

捻转血矛线虫Hc-daf-22基因的原核表达及重组蛋白酶活性测定

【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是反刍动物主要的胃肠道线虫之一,该病在中国呈全国性流行。为研究捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)脂肪酸代谢相关蛋白DAF-22的生化特性,对其基因进行了克隆、原核表达,并对重组蛋白进行了体外酶活性测定。以期了解捻转血矛线虫Hc-DAF-22蛋白在过氧化物酶体脂肪酸β氧化中的作用。【方法】根据NCBI公布的H.contortus ZJ株daf-22 cDNA序列(Gen Bank:HQ738470.1)设计特异性引物,克隆Hc-daf-22基因并构建重组质粒pET-22b-Hc-daf-22,经测序鉴定正确后将其转化E.coli BL21,经终浓度为0.1 m mol·L~(-1) IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)诱导表达4h,离心菌液,50 mmol·L~(-1)浓度的PBS溶液重悬菌体溶液,冰浴超声破碎后上清沉淀分别进行SDS-PAGE分析。超声破碎后产物以镍柱亲和色谱法分离纯化重组蛋白Hc-DAF-22,并用SDS-PAGE检测蛋白纯化情况及以抗His血清作为一抗Western Blot鉴定。纯化后蛋白用超滤管浓缩除去盐分,并按照蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定。利用天然状态下的乙酰乙酰CoA(AcAc-CoA)分子会发生酮-烯醇互变形成烯醇化合物特性,酶活试验以乙酰乙酰辅酶a为底物建立标准曲线。硫解酶体外测活体系为(50 mmol·L~(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L~(-1) MgCl_2,60μmol·L~(-1)CoA,10μmol·L~(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白),通过记录反应过程中由于底物(AcAc-CoA)的减少而引起303 nm波长下的吸收值的变化,从而计算出硫解反应的初始反应速率,最终确定复性后的Hc-DAF-22的硫解酶活性。在相同条件下,取AcAc-CoA底物浓度为10μmol·L~(-1)的反应体系(50 mmol·L~(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L~(-1)MgCl_2,60μmol·L~(-1) CoA,10μmol·L~(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白于室温起始反应),分别调节反应体系的温度及pH梯度,确定Hc-DAF-22最佳酶活反应温度及pH条件。【结果】成功克隆Hc-daf-22基因,测序结果与NCBI已公布的H.contortus ZJ株Hc-daf-22基因序列比对基因相似度为99.9%,并实现重组子pET-22b-Hc-daf-22在E.coli BL21体内进行表达,表达产物经SDS-PAGE和Western Blot检测显示,pET-22b-Hc-daf-22基因在大肠杆菌中成功表达,呈部分可溶性,融合蛋白的分子量约为59 k D,测得蛋白浓度为1.70μg·μL~(-1);针对该表达产物的酶活分析结果表明,原核表达的Hc-DAF-22具有一定的硫解酶活性,其最适反应pH为8.0,最佳反应温度为37℃,酶学常数Km值和Vmax值分别为33.765μmol·L~(-1)和1 784 nmol·L~(-1)·min~(-1)。【结论】捻转血矛线虫DAF-22是过氧化物酶体脂肪酸β氧化的关键酶之一,本试验通过体外酶活试验成功测定Hc-DAF-22蛋白的酶活性,证明Hc-DAF-22具有一定硫解酶活性,但与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)同源蛋白相比硫解酶活性较低。     

三重PCR检测黄瓜靶斑病菌、炭疽病菌和细菌性角斑病菌

【目的】开发一种可同时检测黄瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)和黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)的三重PCR快速检测方法。【方法】根据ITS或16S r DNA序列分别设计黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌特异性检测引物;通过鉴定引物的特异性,筛选可在目标菌株中扩增出特异片段的特异引物;选择可以组合的3种病原菌特异性引物进行三重PCR,对引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数分别进行优化,优化三重PCR体系。【结果】针对黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌分别设计出5对、7对和6对特异性引物,其中引物CC4F/CC4R和CC5F/CC5R可特异扩增黄瓜靶斑病菌ITS,引物CL1F/CL1R、CL2F/CL2R、CL3F/CL3R、CL3F/CL4R、CL3F/CL5R、CL3F/CL6R和CL3F/CL7R可特异扩增黄瓜炭疽病菌ITS,引物PS3F/PS4R和PS4F/PS4R可特异扩增黄瓜细菌性角斑病菌16S rDNA。引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R扩增片段长度分别为370、275和698 bp,其混合扩增产物可在3%琼脂糖凝胶上得到充分分离,这3对引物选择作为三重PCR引物。在三重PCR反应体系中,当引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R的终浓度分别为0.16、0.4和0.16μmol·L~(-1)时,3个目的片段能同时得到有效扩增;当退火温度大于65℃时,部分目的片段不能有效扩增。最终建立并验证了适合上述3种黄瓜主要病原菌的三重PCR检测体系,即25μL PCR反应体系中含有12.5μL 2×Hiff~(TM) PCR Master Mix(With Dye)、0.16μmol·L~(-1) CC5F/CC5R、0.4μmol·L~(-1) CL3F/CL5R、0.16μmol·L~(-1) PS3F/PS4R。反应程序:95℃预变性3 min;95℃变性30 s,65℃退火30s,72℃延伸2 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。【结论】建立的三重PCR方法能够快速检测田间采集的黄瓜发病叶片中的黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌,灵敏度均可达到0.4 pg·μL~(-1)。     

两种方法测定绿盲蝽气味结合蛋白AlucOBP21配体结合特性的结果比较

【目的】比较荧光竞争结合试验(fluorescence competitive binding assay)和微量热涌动(microscale thermophoresis,MST)技术在研究绿盲蝽(Apolygus lucorum)气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)Aluc OBP21配体结合特性上的差异,探索一种新的测定昆虫OBPs结合功能的方法。【方法】提取绿盲蝽雌、雄成虫触角总RNA并进行反转录,获得绿盲蝽成虫触角c DNA。采用特异性克隆引物,以绿盲蝽成虫触角c DNA为模板进行PCR扩增,构建p ET32a/Aluc OBP21重组质粒。将重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,获得含表达标签的重组Aluc OBP21蛋白。通过高亲和Ni-NTA纯化介质对重组粗蛋白进行纯化,采用重组肠激酶切掉His-tag标签,最终获得无表达标签的重组Aluc OBP21蛋白。利用荧光竞争结合试验,以1-N-phenylnaphthylamine(1-NPN)为荧光探针研究重组Aluc OBP21蛋白与候选配体的结合特性,其中1-NPN和气味标样均溶解在质谱纯级的甲醇中。同时,利用MST技术解析重组Aluc OBP21蛋白与候选配体的结合特性,候选配体标样溶解在二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液中。候选配体化合物包括8种潜在的盲蝽性信息素及性信息素类似物、12种植物绿叶挥发物和绿盲蝽驱避剂主要组分二甲基二硫醚等。【结果】重组Aluc OBP21蛋白在上清液和包涵体均能够表达,最终选择上清组分进行目标蛋白纯化,利用重组肠激酶在22℃切除His-tag标签得到无标签的重组Aluc OBP21蛋白。荧光竞争结合试验结果显示,重组Aluc OBP21与荧光探针1-NPN的解离常数为(6.88±0.31)μmol·L~(-1),Aluc OBP21能够与β-紫罗兰酮和β-石竹烯结合,解离常数分别为(13.74±1.93)和(13.24±2.12)μmol·L~(-1),而其他候选配体均不能与重组Aluc OBP21有效结合。MST测试结果显示,Aluc OBP21可以与β-石竹烯、β-紫罗兰酮、β-蒎烯和柠檬烯有效结合,解离常数分别为(0.20±0.02)、(0.05±0.01)、(0.70±0.04)和(0.40±0.06)μmol·L~(-1)。其余候选配体化合物与Aluc OBP21的热涌动不能随配体浓度变化而表现有规律的变化,故这些气味化合物不能与Aluc OBP21发生结合作用。【结论】MST检测与荧光竞争结合试验相比,MST所得配体结合谱更广,不会遗漏一些结合力较弱的气味配体。     

应用锁式探针结合斑点杂交技术检测甜瓜细菌性叶斑病

【目的】甜瓜细菌性叶斑病是危害甜瓜的重要种传细菌病害,是由丁香假单胞杆菌流泪病致病变种甜瓜菌株(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)引起的。论文旨在建立高效、快捷、操作简单的检测技术以防止此病原菌传播。【方法】以Gen Bank公布的甜瓜细菌性叶斑病菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因序列为靶标,设计甜瓜细菌性叶斑病菌特异性锁式探针,建立锁式探针与斑点杂交技术结合的检测体系。以保存的目的菌株为材料,提取DNA作为模板进行锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应,并将锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应的反应温度和反应时间分别进行优化。利用优化的锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应分别对健康的甜瓜种子、带有甜瓜细菌性叶斑病的甜瓜种子、无菌水及25株其他参试菌株进行检测,测定该体系的特异性。将甜瓜细菌性叶斑病菌的DNA按10倍梯度稀释,依次稀释为1 ng·μL~(-1)、100 pg·μL~(-1)、10 pg·μL~(-1)、1 pg·μL~(-1)、100 fg·μL~(-1)、10 fg·μL~(-1)和1 fg·μL~(-1)作为模板,利用优化的锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应,测定灵敏度。将探针与斑点杂交技术结合建立高通量检测体系,将上述反应过程中的扩增产物固定于尼龙膜上,将锁式探针上Zipcode序列的反向互补序列合成c Zipcode(检测探针),检测探针(c Zipcode)用地高辛标记后与产物进行杂交。锁式探针结合斑点杂交技术分别进行特异性检测和灵敏度测定。探针与斑点杂交技术结合建立的高通量检测体系进行人工模拟种子带菌检测,进一步验证该体系的可靠性。利用建立的高通量检测方法对205份市售疑似带病的甜瓜种子进行检测。【结果】锁式探针特异性测定结果表明,26株甜瓜细菌性叶斑病菌均能得到一条105 bp的特异性条带,而剩余25株参试菌株及无菌水均无扩增产物产生。灵敏度测定结果表明,当目的菌株的浓度稀释为1 pg·μL~(-1)时均能检测到一条105 bp的特异性条带,所以探针的检测灵敏度为1 pg·μL~(-1)。探针与斑点杂交技术结合建立的检测甜瓜细菌性叶斑病菌高通量体系能将甜瓜细菌性叶斑病与所有的参试菌种区分开,26株甜瓜细菌性叶斑病菌杂交后出现了显色反应,而25株参试菌株及无菌水均没有发生显色。锁式探针结合斑点杂交的灵敏度检测同样达到1 pg·μL~(-1)。将锁式探针结合斑点杂交进行人工模拟种子带菌检测,能将1粒带菌种子从1 000粒健康的种子检测出来,模拟种子带菌检测率都能达到0.1%(1/1 000)。从205份市售甜瓜种子中成功检测到7份市售种子带菌。将带菌种子分别加入一定量的无菌水浸泡4 h,提取悬液DNA,将悬液DNA进行PCR扩增后测序,NCBI比对后确定为甜瓜细菌性叶斑病菌。【结论】基于锁式探针结合斑点杂交技术的检测体系能够快速、准确地识别甜瓜细菌性叶斑病。