病毒诱导的精氨琥珀酸合成酶基因沉默对棉花氮代谢的影响

以棉花为研究对象,利用转录后基因沉默技术(VIGS)将棉花精氨琥珀酸合成酶(GhASS1)基因沉默,研究沉默后植物的氨基酸、多胺、一氧化氮(NO)等含氮化合物的代谢变化。结果表明:盐胁迫可以诱导棉花精氨琥珀酸合成酶(GhASS1)瞬时上调表达,GhASS1沉默严重影响氨基酸的合成,除天门冬氨酰(Ans)外,其他蛋白质组成型氨基酸质量分数显著降低,NO质量摩尔浓度和多胺(PAs)质量分数下降,棉花植株生长发育迟缓。GhASS1沉默对棉花精氨酸脱羧酶基因(GhADC)、棉花鸟氨酸脱羧酶基因(GhODC)表现出强烈的抑制作用,进而影响植物多胺的代谢和耐盐能力。高浓度盐环境下,沉默体系精氨酸(Arg)和NO质量摩尔浓度上升,GhARG1表达上调。GhASS1沉默对于植物是致命的,GhASS1是尿素循环和氨基酸代谢的关键环节,GhASS1沉默使GhARG1、GhADC和GhODC表达下调,严重影响整个氨基酸代谢,NO质量摩尔浓度,腐胺(Put)和精胺(Spm)质量分数显著降低,N代谢受阻,植株发育不良,生长迟滞,棉花中存在Arg-NO通路。     

棉花S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及表达分析

利用i TRAQ技术从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)HM-40中筛选并克隆到S-腺苷甲硫氨酸合成酶Gh SAMS基因。Gh SAMS基因的开放阅读框全长为1 182 bp,编码393个氨基酸,预测Gh SAMS蛋白质含有15个磷酸化位点,推测其功能的行使可能与激酶磷酸化相关,进化分析表明S-腺苷甲硫氨酸合成酶与茶树(Camellia sinensis)的SAMS蛋白质相似性最高。q RT-PCR分析表明,在接种黄萎病菌VD07菌系后,Gh SAMS表达量逐渐增加,随着接种时间的延长,其相对表达量随之增加,推测其在陆地棉抗黄萎病防卫反应中可能起重要作用。在嫁接棉株中,利用VIGS技术成功地沉默Gh SAMS基因,然后对沉默棉株接种黄萎病菌VD07,鉴定其病情指数为62.5,抗性级别为感病;而转化空载体和未接种载体处理的嫁接棉株病情指数分别为30.0和31.2,抗性级别为耐病,表明Gh SAMS基因沉默后嫁接棉对黄萎病的抗性丧失。推测Gh SAMS基因在陆地棉抗黄萎病的过程中可能起重要作用。     

棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的克隆及表达分析

尿素循环中间产物在植物的生长发育、生物与非生物胁迫起着重要的作用,也与植物氮素利用密切相关。本文以参与尿素循环的酶为重点,介绍其结构和功能研究的进展,并分析了与尿素循环相关的代谢及产物的作用,为进一步研究尿素循环的功能、调控和利用提供参考。     

棉花GhSPS1的克隆及表达模式分析

【目的】克隆棉花蔗糖磷酸合成酶基因（sucrose-phosphate synthase,SPS）,并分析该基因在组织和纤维发育不同阶段及不同非生物胁迫下的表达模式。【方法】采用genome-walking及over-lap PCR方法,获得了棉花中一个蔗糖磷酸合成酶基因--GhSPS1,通过半定量PCR法检测GhSPS1在不同非生物胁迫条件下的表达模式,采用实时荧光定量PCR法对GhSPS1及GhSUS3、GhINV、GhCESA4进行组织和纤维发育特异性表达分析。【结果】克隆得到的GhSPS1全长4 545 bp,包含10个内含子、11个外显子,其开放读码框为3 108 bp,编码1 035个氨基酸,且该基因在ABA、低温处理条件下表达量增加,在高温胁迫下,表达量先升高后降低。实时荧光定量PCR结果显示,GhSPS1及GhSUS3在各种组织中都有表达,其中,在0 DAF、3 DAF的胚珠及18 DAF的纤维中表达量最高,而GhINV、GhCESA4则分别在3-15 DAF的纤维、18 DAF的纤维中表达量最高。【结论】克隆得到的GhSPS1属于SPSA基因家族,能参与ABA、低温、高温等非生物胁迫应答,且可能在纤维发育的起始期及次生壁增厚初期发挥作用。     

月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的克隆及表达分析

【目的】克隆月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的全长cDNA序列,分析其序列及表达特征,并对该基因编码的蛋白进行原核表达分析,为深入探讨丁香酚合成酶的生化特性奠定基础。【方法】根据已发表的其它植物EGS基因序列的保守结构域设计简并引物,结合RACE技术,获得RhEGS1的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用半定量RT-PCR对不同组织及不同花发育时期RhEGS1进行表达分析。采用Gateway克隆技术,构建原核表达载体,并进行原核蛋白表达。【结果】月季RhEGS1 的cDNA全长为1 207 bp,包含一个927 bp的ORF,编码309个氨基酸。同源序列比对发现RhEGS1与仙女扇的CbEGS2有83.87%的同源性,与矮牵牛PhEGS1具有81.55%同源性。表达谱分析表明,RhEGS1主要在雄蕊中表达, 且在花盛开期表达最强,而在花蕾期及凋谢期表达较弱。原核表达分析发现,在37℃、0.5 mmol•L-1 IPTG 诱导4 h 后,携带RhEGS1 ORF 的原核表达载体在大肠杆菌中生成了大量的分子量约为35 kD 的蛋白质,其分子量大小与预测的理论值相一致。【结论】从月季雄蕊中克隆到丁香酚合成酶基因RhEGS1,具有EGS基因的结构特征和完整的编码框,且在盛开期雄蕊中表达量最高。     

棉花油菜素类固醇合成酶基因GhDWF1的克隆和表达分析

 【目的】研究油菜素类固醇物质（BRs）在棉花纤维生长发育过程中的作用。【方法】通过棉花EST序列的筛选和整合，从陆地棉徐州142纤维中克隆了一个BRs合成酶基因GhDWF1。【结果】其cDNA序列全长1 849 bp，包含一个1 692 bp的开放阅读框，推导编码563个氨基酸，与水稻、玉米、豌豆、番茄和拟南芥的BRs合成酶DWARF1/DIMINUTO有较高的同源性，具有该类蛋白的典型结构。GhDWF1基因在开花当天的胚珠和纤维中表达最强，在根、幼茎和纤维发育的各个时期表达较高。与徐州142野生型相比，无绒无絮突变体胚珠中表达量较低。【结论】暗示GhDWF1基因的表达与棉花纤维的生长发育有密切关系。     

棉花烟酰胺合成酶基因GbNocotin及其启动子的克隆和功能分析

【目的】克隆棉花烟酰胺合成酶基因及其启动子,明确其表达特征,分析其在转基因育种中的应用前景。【方法】根据对一个棉花Maxxa BAC克隆（78L16）的测序结果,首先从海岛棉品种海7124中PCR扩增获得了棉花烟酰胺合成酶基因GbNocotin的启动子序列,并利用网上数据库PLACE对该序列进行调控元件的预测分析。其次构建该启动子与GUS 连接的重组载体pGbNocotin::GUS,并通过花浸染法转化拟南芥并获得转基因植株,分别在幼苗期和成熟期对转基因植株进行GUS染色分析。然后通过RT-PCR获得GbNocotin的开放阅读框（ORF）序列,并利用Mega5.0对GbNocotin进行进化树分析,最后利用实时荧光定量PCR（Real Time PCR）对该基因进行组织表达,诱导表达分析。【结果】GbNocotin的启动子区为1.8 kb,通过相似性比较预测发现该启动子含有1个专一性Fe缺乏诱导元件IRO2OS,还含有干旱、重金属、病原物等逆境响应元件以及植物激素响应元件等。对转化pGbNocotin::GUS拟南芥植株的GUS染色结果表明,在幼苗期GUS基因主要在根部以及下胚轴处表达,而在成熟期除了在根部表达外,还在果荚的基部、花序以及叶柄基部表达。GbNocotin的开放阅读框含有864个核苷酸,编码287个氨基酸,该蛋白等电点为6.76,分子量为 32.7 kD。虽然在第11-286位氨基酸处具有NAS保守结构域（PFAM accession number: PF03059）,但是与其他植物来源的该类基因相似性较低,与相似度最高的拟南芥的ATNAS3也仅有43%的相似性。GbNocotin的表达具有器官差异性,在根和茎中的表达最强,其次是棉纤维和花,但是在叶片及胚珠中表达量很低。另外,该基因在缺铁条件下表达量显著上升,在缺铁处理一周后棉花幼根中的表达量较对照增加9倍。而CuSO4、PEG、脱落酸（ABA）以及赤霉素（GA）处理均抑制其表达,但是抑制程度不同。尽管4种条件处理24 h后都会使GbNocotin的表达量显著降低,但是CuSO4和ABA的抑制效果最为显著。而48 h后,PEG和GA处理基因的表达量得到恢复,但是CuSO4和ABA处理表达量仍然较低。【结论】GbNocotin的表达具有器官差异性,并受铁缺失诱导以及胁迫条件抑制。该基因与棉花Fe的吸收可能密切相关,有潜在的应用价值。     

棉花P-typeATPases基因的克隆及表达分析

为了探明棉花P-type ATPases基因在植物不同组织和多种逆境条件下的表达情况,利用棉花黄萎病菌的P-type ATPases蛋白序列,在GenBank中搜索棉花EST序列,得到2个同源的棉花EST片段,结合RACE和Genome walking获得了这个基因的完整读码框序列,其开放阅读框长度为3570bp,编码1190个氨基酸,与毛果杨、蓖麻的同源性达86％左右,将其命名为Gbpatp.洋葱表皮亚细胞定位观察结果显示,Gbpatp编码的蛋白分布在细胞膜上.RT-PCR技术检测组织表达特异性分析表明,P-type ATPases在茎和棉絮中的表达量较高,在种子中低水平表达,在叶片和花蕾中表达量极低,说明Gbpatp可能与棉花较成熟的器官茎、棉絮和种子的生长发育密切相关.在逆境胁迫中发现,干旱处理后Gbpatp的表达强烈,并且随处理时间延长表达量逐渐增加；重金属Cu2+处理24h后Gbpatp表达量升高,但48h急剧下降；Gbpatp在低温处理下也有轻微表达.激素诱导后发现,Gbpatp对赤霉素和脱落酸均有响应,随胁迫时间延长其表达量仍能维持在一定水平.     

紫山药黄酮醇合成酶DaFLS1基因的克隆和表达分析

为了解黄酮醇在紫山药中的合成特点,利用3'-和5'-RACE技术从紫山药中分离到黄酮醇合成酶Da FLS1基因编码序列(Gen Bank登录号:KJ022640)。Da FLS1基因编码序列全长为1 113 bp,其开放阅读框长度为1 005 bp,编码334个氨基酸。Da FLS1蛋白质属于水溶性胞质不稳定蛋白质,无跨膜区和信号肽结构。保守区域分析结果显示,Da FLS1蛋白质属于α-酮戊二酸和二价铁离子依赖型的加氧酶家族[2OG-Fe(II)Oxygenase superfamily];Da FLS1氨基酸序列与水仙(AFS63900)同源性最近(75%),其次是洋葱(AAT68476,74%),与金鱼草(ABB53382)的同源性仅为66%。系统进化分析结果显示,紫山药与其他作物亲缘关系较远。Da FLS1在紫山药幼嫩叶片中表达水平最高,并且在紫山药幼叶中的表达有2个高峰期,而在其他组织中的表达量极低或不表达,即Da FLS1在紫山药中的表达情况符合黄酮醇合成酶基因(FLS)的特征。上述结果说明,得到的基因为紫山药黄酮醇合成酶基因Da FLS1,具有FLS基因的生物信息学特征和表达特征。     

苎麻木质素合成酶CAD基因的cDNA克隆及表达分析

采用PCR结合RACE技术克隆苎麻栽培种湘苎3号CAD基因全长cDNA序列;再运用qRT–PCR技术对木质素含量不同的代表性苎麻品种湘苎1号、湘苎3号、湘潭大叶白和城步青麻的CAD基因在其茎秆韧皮部和木质部的表达进行定量分析;使用1%间苯三酚和25%盐酸对4种苎麻茎横切片进行特异染色,观察品种间木质素染色度。结果表明,获得的苎麻CAD基因cDNA序列全长为1 378 bp(GenBank登录号,KF758396),编码359个氨基酸,推导为苎麻肉桂醇脱氢酶(BnCAD)。该推导蛋白质与已报道的几种植物木质素合成酶CAD的同源性均达90%以上,其中与蒺藜苜蓿的同源性达97%。运用qRT–PCR方法对BnCAD基因表达的定量分析结果显示,苎麻CAD基因在湘苎1号和湘苎3号的韧皮部表达水平明显高于其在木质部的表达水平,而在城步青麻木质部的表达水平高于其在韧皮部的表达水平,该基因在湘潭大叶白的韧皮部和木质部表达量接近。4种苎麻茎横切片的木质素染色结果表明,品种间木质素染色度与CAD基因在其韧皮部的表达量成正相关。     

陆地棉LTP家族基因的克隆与表达分析

长链脂肪酸能够通过调节胚珠内源乙烯信号变化来促进棉花的起始和伸长发育,为深入了解棉花脂肪酸的转运过程及参与基因,对棉花全基因组进行了分析,克隆了11个脂质转运蛋白。实时荧光定量PCR证实:LTP6, LTP7, LTP9, LTP11 4个基因在纤维起始时期（野生型与突变体之间）的表达存在差异,这4个基因可能与纤维起始发育有关。通过基因组步移技术克隆了Gh-LTP6基因的启动子,并对其结构进行分析,发现其具有多个MYB结合位点。这些结果为深入研究LTP基因在纤维起始过程中的角色奠定了基础。     

陆地棉PHYB基因生物信息学分析

[目的]对陆地棉PHYB基因有一个全面的认识和生物信息学分析.[方法]在陆地棉异源四倍体标准系TM-1基因组数据库中共鉴定获得2个PHYB基因,这2个基因分别分布在A10和D10亚基因组.利用生物信息学方法对这两个基因进行初步分析.[结果]棉花的PHYB具有其他植物PHYB相同的基序和结构域,不管是数目还是分部位置都比较一致;不同植物的PHYB氨基酸序列同源性比对及构建的进化树都显示棉花的PHYB同可可的在同源性和进化关系上都是最高的,同水稻、玉米等单子叶植物的同源性及进化关系较低;基因结构的比对结果同样显示植物PHYB基因在进化上比较保守;棉花PHYB存在几十个可能磷酸化的位点,这些位点的磷酸化作用可能影响光敏色素的功能及其介导的信号通路.[结论]该研究结果为陆地棉PHYB基因的克隆和功能研究提供了理论基础.     

小麦逆境胁迫相关基因TaC2DP1的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,并对其序列特征、进化关系和表达特性进行分析,探讨该基因在小麦抗逆调控过程中的生物学功能,为进一步解析植物的抗逆机制提供候选基因和理论依据。【方法】以cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列为探针,对小麦EST数据库进行搜索,筛选与探针同源性在97％以上的EST序列,通过电子克隆结合RT-PCR获得该基因cDNA全长,采用生物信息学软件分析比较克隆基因的保守结构域及序列特征;采用MEGA6.0软件构建该基因的系统进化树;将测序正确的该基因片段通过EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pMAL-c2X,重组质粒转化大肠杆菌BL21,经终浓度为0.3 mmol·L^-1 IPTG诱导1-5 h后,用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析该基因在小麦不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高温和ABA处理下的表达模式。【结果】成功获得小麦cDNA全长序列,命名为TaC2DP1。该基因序列全长为1 356 bp,包含一个1 209 bp的开放阅读框（ORF）,5′端非编码区50 bp,3′端非编码区97 bp,编码402个氨基酸,推导编码蛋白质的预测分子量为43.41 kD,等电点为4.30,属于酸性蛋白,BLAST分析表明,该蛋白含有一个与钙离子结合的结构域,称为C2结构域（C2-domain）。多序列比对及进化树分析表明,TaC2DP1与乌拉尔图小麦TuC2亲缘关系最近,二者具有高度的同源性,其编码的氨基酸一致性达到91%;蛋白质结构预测分析显示TaC2DP1无跨膜螺旋和双硫键,亚细胞定位于细胞质中;成功构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-TaC2DP1,在IPTG诱导下得到90 kD左右的蛋白,与理论值一致。通过实时荧光定量PCR进行TaC2DP1表达分析,显示该基因在小麦的根、茎、叶、幼穗、未成熟籽粒、胚及胚乳中均有表达,其中在幼穗中表达量最高,在花后5 d籽粒中表达量最低。TaC2DP1可被植物激素ABA诱导而上调表达;干旱胁迫过程中,TaC2DP1受胁迫诱导呈稳定上调表达趋势;高温和低温胁迫过程中,TaC2DP1均在胁迫后的0.5 h迅速诱导上调表达,分别为对照的21和17倍。推测该基因可能参与小麦ABA 信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦TaC2DP1的全长序列,其编码蛋白含有与钙离子结合的C2结构域;在低温、干旱、高温和ABA逆境胁迫下,TaC2DP1属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络,可能在干旱、低温和热胁迫中发挥重要作用。     

转AlHAK1基因棉花耐盐能力分析

为了获得超表达獐茅Al HAK1基因棉花纯合系并验证其耐盐能力,对转Al HAK1基因T3代材料进行了PCR与RT-PCR鉴定,并在水培条件下研究了纯合系植株长势、根系形态参数、离子含量和相关抗氧化酶活性变化。结果表明在盐胁迫条件下,转基因植株偏高,较野生型增加了16.5%,同时转基因植株根系形态参数总根长、比根长和根表面积分别增加了62.23%、40.02%和29.22%,而根的平均直径降低了22.22%,均达到了差异显著水平(P0.05)。此外,在盐胁迫条件下,转基因幼苗能维持根和叶中较高的K+含量,较低的Na+含量和较高的K+/Na+,其超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化酶(POD)活性均比野生型植株有所提高。该结果进一步表明供试外源Al HAK1基因在棉花中超表达,提高了转基因棉花耐盐能力,为培育适应盐渍化土壤环境下生长的棉花新品种提供重要的种质资源。     

陆地棉钾吸收相关基因GhHAK1的克隆与功能分析

棉花是一种典型的喜钾经济作物,其产量和品质形成与钾含量密切相关。克隆获得棉花高亲和性钾转运体基因GhHAK1框,系统进化树表明该GhHAK1基因属于第Ⅰ亚族,此分支被认为介导高亲和性K+。膜结构预测显示该基因编码的蛋白跨膜螺旋区域(TMS)有12个,且在第2和第3 TMS之间有一个较长的胞质质环。洋葱表皮亚细胞定位表明,该基因编码蛋白定位在细胞质膜上;继而对部分转GhHAK1基因拟南芥纯合系进行K+营养试验,发现在低钾(0.05 mmol/L)条件下,野生型拟南芥表现明显的缺钾症状,叶片黄化,植株抽薹明显受抑制,而转基因材料则表现植株叶片生长正常,抽薹未受影响,同时转基因拟南芥叶片中K+含量约为野生型拟南芥的2倍左右,根中K+含量约为1.5倍左右。该结果初步表明GhHAK1基因具有介导植株钾高效吸收的功能,为进一步培育适应土壤钾素匮乏及盐渍化环境下生长的棉花新品种提供重要的基因资源。     

棉花脱水素GhDHN1的克隆及其表达

【目的】通过对棉花脱水素基因结构特征及其在低温胁迫下表达模式进行分析,探讨脱水素在棉花响应低温过程中的功能,为棉花抗冷育种提供理论基础。【方法】以棉花抗冷品种豫2067为试验材料,根据棉花陆地棉基因组序列查找已知脱水素（dehydrin,Dhn）基因的CDS序列,利用Primer5软件设计引物,克隆该基因,并命名为GhDHN1;采用生物信息学方法分析其蛋白质性质、氨基酸含量特征、功能结构域、系统进化树;选择XbaⅠ和SmaⅠ酶切位点对植物表达载体pBI121::GFP进行双酶切,采用In-Fusion连接技术构建融合蛋白瞬时表达载体pBI121-GhDHN1::GFP;分析其在洋葱表皮细胞中的瞬时表达,进行亚细胞定位;利用抗冷材料豫2067在三叶期对低温处理（4℃,24 h）前后的叶片和根系进行转录组测序,筛选差异表达基因;在三叶期时分别对豫2067（抗冷品种）和衡棉3号（冷敏感品种）进行低温（4℃,24 h）处理,利用实时荧光定量方法分别比较根、茎、叶中GhDHN1表达量,对该基因在2个抗冷差异材料叶中的表达量进行比较;对豫2067进行不同时间低温（4℃）处理,分析GhDHN1在叶片和根中的动态表达模式。【结果】该基因全长为726 bp,开放阅读编码框为636 bp,编码211个氨基酸,预测分子量为23.79 kD,等电点为5.04,富含谷氨酸（26.10%）和赖氨酸（19.40%）,不含色氨酸,半衰期为30 h,蛋白呈酸性,带负带荷,带负电荷的残基总数为60%;GhDHN1的二级结构α螺旋（Alpha helix）包含116个氨基酸残基,占54.98%,组成该蛋白的主体结构,无规则卷曲（Random coil）的氨基酸残基有87个;GhDHN1位于陆地棉D亚组第9染色体（Dt_chr9）上,在cDNA的259-348位置上含有一个长度为90 bp的内含子,2个外显子长度分别为258和378 bp;SMART和CDD分析表明该氨基酸序列含有2个保守的富含赖氨酸的K片段和1个保守的富含丝氨酸S片段,具有亲水素蛋白结构域pfam00257,表明该蛋白为K2S型脱水素;系统进化树分析表明,陆地棉亲水素GhDHN1与可可亲缘关系最近;洋葱表皮细胞中瞬时表达分析表明,GhDHN1蛋白主要定位在细胞膜附近。转录组分析表明,该基因在棉花三叶期叶片和根中,受低温处理后上调表达;荧光定量PCR分析表明,GhDHN1在4℃低温胁迫24 h后,在叶片、茎、根中均上调表达,在叶中上调表达倍数最大,在低温处理4 h和24 h时叶片中有2个表达高峰,在低温处理6 h和12 h时在根中有2个表达高峰,在抗冷材料叶片中的表达是冷敏感材料的2.47倍,说明该基因可能参与了棉花对低温的适应性调控。【结论】陆地棉GhDHN1属于典型的K2S型脱水素,与可可亲缘关系最近。该基因响应低温胁迫,在抗冷材料和冷敏感材料中表达差异显著,其表达量与棉花的抗冷性呈正相关,可以作为筛选不同抗冷材料的标记,同时可以作为重要的候选基因来培育棉花抗冷新材料。     

海岛棉GbCO基因的克隆和表达分析

[目的]海岛棉GbCO基因的克隆和表达分析.[方法]利用RT-PCR技术,从海岛棉中克隆CONSTANS(CO)的同源基因,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析基因的组织表达.[结果]从新海14号花后9d的纤维中克隆得到了一个棉花CO蛋白基因,命名为GbCO.GbCO cDNA的ORF为1 008 bp,编码335个氨基酸.序列分析表明GbCO和GhCO的相似性只有78.2;,棉花CO蛋白同蓖麻RcCO、苹果MaCO等亲缘关系较为接近.qRT-PCR结果表明,GbCO基因在棉花的根、茎、叶、花瓣等组织中均有表达,但在叶片中的表达相对较高.并且CbCO在棉花胚珠及纤维发育的起始和伸长阶段都有表达,在开花前1d和开花后5d的胚珠中表达量很高.GbCO基因的表达受到光周期的调节,在夜间表达量高于白天.[结论]GbCO基因可能在陆地棉的开花发育中起着重要的作用.     

油用牡丹脂肪酸脱氢酶基因FAD3的克隆与表达分析

【目的】ω-3脂肪酸脱氢酶(ω-3 FAD)为植物脂肪酸生物合成途径中的关键酶,通过对油用牡丹‘凤丹’ω-3 FAD基因结构特征及其在不同组织中的表达模式进行分析,为研究FAD3在油用牡丹‘凤丹’脂肪酸形成过程中的调控提供理论基础。【方法】采用RACE和RT-PCR的方法克隆油用牡丹‘凤丹’ω-3 FAD基因,用Vector NTI Advance 11软件进行序列分析,BLAST进行同源性比较,并用MEGA7.0的邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统进化树,利用在线蛋白质分析工具Ex PASy预测FAD3蛋白的基本参数和特性,利用Phyre2预测蛋白质二级和三级结构,并通过实时荧光定量PCR检测该基因在油用牡丹‘凤丹’不同发育期的种子以及不同组织中的特异性表达情况。【结果】获得油用牡丹‘凤丹’脂肪酸脱氢酶FAD3,命名为FAD3(Gen Bank登录号:KX906966)。序列分析表明该基因c DNA序列全长1 723 bp,其中,开放阅读框1 308 bp,编码435个氨基酸,3′端非编码区长287 bp,5′末端非编码区长99 bp,预测成熟蛋白分子量为49.9 k D,理论等电点(p I)为7.42,N端无信号肽,脂肪系数为83.08,不稳定指数35.67,总水平亲水性为-0.222。经FAD3蛋白的二级结构预测,FAD3以α-螺旋、随机卷曲为主,其次是延伸链、β-转角含量较少;多序列比对结果表明,油用牡丹FAD3氨基酸序列含有2个保守结构域,系统发育分析结果显示‘凤丹’与芍药处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和Target P亚细胞定位分析得知,FAD3蛋白有3个跨膜区域,可能定位于内质网中发挥功能。组织特异性结果分析表明,FAD3在‘凤丹’的根、茎、叶、花瓣、雌蕊、雄蕊、种子中均有表达,其中,在叶中表达量最高,雌蕊次之,在雄蕊中表达量最低;不同时期种子中,10 d表达量最高,20 d次之,在60 d中表达量最低。【结论】成功从油用牡丹‘凤丹’中克隆获得FAD3全长c DNA序列,其在‘凤丹’不同组织中呈现出多种表达模式。