不同颜色刺葡萄花色苷合成相关基因的表达分析

【目的】探索不同果皮颜色中国野生刺葡萄(Vitis davidii)花色苷合成相关基因的表达差异,为中国野生刺葡萄资源的利用奠定基础。【方法】以白色及黑色果实的中国野生刺葡萄、欧亚种葡萄‘白比诺’及‘黑比诺’为材料,利用HPLC-ESI-MS/MS分析不同发育期果皮中花色苷的组成及其含量,通过序列检测分析几种刺葡萄Vvmy-bA1基因序列的不同,用实时荧光定量PCR检测花色苷合成相关结构基因表达的差异。【结果】锦葵色素葡萄糖苷(Malvidin 3-O-glucoside)仅在黑色果实转色后被检测到,其在中国野生刺葡萄黑色果实和‘黑比诺’中的含量分别为0.12～7.14mg/kg与4.90～180.79mg/kg,其他花色苷如矢车菊素3,5-O-双葡萄糖苷(Cyanidin 3-O-glucoside-5-O-glucosid)、飞燕草素3-O-葡萄糖苷(Delphinidin 3-O-glucoside)、花葵素3-O-葡萄糖苷(Pelargonidin 3-O-glucoside)、矮牵牛色素3-O-葡萄糖苷(Petunidin 3-O-glucosid)等在黑、白色葡萄果实不同发育期均能检测到,其含量为0.01～49.28mg/kg。VvmybA1a等位基因在中国野生刺葡萄黑、白色果实中都存在,且序列与欧亚种一致;VvmybA1c等位基因只在中国野生刺葡萄黑色果实中可检测到,与欧亚种相比其序列有33bp的插入片段和47bp的缺失片段。My-bA1基因只在黑色果实成熟期表达;合成花色苷的关键结构基因UFGT在供试葡萄各个时期均有表达,但其表达量在黑色果实成熟期显著高于白色果实;F3′5′H、GST及OMT等结构基因也在黑色果实成熟期表达上调,而其他结构基因的表达则在中国野生刺葡萄和欧亚种之间表现出了较大差异。【结论】中国野生刺葡萄花色苷合成相关基因具有特殊结构,与欧亚种葡萄相比有明显差异。     

甘蔗光合系统Ⅰ psaD基因的克隆和表达分析

采用RACE-PCR方法,以甘蔗心叶为材料克隆了甘蔗PSⅠ反应中心亚基Ⅱ基因全长,命名为SopsaD,GenBank登录号JX866950。该基因cDNA序列全长为904bp,编码200个氨基酸多肽,预测其分子质量和等电点分别为21.85ku和10.5,其中N端的1~44aa是叶绿体转运肽序列,62~199aa是保守的Pfam:PasD结构域。SopsaD与玉米(EU953246)、水稻(AY224449)、大麦(M98254)和短柄草(XM003564060)psaD基因核苷酸同源性分别为85%、85%、84%和81%,氨基酸序列的同源性分别为92%、88%、87%和85%。荧光定量PCR表明甘蔗在叶、花序、芽、茎和根中都能检测到SopsaD基因表达,其中在叶中表达量最高,其次是花序中,而在根中的表达量最低。甘蔗在工艺成熟期和生理成熟期SopsaD基因整体上表现为功能叶中基因表达量高,而老叶中基因表达量低,证实该基因参与光合作用反应。     

草莓转录因子基因FaGAMYB的克隆与表达分析

为研究FaGAMYB基因在草莓成花诱导和花发育中的作用,以‘卡姆罗莎’草莓(Fragaria×ananassa Duch.‘Camarosa’)为试材,采用同源克隆和RT-PCR技术分离了一个赤霉素信号途径中的MYB转录因子基因FaGAMYB。该基因开放阅读框为1 689bp,编码562个氨基酸。序列分析发现FaGAMYB蛋白含有高度保守的R2R3DNA结合域,以及GAMYB基因家族所特有的Box1,Box2和Box3保守区域。亚细胞定位研究发现FaGAMYB蛋白定位于洋葱表皮细胞的细胞核。FaGAMYB基因具有组成型表达特性,但在雄蕊、花芽、茎尖生长点和果实等生殖生长组织与器官的表达丰度较高。在草莓成花诱导期,茎尖中FaGAMYB基因表达上调,当进入雄蕊原基分化期后,该基因表达量迅速升高。上述结果表明FaGAMYB可能在草莓成花诱导和雄蕊发育中发挥重要作用。     

黄瓜耐镉相关基因CsNAC019的克隆及表达分析

【目的】研究黄瓜耐镉(Cd)分子机制,结合生物信息学分析获得一个NAC转录因子家族基因CsNAC019,对其进行克隆和表达分析,为进一步将该基因用于黄瓜耐Cd品种的改良与选育提供试验基础。【方法】通过PCR技术扩增CsNAC019全长;利用NCBI和DNAMAN进行序列比对和保守结构域分析;利用Expasy、TMHMM等在线软件进行氨基酸组成、稳定系数、亲水系数分析;通过Plant CARE在线工具进行启动子序列分析;采用MEGA 6.0软件根据NJ方法,构建系统进化树;采用q RT-PCR技术检测Cd胁迫后黄瓜CsNAC019在叶中的表达情况,并用DPS 7.05数据处理系统软件进行方差及显著性分析。【结果】CsNAC019含有典型的NAC保守结构域。通过BLAST分析比对,该基因在氨基酸序列上与拟南芥NAC019存在60%的同源性,两者在从N端到C端有A、B、C、D、E 5个氨基酸相对保守区的序列高度一致。该基因CDS序列全长为960 bp,编码319个氨基酸,编码蛋白质分子量为35.66 k D,理论等电点为8.72,不稳定系数为68.18,平均亲水系数为-0.483。启动子分析表明,除含有真核生物启动子固有的TATA和CAAT元件外,CsNAC019的启动子序列还存在G-box、ABRE、W-box、P-box、TCA-element、TC-richrepeats、HSE等多种响应逆境胁迫的顺式元件。系统进化分析表明,CsNAC019与甜瓜、桃、苹果、柑桔、葡萄、大豆等15种植物NAC转录因子有64%—96%的同源性,其中与甜瓜的NAC蛋白同源性最高,为96%。通过q RT-PCR分析发现,与对照相比,CsNAC019在Cd胁迫条件下表达量明显上调(8.2倍)。【结论】CsNAC019为黄瓜Cd胁迫诱导表达基因,推测其可能通过调节下游基因的表达调控黄瓜对Cd胁迫的应答。     

两个红梨品种花色苷合成相关基因及转录因子MYB10表达模式分析

为研究不同红色梨品种着色差异的原因,以西洋梨品种红星和砂梨品种满天红为试材,通过荧光定量PCR方法,分析果皮中花色苷合成基因PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、F3GT和转录因子MYB10基因在果实不同发育期的转录特性。结果表明,在红星中除PAL外,花色苷合成基因表达量与果皮花色苷含量变化一致,先升高后降低;在满天红中,PAL和F3GT在果实转色期表达量最高,其他基因表达量随果实发育而下降。转录因子MYB10在红星整个果实发育期表达水平都很低,在满天红转色期呈现峰值,且表达量是红星的50倍以上。红星着色程度可能由多个基因协同作用,而满天红着色可能受关键基因F3GT的影响,MYB10可能通过调控F3GT的表达从而调控满天红的着色。     

超表达苹果细胞分裂素响应基因MdCRF6影响花青苷积累和盐胁迫抗性

【目的】克隆苹果细胞分裂素响应因子基因Md CRF6(cytokinin response factor 6),鉴定其在调节花青苷积累和盐胁迫抗性中的作用,揭示Md CRF6的功能,为研究细胞分裂素信号途径和果树生长发育调控提供理论依据。【方法】以‘嘎啦’苹果(Malus domestica‘Gala’)为研究材料,利用同源序列比对和PCR技术,分离细胞分裂素响应基因Md CRF6。使用MEGA 5.0软件构建苹果Md CRF6与拟南芥CRFs间系统进化树;通过SMART软件和DNAMAN软件分析Md CRF6蛋白的保守结构域。利用实时荧光定量PCR方法检测该基因对细胞分裂素和盐胁迫的响应。通过电泳迁移率试验(EMSA),验证Md CRF6原核表达蛋白对DRE作用元件的绑定。构建Md CRF6植物超表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化获得转Md CRF6苹果愈伤组织。比较野生型和转基因苹果愈伤组织在花青苷积累和盐抗性方面的差异,结合基因表达分析,初步鉴定Md CRF6在调节花青苷积累和盐胁迫方面的生物学功能。【结果】分离得到了苹果细胞分裂素响应因子基因Md CRF6(基因序列号:MDP0000783818),该基因开放阅读框(ORF)为1 047 bp,编码含有348个氨基酸的蛋白。进化树分析和氨基酸序列比对结果表明,苹果Md CRF6蛋白在N端包含保守的CRF结构域,在C端包含保守的AP2/ERF结构域,并且与拟南芥At CRF6同源性最高。基因表达分析显示该基因具有细胞分裂素和盐胁迫响应,分别在10μmol·L-1 BA和100 mmol·L-1 Na Cl处理3 h和6 h时表达量最高。EMSA试验结果验证Md CRF6原核表达蛋白能够绑定DRE序列。在苹果愈伤组织中超表达Md CRF6,发现Md CRF6转基因苹果愈伤组织花青苷积累受到抑制,同时苹果愈伤组织的抗盐性降低。基因表达分析显示,Md CRF6显著抑制花青苷合成基因和盐响应相关基因的表达。【结论】苹果Md CRF6与拟南芥At CRF6具有高度的同源性,其参与植物对细胞分裂素和盐胁迫的响应。在苹果愈伤组织中超量表达Md CRF6抑制其花青苷积累,降低植物抗盐性。推测苹果Md CRF6可能通过结合花青苷合成基因以及抗盐相关基因的启动子,抑制基因的表达,从而负调节花青苷积累和抗盐性。     

番茄抗性相关基因SlHin1的克隆、表达与抗病毒功能

【目的】克隆番茄抗性相关基因Sl Hin1(harpin-induced gene 1),分析其生物信息学特征、组织表达和亚细胞定位情况,研究其在抗烟草花叶病毒侵染、移动中的作用,为番茄抗性育种提供理论依据。【方法】通过RT-PCR及基因克隆方法,从番茄总RNA中克隆得到基因SlHin1;应用生物信息学方法分析其DNA序列及其编码的蛋白序列特性,使用MEGA6.0对SlHIN1氨基酸序列及其同源序列进行多序列比对,并构建同源物种间系统进化树;将该基因片段通过Sal Ⅰ和Bam HI双酶切连接至荧光表达载体pCV-m GFP-C1,采用GFP标记的方法进行亚细胞定位检测,分析编码蛋白表达位置;利用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)分析该基因在番茄不同组织的表达量水平;将该基因片段通过Nco Ⅰ和Bam HI通过双酶切连接至植物表达载体pFGC5941,用土壤农杆菌EHA105瞬时过表达该基因并接种标记有绿色荧光的烟草花叶病毒侵染性克隆,以检测植株对病毒的抗性变化,间接ELISA法检测病毒的含量,探究该基因的抗病毒功能。Western blot验证SlHIN1蛋白在本氏烟内的表达情况。【结果】利用RT-PCR方法从番茄材料(Solanum lycopersicon cv.Ailsa Craig)的叶片组织中克隆得到全长为675 bp的番茄抗性相关基因Sl Hin1,将序列分别提交至Gen Bank,得到序列号KU195820。序列比对及生物信息学分析表明,其基因预测编码225个氨基酸,分子量为26.1 k D,理论等电点为9.35,结构上具有LEA-14保守结构域,不具有跨膜区段,并且位于番茄基因组10号染色体上(Solyc10g081980);多序列比对及进化树分析表明,该基因编码的蛋白与茄科植物HIN1氨基酸同源性80.0%以上而与水稻、高粱单子叶植物的亲缘关系较远;亚细胞定位显示定位在细胞膜上与PSORT Prediction预测的亚细胞定位最高概率一致;qRT-PCR结果分析表明该基因具有组织特异性,表达量在根、叶、茎间依次降低;在本氏烟中瞬时过表达SlHIN1并在表达部位接种标记有绿色荧光的烟草花叶病毒侵染性克隆,处理组本氏烟在接种病毒4 d后没有任何荧光出现,而对照组出现绿色荧光。随着接种时间推移,接种7 d后处理组叶片上零星荧光有略微的扩大,而对照组的绿色荧光已经扩散至心叶。间接ELISA检测病毒含量较对照组少,处理组的病毒扩散受到抑制。Western blot分析结果表明,显色后的硝酸纤维素膜上约在26 k D处有一特异条带,而空载体的对照无相应条带,说明SlHIN1蛋白在注射部位成功表达。【结论】Hin1在供试科植物中均存在,其中SlHin1定位在细胞膜,过表达该基因可抑制病毒扩散,推测其可能参与茄科植物对烟草花叶病毒的抗性反应,使植株获得抗性。     

不同PE材料遮光下血橙转色期果皮花色苷合成及其相关基因的表达分析

采用不同透光率的PE袋对转色期血橙果实进行遮光试验,测定了不同遮光处理下血橙果皮总花色苷的动态含量和血橙果皮中12个花色苷合成相关基因的动态表达,深入探究光照与血橙果皮花色苷着色之间的关系,以期为改善生产中血橙果面着色不良问题提供解决思路。结果表明:血橙果实经过PE袋遮光后,果皮在着色时间、着色面积和着色程度上均受到阻碍,阻碍程度与PE袋的透光率相关,遮光促进了血橙果面亮度的增加。自然光照下,8个结构基因GST、ANS、CHS、DFR、F3H、UFGT、PAL、4CL和2个调节基因Ruby、MYBF1在转色期间的表达量快速增加,而不同程度的遮光阻碍了其表达,阻碍程度与PE袋的透光率相关,推测这10个基因属于血橙果皮花色苷合成受光调控的关键基因。将遮光后果皮总花色苷动态含量、关键基因的动态表达量与对应的PE袋透光数据进行综合分析,可以推测光照中调控血橙果皮花色苷合成的可能是其中的UVB、UVC紫外光。根据相关基因的动态测定结果,推测血橙果皮花色苷合成的关键时期在花后249 d开始出现,为保证外观品质,血橙采摘在花后249 d之后进行较为适宜。为预防血橙冬季落果,生产上通常采用冬季树体覆膜技术保果,为减少覆膜对血橙果面花色苷着色的影响,应选用透明PE膜或其他紫外线透过率较高的膜。     

新疆桃花柱S-RNase和花粉SFB基因的克隆与分析

为探索新疆桃自交亲和的原因及其与普通桃的分类关系,以4个新疆桃(Prunus ferganensis Kost.et Riab)品种为试材,分别在花柱S-RNase和花粉SFB基因保守区设计引物,在DNA中鉴定其S基因型,并通过全长引物分别克隆4个品种中的S-RNase和SFB全长基因。测序后经分析确定S基因型分别是:‘和田黄肉’S2S2m,‘喀什1号’S1S2,‘喀什4号’S2S2,‘黄李光’S1S2。DNAMAN软件比对结果表明:S2m-RNase的第602个碱基鸟嘌呤G变成了腺嘌呤A,导致半胱氨酸变成了酪氨酸;SFB1m在第978个碱基后插入155bp的片段,导致蛋白质翻译提前终止;SFB2m基因由于在第492个碱基处有5bp的片段插入,使翻译在525bp处终止。RT-PCR组织特异性分析发现新疆桃4个品种的S-RNase均具有花柱组织特异性表达,SFB均具有花粉组织特异性表达;酵母双杂交试验显示突变的SFB1m和SFB2m能分别与S1-RNase、S2-RNase和S2m-RNase相互作用。以上结果表明新疆桃的S基因与桃其他栽培品种一致,自交亲和性可能与S基因的突变相关,且S基因的突变类型与目前鉴定出的普通桃(Prunus persica L.)突变类型一致,该研究进一步说明新疆桃与普通桃的进化关系较近。     

番荔枝花器官发育基因AsAG的克隆、亚细胞定位及表达分析

【目的】从番荔枝中分离花器官特征决定基因AGAMOUS,并进行亚细胞定位及基因表达分析,为进一步研究该基因参与调控花发育调控的分子机理,及解决番荔枝花发育异常问题奠定基础。【方法】以番荔枝成熟花为材料,通过试剂盒提取总RNA,并以RACE方法克隆获得基因AG的全长序列。序列拼接和氨基酸序列分析采用DNAMAN软件;相似性分析通过BLASTn和BLASTp程序进行;进化树构建采用MEGA 5.1软件;蛋白质二级结构预测与3D结构建模分别采用ExPaSy的SOPMA和Phyre2程序进行;亚细胞定位表达采用烟草上皮细胞瞬时转染系统和基因枪轰击洋葱表皮细胞方法;AG在花发育不同时期、不同器官及不同激素信号分子处理下的表达特性分析,利用实时荧光定量RT-PCR方法。【结果】从番荔枝中克隆得到AGAMOUS,其cDNA全长ORF序列长度为669 bp,编码222个氨基酸,命名为AsAG,序列提交到GenBank（登录号为KT159768）。二级结构预测发现AsAG所编码蛋白由延伸链结构（俄extended strand）、α-螺旋（alpha helix）、β-转角（beta turn）和不规则卷曲（random coil）组成,四者比例分别为14.41%、59.46%、8.11%和18.02%。生物信息学分析显示AsAG编码的蛋白与海枣（XP 008781978.1）、芦笋（BAD83772.1）、拟南芥（AT4G18960）、油棕（XP 010912706.1）、山玉兰（AFH74390.1）、石斛（ABQ08574.1）、红花玉兰（AEO52692.1）等同源蛋白的相似度达79%-84%。ASAG蛋白含有一个高度保守的MADS-box结构域和一个次级保守的K区,该蛋白分子量为25.7 kDa,等电点为9.15,为稳定蛋白,无信号肽。亚细胞定位显示AsAG编码蛋白定位于细胞核。实时定量RT-PCR结果表明,AsAG在不同的器官中表达量存在差异,在花中表达量最高。AsAG在番荔枝花发育的整个过程中都有表达,而在花蕾期Ⅳ中表达量最高。进一步分析发现AsAG的表达水平呈现花器官特异性分布（雄蕊＞雌蕊＞萼片＞花瓣）。进一步研究表明,AsAG在畸形花中的表达量低于正常花。检测GA和ABA等不同信号分子分别处理番荔枝花芽2 h和4 h后AsAG的表达量,结果表明AsAG的表达受GA负调控,受ABA正调控。【结论】推测番荔枝AsAG可能参与雌蕊和雄蕊的发育及激素信号的响应。     

番茄SYTA的克隆及表达分析

【目的】克隆获得番茄SYTA(Solanum lycopersicum STYA,S.l SYTA),分析其基因序列生物信息学特征和预测蛋白的结构特征,明确S.l SYTA亚细胞定位和组织表达,并分析其在绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染下的表达变化及其对TMV移动的影响,为明确S.l SYTA在植物病毒侵染致病过程中的作用提供理论依据。【方法】根据番茄基因组含有的SYTA同源基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计克隆引物,采用RT-PCR技术克隆S.l SYTA全长序列;应用生物信息学方法分析该基因的序列特征;使用MEGA 7.0对S.l SYTA蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建同源物种间系统进化树;通过与GFP蛋白融合进行亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测番茄各部位S.l SYTA的表达量以及在TMV胁迫的番茄中S.l SYTA的表达变化;构建植物瞬时表达载体p CV-SYTA-m GFP,通过农杆菌介导在本氏烟草中瞬时表达,TMV-GFP攻毒,利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测在本氏烟中瞬时表达S.l SYTA时TMV-GFP的积累和移动情况。【结果】克隆得到1 620 bp的S.l SYTA基因开放阅读框全长,序列比对及生物信息学分析表明,其编码的氨基酸序列具有SYTs家族的典型特征,含有N端的跨膜区、胞间连接区和C端的两个C2结构域;多序列对比及系统进化树分析发现,与茄科林生烟草、绒毛状烟草等植物亲缘关系较近,与黄瓜较远;亚细胞定位显示S.l SYTA定位于细胞质膜。在番茄的根、茎和叶中S.l SYTA的表达量从高到低依次为根叶茎;TMV-GFP侵染番茄导致其S.l SYTA表达量在接种后第1天显著上调,在第7天降至正常水平。在S.l SYTA瞬时表达的本氏烟叶片部位接种TMV-GFP,TMV-GFP在接种第5天时已经到达新叶,而接种部位仅表达空载体对照的本氏烟新叶中未观察到TMV-GFP,且接种第5天时TMV-GFP在接种叶和新叶中的积累量均明显高于其在空载体对照处理的叶片。【结论】获得的S.l SYTA具有SYTs家族的典型特征。S.l SYTA定位于细胞质膜,S.l SYTA在番茄根中表达量最高。在TMV-GFP胁迫下,番茄中S.l SYTA表达呈现先上升后下降至正常水平。在本氏烟中瞬时表达S.l SYTA有利于TMV-GFP侵染初期的积累和移动。     

茄子抗逆相关基因SmDREB3的克隆和表达分析

DREB(dehydration responsive element binding protein)基因在植物非生物胁迫的应激反应中具有非常重要的作用,本研究运用同源克隆的方法从‘YZ-14’紫茄品种中分离克隆得到了一个DREB基因,因其与番茄和马铃薯中DREB3基因的相似度很高,所以命名为SmDREB3。SmDREB3基因的cDNA全长为887bp,开放阅读框(ORF)长度为777bp,可以编码一个含有259个氨基酸的蛋白,与同科作物马铃薯中DREB基因序列的相似性高达90%,与番茄中DREB基因序列的相似性也能达到88%。成熟蛋白等电点为6.39,分子量为28.665kDa。RT-qPCR实验结果表明,SmDREB基因在紫茄的各个组织中都会表达,但表达水平具有组织特异性,其在果皮中的表达量最高,其次为叶和果肉,而在根、花和茎中的表达量相对较低。本研究为深入研究茄子的抗逆机制以及培育抗逆茄子新品种方面提供了理论基础。     

茄子生长素响应因子SmARF8的克隆与分析

 【目的】克隆茄子生长素响应因子新基因,为研究茄子果实形成发育的分子机制提供依据。【方法】采用RT-PCR 和RACE 技术克隆茄子ARF家族相应基因的cDNA全长序列。经序列联配进行与其它物种同源基因的保守域和进化关系分析。实时定量PCR 检测目的基因在茄子不同组织中的表达情况。【结果】将该基因命名为SmARF8,它的cDNA序列全长为3 671 bp,编码阅读框全长2 676 bp。氨基酸序列分析表明,SmARF8蛋白拥有核定位序列,蛋白质结构具有ARF家族的N-端DNA结合域,中间脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基富集的非保守调控域,C-末端蛋白互作域。氨基酸与拟南芥的调控单性结实基因ARF8相似性较高,进化树分析表明它们聚集在一个分支上,进化关系非常密切。SmARF8基因在幼果中表达最强,在根、茎、叶、花蕾、花朵及成熟果实中表达较强烈。【结论】从茄子中克隆得到一个生长素响应因子家族基因SmARF8。     

玉米大斑病菌环腺苷酸磷酸二酯酶基因克隆及表达分析

【目的】获得玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)环腺苷酸磷酸二酯酶(c AMP phosphodiesterase,PDE)基因,并分析其在病菌侵染结构发育过程及侵染寄主早期阶段中的表达,为深入探索c AMP信号途径调控病菌致病性的作用机制打下基础。【方法】根据酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、绿僵菌(Metarhizium anisopliae)和黑曲霉(Aspergillus niger)6种真菌PDE基因的保守序列,利用简并引物PCR对基因保守片段进行扩增,结合RACE和Genome Walking技术获得基因全长及其侧翼序列;利用MEGA 5.0软件对PDE蛋白预测编码产物进行多重序列比对,并采用邻近法构建系统发育树;利用GSDS分析基因结构,Prot Param分析理化性质,SOMPA预测二级结构,SMART数据库在线分析保守结构域;收集人造疏水介质诱导下侵染结构发育不同时期以及侵染感病寄主叶片不同时间的玉米大斑病菌材料,利用q RT-PCR技术研究StPDE在病菌侵染结构形成过程中不同阶段的转录水平。【结果】玉米大斑病菌基因组中存在1个高亲和力磷酸二酯酶基因(StH-PDE)和1个低亲和力磷酸二酯酶基因(StL-PDE)。其中,StH-PDE全长3 208 bp,包含5个内含子和6个外显子,ORF为2 898 bp。StL-PDE全长5054 bp,包含4个内含子和5个外显子,ORF为3 090 bp。StH-PDE和StL-PDE分别含有保守的Ⅰ型和Ⅱ型c AMP磷酸二酯酶催化结构域。不同的植物病原真菌中PDE同源基因分别呈现出高度的相似性,其中,StH-PDE与Magnaporthe grisea、Cordyceps militaris、Metarhizium acridum等病原真菌的高亲和力磷酸二酯酶基因聚于同一进化支,StL-PDE与Ascochyta rabiri、Scedosporium apiospermum、Fusarium oxysporum、Metarhizium album等病原真菌的低亲和力磷酸二酯酶基因聚于相同进化支。人造疏水介质诱导下,与菌丝相比,StH-PDE和StL-PDE在分生孢子中的表达水平均显著上调,其中StH-PDE和StL-PDE分别上调了约2倍和52倍。孢子萌发初期两个基因表达水平显著下调,随着萌发的进行,表达水平缓慢回升,至附着胞形成阶段,基因表达出现了第2次高峰,随后表达水平再次下调。在整个过程中,StH-PDE的最高表达水平则出现在附着胞形成时期,达到了菌丝体中的近7倍、分生孢子中的近2倍,而StL-PDE的表达水平始终低于其在分生孢子中的表达水平。StH-PDE和StL-PDE在病菌侵染寄主过程中的表达水平变化趋势与其在人工疏水介质诱导下的表现基本一致。在孢子萌发早期表达显著下调,随着时间延长,缓慢回升,至接种后18和24 h StH-PDE表达水平上调,超过萌发初期。【结论】在病菌侵染结构发育过程中,StH-PDE和StL-PDE均呈现下调-上调-下调的表达水平变化趋势。StH-PDE在附着胞时期表达水平最高,StL-PDE在分生孢子中的相对表达水平最高。     

茄子Pn日变化及光合“午休”的生理生态子分析

以两个品种圆茄(二苠茄和快圆茄)为试材,系统研究了其光合速率(Pn)日变化及影响光合“午休”生理生态因子。结果表明,茄子晴天Pn日变化无论品种是否相同(二苠茄和快圆茄)、生育期是否相同(苗期、初花期和盛果期)、叶位是否相同(上部叶片、中部叶片和底部叶片),无一例外地表现为“双峰”曲线,即有光合“午休”现象存在,只是“午休”的时间和程度上有差异;光合“午休”时气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、细胞间隙CO2浓度(Ci)、大气CO2浓度(Ca)均下降,而光合有效辐射(PAR)和叶片温度(TL)此时几乎处于最大值,茄子光合“午休”是由气孔因素引起的。     

茄子 TCP 转录因子的鉴定及胁迫处理下的表达分析

【目的】鉴定茄子 TCP 基因并对茄子 TCP 转录因子家族成员分析。确定其在胁迫、激素处理下的表达情况,为深入研究茄子 TCP 基因的功能奠定基础。【方法】从茄子基因组鉴定 SmTCP 基因家族成员,利用生物信息学方法对茄子 TCP 转录因子家族成员的理化性质、分布情况进行分析。以高温（42 ℃）、低温（4 ℃）、盐胁迫（200 μmol/L NaCl 溶液）、重金属（100 μmol/L CdCl2 溶液）、青枯菌、水杨酸及脱落酸处理茄子幼苗,利用 qRT-PCR 技术分析茄子 TCP 基因在 7 种处理及不同器官的表达情况。【结果】共鉴定到 32 个茄子 TCP 成员,并进行生物信息学分析。qRT-PCR 分析结果显示,茄子 SmTCP 基因受生物及环境胁迫响应上调,激素处理中,ABA 处理后茄子 TCP 整体出现上调,SA 处理后茄子 SmTCP 整体出现下调,茄子 TCP 在叶跟果中的的含量较高。【结论】茄子 TCP 基因受胁迫响应表达,SmTCP 成员响应胁迫表达情况及各器官中的表达量不同,Class Ⅰ类TCP 大多成员在热胁迫下存在明显上调响应。推测茄子 TCP 基因可能参与抵御逆境胁迫。     

茄子主要栽培种遗传多样性分析

为了明确我国茄子主要栽培种的遗传背景,对主要来自广西及全国部分地区的54份茄子栽培种进行表形标记和ISSR标记分析.结果表明,在37个表形性状中,表现为多态性有33个,占89.18％;从50条ISSR引物中共筛选出8条多态性明显、条带清晰、反应稳定的引物,扩增出68条谱带,平均每条引物扩增出8.5条带,多态性带58条,占85.29％;品种间两类型标记遗传相似系数均在0.04 ～1.00之间,总体平均数分别为0.51、0.60,表明个别品种间遗传差异很大,但群体整体遗传基础相对较狭窄;应用SPSS软件聚类分析,两类标记均能在欧氏距离14～15间将54个栽培种划分为6个类群,其中表形标记类群的划分与地理来源有一定关系,而分子标记类群的划分与地理来源没有明显的联系.     

枇杷叶片发育基因EjGRF5与启动子克隆及其在不同倍性枇杷中的表达

【目的】克隆并解析枇杷（Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.）中参与调控叶片生长发育的EjGRF5及其启动子序列的结构特征,研究其在不同倍性枇杷中的表达特性,为进一步研究该基因调控不同倍性枇杷叶片生长势差异的机理奠定基础。【方法】从转录组测序数据中挖掘枇杷EjGRF5的参考序列,以此序列设计引物,并以‘龙泉1号’四倍体枇杷基因组DNA为模板扩增EjGRF5全长,参照EjGRF5参考序列获得其CDS序列。利用Bioedit7.2及SignalP4.1对EjGRF5的CDS序列及其蛋白的理化性质进行分析;采用Mega7.0软件构建EjGRF5和其他物种GRF5的系统进化树;采用LocTree3及SoftBerry ProtComp9.0在线软件对EjGRF5蛋白进行亚细胞定位预测;采用染色体步移的方法克隆EjGRF5的启动子序列,并利用PlantCARE在线软件对克隆得到的EjGRF5启动子序列进行生物信息学分析;采用RT-PCR技术对EjGRF5在三倍体枇杷及其亲本（4x、2x）中的表达差异进行初步分析。【结果】将测序结果与转录组测序的参考序列进行比对发现,EjGRF5全长为1 386 bp,含有3个外显子,2个内含子,内含子全长399 bp,CDS全长987 bp。进化树分析表明,枇杷EjGRF5与蔷薇科的其他植物高度同源,且与白梨的亲缘关系最近。亚细胞定位预测结果显示,枇杷EjGRF5蛋白定位于细胞核中。启动子分析显示,EjGRF5启动子区域含有多个顺势作用元件,包括脱落酸、乙烯、高温、厌氧诱导、赤霉素和光响应元件,并且光响应元件多达11个。qRT-PCR结果显示,除F₁代A-6和B-3外,其余三倍体子代EjGRF5表达量相对于中间亲本值（MPV）都发生了不同程度的上调,其中A-3的表达量是其MPV的20倍,A-5表达量是其MPV的18倍左右。【结论】获得了与枇杷叶片生长发育相关的EjGRF5、CDS序列及其启动子序列,EjGRF5在三倍体枇杷叶片中的表达呈现出上调趋势。     

月季花青素苷相关R_2R_3-MYB蛋白基因的克隆和表达分析

【目的】花青素苷是月季花瓣呈红色或粉色的重要因素。R2R3-MYB蛋白是调控植物花青素苷合成的关键转录因子。从月季花瓣中克隆花青素苷调控相关的R2R3-MYB蛋白同源基因,并分析这些基因与月季花瓣颜色和花青素苷合成的关系,为花色基因工程改良奠定基础。【方法】根据植物花青素苷调控相关R2R3-MYB蛋白的保守序列设计简并引物,结合3'-RACE和Y-RACE方法从月季花瓣中扩增同源基因的全长编码序列。用植物第四(Sg4)和第六(Sg6)亚家族的R2R3-MYB蛋白、拟南芥次生代谢调控相关的R2R3-MYB序列和克隆基因的编码蛋白进行多序列比较和进化分析。通过比较不同颜色的月季花瓣中花青素苷含量和R2R3-MYB蛋白基因的表达水平,分析月季花瓣中R2R3-MYB蛋白基因与花青素苷调控的关系。【结果】从月季‘红胜利’的红色花瓣中克隆了2个R2R3-MYB蛋白基因(Rh MYBs4-1和Rh MYBs6-1,Gen Bank登录号分别为KJ664810和KJ664811)。序列分析表明,Rh MYBs4-1和Rh MYBs6-1蛋白均含有保守的R2R3-MYB结构域,分别与植物Sg4和Sg6 R2R3-MYB蛋白同源。Rh MYBs4-1具有Sg4 MYB蛋白典型的C1、C2抑制子和锌指结构。Rh MYBs6-1具有Sg6 MYB蛋白特有的(A/S/G)NDV和KPRPR(T/S)基序。表达分析显示Rh MYBs4-1和Rh MYBs6-1均在月季‘红胜利’的花瓣中高水平表达,在叶片和花药中表达水平很低。比较7种不同颜色月季花瓣中的花青素苷含量和Rh MYBs4-1和Rh MYBs6-1的表达水平,发现红色花瓣中花青素苷含量远高于其他材料,相应地,Rh MYBs4-1和Rh MYBs6-1均在红色花瓣中具有最高的表达水平。在粉红色月季花瓣中,花青素苷含量不到红色花瓣的10%,Rh MYBs4-1的表达水平极低,而Rh MYBs6-1的表达水平与红色花瓣相当。【结论】月季Rh MYBs4-1和Rh MYBs6-1分别编码Sg4和Sg6亚家族的R2R3-MYB蛋白,均在红色月季花瓣中高水平表达,可能是月季花青素苷合成和花瓣颜色的重要调控基因。