根霉A03α-半乳糖苷酶的分离及其酶学性质初步研究

根霉（Rhizopus sp.A03）发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了2.3倍,总酶活回收率达到25.9%,SDS-PAGE显示其相对分子质量为168.8 kDa。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4.5,最适温度为45℃,表观Km值为0.340±0.026 mmol/L,表观kcat/K_m值为2.866×10⁴ mol-1/（L·s）;水解蜜二糖和棉子糖的表观速率均为10.0μmol/（h·mg）;水解活性受Fe³⁺、Cu²⁺、Mn²⁺和Hg⁺等离子的强烈抑制,但Fe²⁺对酶活性具有显著的激活作用。该酶活性在pH4.0～8.9保持稳定,在45℃时保温60min,残余酶活达到了77.4%。     

不同干燥方式对蓝莓叶中酚类物质及其抗氧化活性的影响

【目的】探讨对蓝莓叶酚类物质含量及抗氧化活性的影响,为蓝莓叶的综合开发利用提供参考。【方法】以蓝莓叶为试验材料,设置不同干燥方式处理分别采用福林酚和比色法、亚硝酸盐比色法及高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）检测各样品的总酚、总黄酮、绿原酸和芦丁含量,采用亚铁还原力（ferric reducing antioxidant power,FRAP）、DPPH和ABTS⁺自由基清除法测定各样品的抗氧化能力,并分析样品酚类物质含量与抗氧化活性的关系。【结果】4种干燥方式对蓝莓叶中总酚、总黄酮含量及多酚类组份均有不同程度的影响。其中,真空冷冻干燥蓝莓叶中酚类物质含量最高,总酚（55.7 mg GAE·g^-1 DW）、总黄酮（104.8 mg RE·g^-1 DW）两者含量均为微波干燥方式的1.2倍左右,真空和热风干燥方式的3倍左右;多酚单体绿原酸（38.3 mg·g^-1）、芦丁（10.2 mg·g^-1）两者含量是微波干燥方式的1.5倍左右,热风和真空干燥方式的2-6倍。不同干燥方式对蓝莓叶的抗氧化活性影响显著（P＜0.05）。其中,真空冷冻干燥样品的抗氧化能力最强,DPPH自由基和ABTS⁺·的半清除浓度EC₅₀分别为54.8 µg·mL^-1和183.9µg·mL^-1,亚铁还原能力FRAP值达到6.0,抗氧化能力略高于微波干燥法（DPPH自由基和ABTS⁺·的半清除浓度EC₅₀分别为61.8 µg·mL^-1和225.7 µg·mL^-1,FRAP值4.0）。微波干燥法样品的抗氧化能力显著高于热风干燥（DPPH自由基和ABTS⁺·的半清除浓度EC₅₀分别为136.6 µg·mL^-1和575.1 µg·mL^-1,FRAP值1.7）和真空干燥方法（DPPH自由基和ABTS⁺·的半清除浓度EC₅₀分别为136.1 µg·mL^-1和225.7 µg·mL^-1,FRAP值1.8）(P＜0.05)。热风和真空干燥样品间抗氧化活性没有明显差异(P＞0.05)。相关性分析表明,除芦丁外,其他酚类物质含量与其抗氧化活性均存在极显著相关(P＜0.01)。【结论】真空冷冻干燥能较好地保留蓝莓叶中的多酚类物质,且具备较强的抗氧化能力和还原能力;微波干燥的效果略低于真空冷冻干燥,生产上可根据样品处理量的大小和具体情况选择干燥方式。     

松仁肽及其Zn2+螯合物的分离纯化、结构表征的对比分析

探究在相同条件下制备得到的松仁肽与其Zn2+螯合物的分离纯化、结构表征,对比分析两者的结构区别及抗氧化能力的变化。采用超滤过滤、葡聚糖凝胶Sephadex G-50和Sephadex G-15分离的方法进行分离纯化;用氨基酸组成、紫外扫描光谱、傅里叶红外光谱、能谱的分析测定结构表征。分离纯化得到抗氧化能力最强的组分P-4-1和P-Zn-3-1,并对该组分进行结构分析。松仁肽与松仁肽-锌螯合物的氨基酸组成分析可得出氨基酸质量分数在螯合前后有所变化。其中天冬氨酸的质量分数由6.306%上升至12.083%,谷氨酸的质量分数由14.953%上升到16.076%。紫外扫描得出松仁肽吸收峰为220 nm,Zn²⁺螯合物的吸收峰为240 nm,发生了红移。红外扫描显示出螯合前与螯合后的透射率、吸收峰和吸收强度均有所变化。在能谱分析中,根据不同元素的能量来辨别不同物质的元素组成,得出的能谱结果显示螯合前无Zn²⁺的能量柱,螯合后出现Zn²⁺。通过对比分析可知抗氧化能力最强的2个组分结构表征有明显的区别,并且与Zn²⁺螯合后的松仁肽抗氧化能力高于未螯合的松仁肽,由此可以推断有Zn²⁺参与的螯合反应会对松仁肽的抗氧化能力有所影响。     

大肠酶对猪饲料酶水解物能值的影响及与非淀粉多糖组分的关系

【目的】研究大肠酶对单胃动物仿生消化系统测试猪饲料原料的体外干物质消化率（DMD）和酶水解物能值（EHGE）的影响,并分析不同大肠酶条件下非淀粉多糖（NSP）组分与DMD和体外总能消化率（GED）的关系,为完善体外模拟胃-小肠-大肠三步消化方法提供参考依据。【方法】采用单因素完全随机设计,共设4个处理,在单胃动物仿生消化系统模拟饲料原料胃和小肠消化后,分别使用对照组（去离子水）、纤维素酶、Viscozyme酶和仿生酶（由纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶和果胶酶组成）模拟大肠阶段的消化。每个处理设5个重复,每个重复1根消化管,分别测定玉米、大豆粕、小麦麸、玉米DDGS、苜蓿草粉和大豆皮的DMD、GED和EHGE。并使用乙酸酐衍生化气相色谱法测定6种饲粮原料NSP含量和组分。分析饲料原料NSP组分与DMD及GED的相关关系。 【结果】（1）在对照组中,玉米的DMD最高,达到了81.51 %,相应的EHGE为15.39 MJ·kg^-1,而大豆皮的DMD最低,只有10.60 %,相应的EHGE只有2.42 MJ·kg^-1。（2）3种模拟大肠酶均显著提高了玉米、大豆粕和大豆皮的DMD（P＜0.01）,提高了大豆粕和大豆皮的EHGE（P＜0.01）。但纤维素酶作用下苜蓿草粉、玉米DDGS的DMD和EHGE与对照组差异不显著,Viscozyme酶作用下小麦麸、玉米DDGS的DMD和EHGE与对照组差异不显著（P＞0.05）。仿生酶显著提高了6种饲料原料的DMD（P＜0.01）,显著提高了除玉米DDGS外的其他5种饲料原料的EHGE（P＜0.01）。（3）不同的大肠酶对不同饲料原料体外消化率的提升程度不同。在6种原料中,纤维素酶对小麦麸的DMD和EHGE提升程度最高,分别达到了5.89 %和1.03 MJ·kg^-1,而只使大豆粕的DMD和EHGE提高了1.26 %和0.36 MJ·kg^-1;Viscozyme酶对大豆皮体外消化率的提升程度最高,分别使其DMD和EHGE提高6.01%和1.02 MJ·kg^-1。仿生酶对小麦麸的DMD和EHGE的提升程度最高,达到了6.59%和1.37 MJ·kg^-1。（4）6种饲料原料的可溶性非淀粉多糖（SNSP）的含量均低于不溶性非淀粉多糖（INSP）,玉米的总非淀粉多糖（TNSP）含量最低（8.59%）,大豆皮的TNSP含量最高（75.72%）,各原料的NSP主要由阿拉伯糖、木糖、甘露糖和葡萄糖组成,但不同原料中4种单糖含量存在差异。（5）6种饲料原料的SNSP、INSP以及TNSP含量与DMD、GED均呈显著的负相关（P＜0.05）。仿生酶作用下DMD与TNSP含量的相关性（R ²=0.95, P＜0.01）高于纤维素酶（R ²=0.94, P＜0.01）和Viscozyme酶（R ²=0.93, P＜0.01）。同时,仿生酶作用下GED与TNSP含量的相关性（R ²=0.89, P＜0.01）也高于纤维素酶（R ²=0.86, P＜0.01）和Viscozyme酶（R ²=0.81, P＜0.01）。【结论】仿生酶在体外模拟猪大肠消化过程中,对饲料的消化作用优于纤维素酶和Viscozyme酶,可作为单胃动物仿生消化系统体外模拟猪消化中大肠阶段的模拟消化酶。     

舍内不同氨气浓度对肉鸡抗氧化性能及肉品质的影响

【目的】探讨鸡舍内不同氨气浓度对肉鸡抗氧化性能和肉质性状的影响。【方法】采用单因素完全随机设计,将400只21日龄健康艾拔益加（AA）肉公鸡,随机分在4个呼吸代谢舱中,每个舱为1个处理,每个处理设4个重复,每个重复25只鸡。4个处理组分别为：对照组氨气浓度控制在＜3 mg·kg-1,试验组氨气浓度分别控制在(25±3)、(50±3)和(75±3) mg·kg-1。呼吸代谢舱采用全自动化控制养殖环境条件。试验期为21 d,21-31 d为试验前期,32-42 d为试验后期。肉鸡采用网上平养,自由采食和饮水。分别在32 d和42 d屠宰取样,测定肉鸡血液、肌肉、肝脏的抗氧化性能以及肉质性状。【结果】1）抗氧化性能：在21-31日龄阶段,随着鸡舍氨气浓度的升高,肉鸡血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性呈二次曲线增加（P＜0.05）,总抗氧化能力（total antioxidation capacity,T-AOC）活性和丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量呈线性增加（P＜0.05）;胸肌过氧化氢酶（catalase,CAT）活性和MDA含量具有呈线性增加的趋势（0.05＜P＜0.10）,而T-AOC活性呈线性降低（P＜0.05）;腿肌T-AOC活性有呈线性增加的趋势（0.05＜P＜0.10）,75 mg·kg^-1氨气处理组SOD活性显著高于对照组（P＜0.05）;肉鸡肝脏CAT活性具有线性降低的趋势（0.05＜P＜0.10）,MDA含量呈现线性增加（P＜0.05）。在32-42日龄阶段,随着鸡舍氨气浓度的升高,肉鸡血清谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）活性呈二次曲线降低（P＜0.05）,CAT活性呈线性降低（P＜0.05）,50 mg·kg^-1氨气处理组SOD活性显著低于对照组（P＜0.05）;胸肌CAT活性呈线性增加（P＜0.05）,T-AOC活性呈二次曲线降低（P＜0.05）;腿肌GSH-Px活性呈二次曲线增加（P＜0.05）,75 mg·kg^-1 氨气处理组腿肌SOD活性显著高于其他各组（P＜0.05）;肝脏T-AOC活性具有呈二次曲线增加的趋势（0.05＜P＜0.10）,GSH-Px活性呈线性降低（P＜0.05）。（2）肉质性状：在21-31日龄阶段,随着氨气浓度的升高,肉鸡胸肌剪切力和肉色b*值呈线性降低（P＜0.05）,L*值呈线性升高（P＜0.05）;腿肌肉色L*值呈线性降低（P＜0.05）,肉色a*值和宰后24 h的pH值呈二次曲线增加（P＜0.05）,b*值具有线性降低的趋势（0.05＜P＜0.10）。在32-42日龄阶段,随着氨气浓度的升高,肉鸡胸肌剪切力和肉色a*值呈线性降低（P＜0.05）,b*值与屠宰后24 h肉质pH值均呈线性升高（P＜0.05）,50 mg·kg^-1氨气处理组胸肌肉色L*值显著高于其他各组（P＜0.05）;宰后45 min腿肌pH具有呈二次曲线增加的趋势（0.05＜P＜0.10）。【结论】鸡舍高浓度氨气可降低肉鸡的抗氧化能力,影响鸡肉品质,且随氨气浓度的升高而逐渐增强,具有时间累加效应。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇和黄曲霉毒素B1单一及联合染毒对小鼠脑组织病理变化、抗氧化性能和紧密连接蛋白表达量的影响

本试验旨在研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和黄曲霉毒素B₁(AFB₁)单一及联合染毒对小鼠脑组织病理变化、抗氧化性能和紧密连接蛋白mRNA表达量的影响。选取96只18日龄昆明系雄性小鼠,随机分为对照组、DON组、AFB₁组和AD组(DON+AFB₁组),每组分别灌服生理盐水、500 μg·kg^-1 DON、200 μg·kg^-1 AFB₁和200 μg·kg^-1 AFB₁+500 μg·kg^-1 DON,连续灌服45 d。分别于试验的第0、15、30、45天,每组随机选取6只小鼠,麻醉后处死,取脑组织观察病理变化,并检测脑组织氧化与抗氧化指标及紧密连接蛋白ZO-1和Occludin mRNA的表达量。结果显示,与对照组相比,DON组小鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性显著下降(P<0.05),NO含量显著升高(P<0.05);AFB₁组小鼠脑组织中CAT活性显著下降(P<0.05);AD组脑组织总抗氧化能力(T-AOC)、CAT、SOD活性显著下降(P<0.05),丙二醛(MDA)和NO含量显著上升(P<0.05);各染毒组脑组织ZO-1和Occludin mRNA的表达量显著下降(P<0.05)。研究结果表明,DON与AFB₁单一及联合染毒均能造成小鼠脑组织不同程度的病理变化,降低抗氧化性能及紧密连接蛋白ZO-1和Occludin mRNA的表达量,且DON与AFB₁的联合毒性大于单一毒性。     

猪宰后肌肉体系中μ-calpain及肌原纤维蛋白理化特性的变化规律

【目的】研究猪宰后1-168 h,肌肉体系中μ-calpain及肌原纤维蛋白理化特性变化规律,并探究肌肉持水性变化机理,为冷鲜肉汁液流失控制提供理论依据。【方法】取宰后1 h内的猪背最长肌,在4℃条件下分别成熟6、12、24、72、120和168 h,通过活性电泳（casein zymography）对μ-calpain活性定量分析,对肌原纤维小片化指数（myofibril fragmentation index,MFI）进行过程测定,利用SDS-PAGE变性凝胶电泳分析肌原纤维蛋白降解聚合情况,研究宰后肌肉的成熟与肌原纤维蛋白的结构变化规律;通过测定肌原纤维蛋白表面疏水性和溶解性,考察肌原纤维蛋白水合力的变化,利用加压滤纸法测定肌肉的持水性（water-holding capacity,WHC）,并借助低场核磁共振技术（low field nuclear magnetic resonance,LF-NMR）定性定量考察肌肉3种不同状态水（结合水、不易流动水及自由水）的分布和迁移。【结果】宰后1-24 h,μ-calpain活性升高,肌原纤维蛋白未发生明显降解,MFI无显著变化（P＞0.05）。宰后24 h肌肉进入成熟期,μ-calpain活性逐渐下降,MFI值显著升高（P＜0.05）,肌原纤维蛋白显著降解,肌肉持水性随之改变。肌肉成熟过程中,μ-calpain作用于肌肉蛋白导致蛋白质结构伸展并降解,一方面会有低分子量的蛋白生成,增加蛋白质的比表面积,使其溶解度增加;另一方面也有疏水残基的暴露及蛋白的交联聚合,导致蛋白溶解度降低,表面疏水性增加,这两者之间的竞争结果决定了降解后蛋白质的水合特性。其中,宰后24-120 h,μ-calpain适度降解肌原纤维蛋白,溶解度显著升高（P＜0.05）,使肌肉中不易流动水P₂₂升高（r=0.286,P＜0.01）,自由水P₂₃下降（r=-0.246,P＜0.05）;肌原纤维蛋白内部疏水性残基的暴露引起表面疏水性显著升高（P＜0.05）,致使肌肉自由水P₂₃升高(r=0.319,P＜0.01);LF-NMR-T₂结果表明结合水P₂₁与不易流动水P₂₂的相关系数为r=-0.890（P＜0.01）,不易流动水P₂₂与自由水P₂₃的相关系数为r=-0.360（P＜0.01）,表明结合水和自由水会“态变”为不易流动水,蛋白结合水随着蛋白质的高级结构被破坏,结合水被释放,转变为不易流动水,同时肌肉蛋白的降解导致位于肌纤维细胞外的自由水流回肌纤维细胞内部,肌肉持水性升高。宰后120-168 h,肌原纤维蛋白的高度降解,引发低分子量蛋白相互聚集,表面疏水性和溶解度下降,肌肉中不易流动水P₂₂降低（P＜0.05）,自由水P₂₃升高（P＜0.05）,不易流动水“态变”成自由水,肌原纤维结构内的不易流动水逐渐流向肌原纤维外的空隙,变为自由水,从而造成新的汁液流失,肌肉持水性下降。【结论】宰后24-120 h,μ-calpain介导的肌原纤维蛋白降解,使蛋白溶解度和表面疏水性增加,水合力上升,肌肉中结合水和自由水“态变”为不易流动水,肌肉持水性升高。宰后120-168 h,肌原纤维蛋白进一步降解,低分子量蛋白发生交联聚合,蛋白水合力降低,肌肉中不易流动水“态变”成自由水成为汁液流失。     

3个苹果品种气体交换特性及其对环境因子的响应

利用Li-6400光合作用系统对3个苹果品种（富士、早富一号、新富一号）的净光合速率（P_n）、气孔导度(G_s)、胞间CO₂的浓度（C_i）、蒸腾速率（T_r）和水分利用效率（WUE）以及光响应曲线等生理指标进行测定、对比分析。结果表明:1）3个苹果品种均是高光合、高蒸腾、高水分利用效率的品种,富士光饱和点(LSP) 和光补偿点(LCP)分别为1 542.8 μmol·m^-2·s^-1、30.4 μmol·m^-2·s^-1,早富一号LSP和LCP分别为1 618.8 μmol·m^-2·s^-1、26.6 μmol·m^-2·s^-1,新富一号LSP和LCP分别为1 189.4 μmol·m^-2·s^-1、41.8 μmol·m^-2·s^-1。2）富士的P_n、T_r日变化呈“单峰”曲线;早富一号、新富一号的P_n、T_r日变化均呈“双峰”曲线分布,并且存在光合“午休”现象。3）影响富士P_n、T_r日变化的主要内外界环境因子及作用大小的顺序分别依次为:PPFD>G_s、RH>T_air >G_s;影响早富一号P_n、T_r日变化的主要内外界环境因子以及作用大小的顺序分别依次为:PPFD >G_s>RH、RH>T_air>G_s>PPFD;影响新富一号Pn、T_r日变化的主要内外界环境因子以及作用大小的顺序分别依次为:PPFD >G_s > RH>T_air、RH>T_air >G_s> PPFD。     

纳米锌水平对公羊精液品质、抗氧化酶活性及附睾Cu-ZnSOD表达的影响

【目的】微量元素锌是动物正常繁殖所必需的元素,研究旨在了解日粮纳米锌对公羊精液品质、抗氧化酶和附睾Cu-ZnSOD蛋白表达的影响,分析公羊精液品质参数与精浆抗氧化酶活性的相关性。【方法】将16只9月龄健康状况良好体重相近的晋中绵羊公羊,随机分成4组,分别喂给基础日粮（对照组）,基础日粮+50 mg·kg^-1、100 mg·kg^-1和150 mg·kg^-1 DM纳米锌。试验期90 d。在试验78 d和79 d连续两天采集精液,每次采集精液取出100 µL评价精液品质参数,剩余精液离心分离精浆,测定精浆Cu-ZnSOD、GPxs活性及总抗氧化能力;试验结束时,用手术去势法采集附睾头、附睾体和附睾尾组织,采用免疫组化技术对附睾头、附睾体和附睾尾中Cu-ZnSOD进行定位,并用Image Pro Plus 7.0软件分析的平均光密度值进行Cu-ZnSOD蛋白定量。【结果】日粮纳米锌对公羊射精量影响差异不显著（P＞0.05）。与对照组相比,添加50 mg·kg^-1或100 mg·kg^-1纳米锌组公羊的精子密度、精子活力和精子质膜完整性显著增加（P＜0.05）,精子畸形率显著降低（P＜0.05）;添加150 mg·kg^-1组精子质膜的完整度显著增加（P＜0.05）,其精子活力和精子密度与对照组的差异不显著（P＞0.05）。日粮添加50 mg·kg^-1或100 mg·kg^-1纳米锌组公羊精浆Cu-ZnSOD活性、GPxs活性和总抗氧化能力显著高于对照组（P＜0.05）,精浆MDA含量显著低于对照组（P＜0.05）;添加150 mg·kg^-1组公羊精浆总抗氧化能力显著高于对照组（P＜0.05）,其精浆Cu-ZnSOD活性、GPxs活性和MDA含量与对照组差异不显著（P＞0.05）。免疫组化定位结果显示Cu-ZnSOD在附睾头和附睾体假复层上皮、结缔组织和附睾尾的单层柱状上皮中均检测到阳性信号,试验处理组公羊附睾中Cu-ZnSOD表达量由高到低顺序是：附睾体＞附睾头＞附睾尾;然而对照组的顺序为：附睾头＞附睾体＞附睾尾。50 mg·kg^-1或100 mg·kg^-1纳米锌组公羊附睾头和附睾体阳性信号的平均光密度显著高于对照组和150 mg·kg^-1纳米锌（P＜0.05）。精浆Cu-ZnSOD活性与精子密度、精子活力和精子质膜完整性呈正相关,与精子畸形率呈负相关。【结论】日粮添加50 mg·kg^-1或100 mg·kg^-1纳米锌可改善精液品质,提高精浆抗氧化能力,增加附睾中Cu-ZnSOD蛋白表达量。精浆Cu-ZnSOD活性可以作为检测精液品质优劣的指标在羊生产中应用。微量元素锌对精液品质影响调控的分子机理还需进一步深入研究。     

大斑刚毛座腔菌高产漆酶条件的响应面优化及酶学特性

【目的】优化大斑刚毛座腔菌（Setosphaeria turcica）高产漆酶的最佳发酵条件,确定其酶学性质,为进一步开发应用奠定基础。【方法】以大斑刚毛座腔菌为出发菌株,首先采用单因素试验确定影响菌株产漆酶的碳源、氮源及铜离子的种类及范围,并在单因素试验的基础上,以漆酶酶活力为响应值,采用central composite design（CCD）响应面设计试验,利用Design Expert软件对响应值进行3因素3水平下的多元二次回归拟合分析,优化大斑刚毛座腔菌产漆酶的发酵培养基成分;初步分离大斑刚毛座腔菌发酵液中的漆酶,以ABTS为反应底物,设置不同温度及pH,测定漆酶的最适反应温度、pH及热稳定性、pH稳定性,进一步测定其反应动力学常数Km值、Vm值,确定其酶学特性。【结果】建立了以漆酶酶活力为响应值的多元二次回归模型,模型差异显著（P=0.0001）,可以用该模型来拟合试验;响应面分析结果表明,各因素对漆酶活力的影响大小依次为Cu²⁺>葡萄糖>尿素,而葡萄糖和尿素交互作用极显著;通过拟合求出模型极值点,对应的大斑刚毛座腔菌产漆酶的最佳培养条件为：葡萄糖50.05 g?L^-1,KH₂PO₄ 1 g?L^-1,尿素1.46 g?L^-1,MgSO₄ 0.5 g?L^-1,蛋白胨2 g?L^-1,玉米浆0.5 g?L^-1,CuSO₄ 0.07 g?L^-1,Tween80 3 mL?L^-1,28℃,150 r/min振荡培养7 d;在此条件下漆酶活力最高达（40.00±1.20）U?mL^-1。对大斑刚毛座腔菌漆酶发酵液初步分离,经SDS-PAGE检测其漆酶相对分子量约为80 kD;以ABTS为底物时,最适反应温度为50℃,最适pH为4.2,在温度较高且弱酸性条件下活性较高,并且具有良好的温度稳定性和pH稳定性,常温下pH为4.2保持14 h后酶活力基本不变,50℃保温14 h后漆酶活力仍保持在60%以上;进一步在常温、pH为4.2时测定其米氏常数Km值为0.036 mmol?·L^-1,最大反应速率Vm为28.63 mmol?L^-1?min^-1。【结论】利用大斑刚毛座腔菌液体发酵产漆酶并研究其酶学特性,表明作为玉米致病菌的大斑刚毛座腔菌产漆酶具有发酵周期短、活性高、稳定性好等特性,可进一步研究开发应用。     

酶法制备大豆蛋白成骨活性肽

[目的]探究从大豆分离蛋白双酶分步酶解产物中分离促成骨细胞增殖肽的工艺,为大豆产品的开发提供参考.[方法]以促成骨细胞增殖活性作为测定指标,选用木瓜蛋白酶酶解大豆分离蛋白(SPI),采用MTT法检测不同浓度的木瓜蛋白酶酶解产物对成骨细胞的促增殖活性.采用pH-Stat法检测水解时间为1、2、3、4、5和6h的木瓜蛋白酶...     

咯菌腈对四种牡丹叶片病原真菌的抑制活性

【目的】探究咯菌腈对牡丹黑斑病菌(Alternaria suffruticosae)、黄斑病菌(Phyllosticta commonsii)、腔孢叶斑病菌(Hainesia lythri)和叶霉病菌(Cladosporium paeoniae)菌丝生长、孢子萌发、芽管伸长及产孢的抑制活性,分析咯菌腈在牡丹病害化学防治上的应用前景。【方法】采用菌丝生长速率法测定咯菌腈对菌丝生长的抑制活性,采用涂布平板法测定咯菌腈对孢子萌发、产孢时间及产孢量、芽管伸长及芽管和孢子形态的影响。【结果】咯菌腈对腔孢叶斑病菌菌丝生长的抑制作用最强,EC_(50)为0.01μg·mL~(-1),其次为黑斑病菌和黄斑病菌,分别为0.07和0.35μg·mL~(-1);咯菌腈对4种病菌的孢子萌发均有较强的抑制作用,对腔孢叶斑病菌的抑制作用最强,其EC_(50)为1.26μg·mL~(-1),对其他3种病菌孢子萌发的EC_(50)在3.27—3.45μg·mL~(-1);0.1μg·mL~(-1)咯菌腈对4种病菌分生孢子芽管伸长的抑制率在40%—70%,表明咯菌腈对4种病菌分生孢子芽管伸长均有明显的抑制作用,浓度越大抑制作用越强,各浓度间差异显著,其中对腔孢叶斑病菌芽管伸长抑制的EC_(50)为0.04μg·mL~(-1),抑制作用最强,对其他3种病菌芽管伸长的EC_(50)在0.08—0.22μg·mL~(-1);咯菌腈对黑斑病菌和黄斑病菌分生孢子和芽管的致畸作用强烈,可导致孢子及芽管膨大、过度分枝,而对叶霉病菌和腔孢叶斑病菌致畸作用较弱,芽管及孢子形态基本正常;咯菌腈可推迟黑斑病菌、黄斑病菌及叶霉病菌的产孢时间,对黑斑病菌产孢量的抑制作用最强,EC_(50)为0.05μg·mL~(-1),对叶霉病菌次之,EC_(50)为0.38μg·mL~(-1),但对腔孢叶斑病菌产孢有促进作用。【结论】咯菌腈对牡丹黑斑病菌及腔孢叶斑病菌的菌丝生长、孢子萌发及芽管伸长均有很强的抑制作用,但对腔孢叶斑产孢具有一定的促进作用;对叶霉病菌和黄斑病菌孢子萌发及芽管伸长、黄斑病菌菌丝生长及叶霉病菌产孢的抑制作用强烈;由于咯菌腈内吸活性较弱,无法抑制已侵入牡丹叶片的病原真菌的生长,故建议作为保护剂在病害发生前施用。     

核桃青皮的强抗氧化活性成分及其抗氧化稳定性

【目的】以大孔树脂纯化的核桃青皮抗氧化成分为对象,对其组分进行鉴定,并研究其抗氧化稳定性,为核桃青皮的开发和有效利用提供理论依据。【方法】以DPPH自由基清除能力为指标,采用D101型的大孔树脂纯化核桃青皮粗提取物,浓缩冷冻干燥后,采用超高压液相色谱-高分辨质谱联用仪（UPLC-MS）对具有较强抗氧化活性部分的核桃青皮纯化物进行成分分析,并通过分析pH、温度、光照、金属离子、氧化剂H2O2、还原剂Na2SO3和防腐剂山梨酸钾7种因素对核桃青皮抗氧化物质清除DPPH自由基的影响,研究其抗氧化性能的稳定性。【结果】UPLC-MS结果表明,核桃青皮中具有强抗氧化活性的主要成分为绿原酸、短叶苏木酚羧酸、花靛-葡萄糖/半乳糖、鞣花、槲皮素-阿拉伯糖、表儿茶素或儿茶素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷等7种成分。抗氧化成分稳定性研究结果表明：随着pH的增大,核桃青皮抗氧化物质对DPPH自由基清除率逐渐减小,当pH为12时,抗氧化物质对DPPH自由基的消除率几乎为0;抗氧化物质对DPPH自由基清除率能力随着放置时间的延长而下降;在室内、光照和避光3种处理下,核桃青皮抗氧化物质溶液的DPPH自由基消除率在0-2 h内逐渐下降,且三者之间无显著性差异（P＞0.05）。在放置2-5 h内,光照处理的消除率均低于同期的室内和避光处理;在4、37、70和90℃ 4种处理下,核桃青皮抗氧化物质溶液对DPPH自由基的消除率总体呈下降的趋势,而在50℃处理下则呈先下降后上升再下降的趋势;Fe3+能使抗氧化物质维持较高的抗氧化活性,而Cu2+ 、Mg2+、K+、Al3+则使核桃青皮抗氧化物质的抗氧化能力降低。亚硫酸钠使核桃青皮抗氧化物质的抗氧化能力维持较低水平;浓度为0.10%和0.05%的H2O2能提高核桃青皮抗氧化物质的抗氧化能力,此后抗氧化能力随着其浓度的增加而下降;防腐剂山梨酸钾溶液能显著降低（P<0.05）核桃青皮抗氧化物质的抗氧化能力,二者呈负相关关系。【结论】核桃青皮提取物具有较强的抗氧化活性,其抗氧化组分主要为7种多酚类活性物质。环境因子对核桃青皮活性物质的抗氧化稳定性具有一定的影响。     

桑树MaDFR的克隆及功能分析

【目的】克隆桑树（Morus alba L.）二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol-4-reductase,DFR）基因,并通过烟草过表达研究其对烟草黄酮生物合成的影响,为该基因功能分析及应用提供理论参考。【方法】采用RT-PCR的方法从桑树中克隆出MaDFR,采用农杆菌介导的遗传转化技术,将MaDFR导入模式植物烟草中,获得具有卡那抗性的转基因烟草植株,通过基因组PCR鉴定转基因阳性植株,采用反向PCR的方法分析T-DNA在烟草中的插入位点。通过定量PCR的方法分析MaDFR在烟草中的表达水平,AlCl₃分光光度法测定转基因烟草中总黄酮含量,通过DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）清除能力分析总黄酮酸水解前后的抗氧化活性,最后通过高效液相色谱（HPLC）分析烟草花冠中花青素的含量及种类。【结果】从中桑5801中克隆并获得了全长为1 026 bp的MaDFR,编码341个氨基酸残基,其蛋白质具有典型的NADPH结合位点。获得7株具有卡那抗性的烟草转基因株系。分子鉴定4株为转基因阳性株系。MaDFR在转基因烟草中能够表达,但不同转基因株系之间MaDFR表达水平存在较大差异。转基因烟草叶片中总黄酮含量明显增加,其中,DFR-4和DFR-7 2个株系分别增加了30.4%和27.6%,DFR-2和DFR-5分别增加了19.8%和14.2%。抗氧化活性分析发现转基因株系叶片中未酸解总黄酮抗氧化活性存在较大差异,DFR-2、DFR-4的抗氧化能力比对照组提高了近5倍,而DFR-5和DFR-7与对照组没有显著性的差异,转基因株系叶片中总黄酮的抗氧化活性与MaDFR的表达水平具有显著的正相关性。转基因株系叶片中酸解总黄酮抗氧化活性与总黄酮的含量具有显著的正相关性。MaDFR在烟草中的过表达能够增加花冠中花青素的含量,DFR-4株系中花青素含量增加了15%,DFR-5和DFR-7 2个株系中花青素的含量增加了一倍,但转基因烟草花冠中花青素种类没有发生改变。【结论】MaDFR在烟草中的过表达能够显著增加烟草的总黄酮含量及抗氧化作用,也可以显著增加烟草花冠中花青素的含量,但不能改变花青素的种类,说明该基因在矢车菊素类花青素的生物合成代谢路径中具有重要作用。     

黄淮麦区部分小麦种质脂肪氧化酶活性分析及等位基因检测

【目的】小麦中的脂肪氧化酶（LOX）是影响小麦面粉颜色和其储藏特性的主要因素之一,对中国黄淮麦区的306份小麦种质资源进行脂肪氧化酶活性分析及等位基因检测,为小麦品质育种提供理论参考。【方法】利用紫外分光光度计和酶标仪测定参试样品的脂肪氧化酶（LOX）活性,并利用控制脂肪氧化酶活性的位于1AL上的QLpx.caas-1AL位点紧密连锁的分子标记Xwmc312以及位于4BS上的TaLOX-B1位点的功能标记LOX16和LOX18,采用特异引物的PCR扩增技术以及琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离技术进行参试材料的LOX基因型鉴定。【结果】表型测定结果表明,参试的黄淮麦区小麦品种（系）中脂肪氧化酶活性的平均值为65.73 AU·min^-1·g^-1,标准差为13.54,变幅为27.09-99.55 AU·min^-1·g^-1,变异系数为20.6%。参试材料中小于40 AU·min^-1·g^-1和大于90 AU·min^-1·g^-1的小麦品种（系）分别为7个和8个,可作为对当前主栽小麦品种进行脂肪氧化酶活性改良的重要资源材料。基因型鉴定结果表明,参试材料的QLpx.caas-1AL位点存在3种等位变异类型,Xwmc312₂₂₇、Xwmc312₂₃₅和Xwmc312₂₄₇所占比例分别为30.4%、18.9%和50.6%。参试材料的TaLOX-B1位点存在TaLOX-B1a和TaLOX-B1b两种变异类型,所占比例分别为 28.7%和71.2%。分析其基因型组合发现,参试材料中共有6种基因型组合类型,依次为TaLOX-B1a/Xwmc312₂₂₇、TaLOX-B1a/Xwmc312₂₃₅、TaLOX-B1a/Xwmc312₂₄₇、TaLOX-B1b/Xwmc312₂₂₇、TaLOX-B1b/Xwmc312₂₃₅和TaLOX-B1b/Xwmc312₂₄₇,所占比例分别为7.2%、9.5%、12.1%、23.2%、9.5%和38.6%。分析不同LOX基因型与脂肪氧化酶活性的关系表明,1AL位点上拥有Xwmc312₂₃₅基因型的小麦品种脂肪氧化酶活性显著高于其他两种基因型（P＜0.05）,4BS位点拥有TaLOX-B1a基因型的小麦品种脂肪氧化酶活性显著高于拥有TaLOX-B1b基因型的小麦品种（P＜0.05）。进一步分析不同LOX基因型组合与脂肪氧化酶活性的关系表明,拥有TaLOX-B1a/Xwmc312₂₃₅基因型组合的小麦品种脂肪氧化酶活性（76.80 AU·min^-1·g^-1）显著高于其他5种基因型组合,而拥有TaLOX-B1b/Xwmc312₂₂₇基因型组合的小麦品种脂肪氧化酶活性显著低于其他5种基因型组合,仅为62.44 AU·min^-1·g^-1。【结论】中国黄淮麦区的小麦品种脂肪氧化酶活性绝大多数处于中间类型,拥有极低（小于40 AU·min^-1·g^-1）或极高（大于90 AU·min^-1·g^-1）脂肪氧化酶活性类型的小麦品种所占比例较低。黄淮麦区所发现的6种不同LOX基因型组合中,拥有TaLOX-B1a/Xwmc312₂₃₅基因型组合的小麦品种脂肪氧化酶活性相对较高（P＜0.05）,而拥有TaLOX-B1b/Xwmc312₂₂₇基因型组合的小麦品种脂肪氧化酶活性相对较低（P＜0.05）。     

D~2型细胞质雄性不育小麦绒毡层细胞程序化死亡与活性氧代谢

【目的】D2型细胞质是细胞质雄性不育小麦(cytoplasmic male sterility,CMS)的重要胞质来源,深入研究其败育机理对小麦杂种优势利用具有重要价值。【方法】以3种同核异质D2型细胞质雄性不育小麦Va87B1-706A、C687B1-706A、Ju87B1-706A及其相应保持系706B为试材,通过体式显微镜和DAPI染色分别在四分体时期、单核早期、单核晚期、二核期和三核期观察小麦花药的外形和小孢子发育的形态;利用扫描电镜和KI-I2染色分析三核期花药外皮层、内皮层、乌氏体和花粉粒的表型及败育特点;采用石蜡切片和DNA ladder的技术观察不同发育时期D2型不育系和保持系小麦花药绒毡层细胞形态变化特征以及绒毡层细胞程序化死亡(programmed cell death,PCD)的过程;测定花药发育过程中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(peroxidase,POD)、过氧化氢酶(hydrogen peroxidase,CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)的活性以及非酶物质还原型抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)的含量变化;同时利用RT-PCR技术对部分抗氧化酶相关基因的表达模式进行分析。【结果】与保持系706B比较,3种D2型细胞质雄性不育小麦在三核期均表现出外皮层表皮褶皱、乌氏体排列稀疏散乱以及小孢子皱缩、表皮粗糙和萌发孔闭合的不育特征,败育类型为典败和染败;自单核晚期开始3种不育小麦的小孢子发生紊乱;石蜡切片观察绒毡层细胞的变化,发现不育系均比保持系延迟一个时期在二核期发生解体,并于三核期完全降解;进一步检测细胞凋亡DNA小片段发现3种不育系花药绒毡层的DNA损伤均起始于单核晚期,绒毡层PCD比保持系延迟一个时期启动,并且优先细胞学表型检测到凋亡;生理指标测定和定量分析的结果说明绒毡层细胞的延迟凋亡和小孢子的结构异常与不育系花药内活性氧的过度积累、抗氧化酶活性的异常变化、非酶促抗氧化物质的严重下调以及部分抗氧化酶相关基因在两系花药中表达水平的严重差异密切相关。【结论】D2型细胞质雄性不育小麦败育的关键时期是单核晚期,绒毡层PCD的延迟启动诱导了活性氧的过量积累,进一步破坏了抗氧化防御系统的平衡,进而造成绒毡层细胞形态异常,最终导致D2型细胞质雄性不育小麦的败育。     

不同苦瓜品种皂苷含量组成及其抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶的抑制活性

【目的】比较不同品种苦瓜果肉中皂苷总含量、7种单体组成含量及抗氧化性和α-葡萄糖苷酶抑制活性差异,为明确苦瓜中主要皂苷单体组成含量,筛选高皂苷含量及高活性的苦瓜品种提供科学参考。【方法】采用香草醛-高氯酸法测定13个苦瓜品种皂苷总含量,高效液相法测定7种皂苷单体含量、总抗氧化能力指数(ORAC),并评价其抗氧化活性,采用4-硝基酚-2-D吡喃葡萄糖苷法测定α-葡萄糖苷酶抑制率,同时分析组成含量和活性之间的相关性。【结果】13个不同品种苦瓜果肉皂苷总含量呈显著性差异,含量变幅为(0.52—1.20)g/100g DW,平均值为0.79 g/100g DW,变异系数为21.65%。7种皂苷单体含量的平均值依次为:苦瓜苷A(Momorcharaside A)5.32μg·g-1 DW,苦瓜皂苷A(Momordicoside A)25.42μg·g-1 DW,Karaviloside XI 3.96μg·g-1 DW,苦瓜皂苷F2(Momordicoside F2)66.95μg·g-1 DW,苦瓜皂苷K(Momordicoside K)183.70μg·g-1 DW,(23E)-3β,7β,25-trihydroxycucubita-5,23-dien-19-al 40.13μg·g-1 DW,Kuguacin N 3.87μg·g-1 DW。不同品种苦瓜总皂苷ORAC指数变幅为2 747.76—15 584.07μmol Trolox·g-1,平均值为8 879.48μmol Trolox·g-1,变异系数为34.91%;α-葡萄糖苷酶IC50值变幅为1.55—4.96 mg·m L-1。【结论】不同品种苦瓜果肉皂苷总含量、单体组成含量、抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制率有显著差异。皂苷是苦瓜抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要物质基础,但并非苦瓜抗氧化活性主要贡献物质。(23E)-3β,7β,25-trihydroxycucubita-5,23-dien-19-al是主要活性单体。     

碱胁迫对小麦(Triticum aestivum Linn)叶片代谢过程的影响

【目的】阐明碱胁迫对小麦叶片离子平衡、初生及次生代谢产物的影响及其涉及的代谢途径,讨论其生长代谢变化规律及应答机制。【方法】以普通小麦(Triticum aestivum Linn)为材料,采用盆栽试验利用Na HCO_3﹕Na2CO_3=1﹕1混合模拟不同盐度碱胁迫条件,在苗期连续胁迫12 d后测定叶片生长、光合、离子和代谢产物。【结果】当碱胁迫强度超过小麦自身调节能力时,叶片中Na~+含量剧增,加上高p H危害,造成叶绿体遭到破坏、叶绿素含量降低、光系统Ⅱ活性受抑制、气孔导度及碳同化能力急剧下降,最终导致生长率降低。碱胁迫下Na~+大量增加的同时阴离子明显减少,造成叶片内负电荷亏缺和p H不稳定,导致离子平衡遭到破坏,进而引起一系列代谢途径的协变反应。通过GC-MS检测出73个代谢物,主要包括碳水化合物、氨基酸、有机酸等,其中,分别有25和48个代谢物在中度和重度碱胁迫下发生明显改变。主成分分析(PCA)结果显示全部样本均分布在95%的置信区间内,2个主成分得分达到89%。单因素方差分析表明,与对照组比较,在高浓度碱胁迫下发生的显著性变化明显高于低浓度碱胁迫。碱胁迫导致5种参与三羧酸(TCA)循环和6种参与糖酵解途径的代谢物含量明显降低,且引起大部分氨基酸(谷氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、天冬氨酸等)和糖类及多元醇(果糖、蔗糖、塔罗糖、肌醇等)大量降低。与此同时,碱胁迫诱导小麦有机酸大量积累,随胁迫强度的增加而上升,这种现象可能是小麦被动的适应调节过程,主要用于维持离子平衡并调节p H浓度。【结论】碱胁迫引起了TCA循环、糖酵解途径、卡尔文循环、莽草酸途径、细胞膜脂代谢、转氨基反应和γ-氨基丁酸(GABA)途径等代谢网络系统广泛变化,暗示了碱胁迫不仅对糖类、氨基酸类、脂肪和蛋白质合成代谢过程造成负面影响,而且限制C-N转变过程影响植物对N素的利用,造成营养匮乏抑制植物生长发育。     

β-葡聚糖酶水解小麦秸秆制备纤维寡糖的条件优化

【目的】探索商品化β-葡聚糖酶水解小麦秸秆制备纤维寡糖的最佳条件,为纤维寡糖的工业化生产提供科学依据。【方法】采用浓硫酸和浓盐酸混酸降解微晶纤维素制备纤维寡糖混合物,通过分离纯化得到聚合度为2—5的纤维寡糖单一组分。用所得纤维二糖作为标准品测定小麦秸秆酶解产物中的纤维二糖,并以纤维二糖含量和小麦秸秆转化率为衡量指标,研究酶解反应温度、pH、反应酶底比E/S、反应底物浓度、反应时间对寡糖生成的影响。【结果】采用活性炭柱层析法得到了高纯度的聚合度2-5的纤维寡糖单一组分;当酶解反应温度为50℃、pH为5.5、E/S为0.4、底物浓度为2%、时间10 h时酶解效果最好,小麦秸秆总转化率达到55.57%,纤维二糖得率为148.15 mg•g-1秸秆。【结论】活性炭柱层析可以很好地分离纤维寡糖,得到了聚合度为2—5的纤维寡糖单一组分;酶解小麦秸秆总转化率及纤维二糖得率均提高。