酵母双杂交筛选小麦TaMBD2互作蛋白

为探讨小麦甲基结合域蛋白(TaMBD2)在植物生长发育过程中的调控功能,以TaMBD2基因的全长cDNA为模板,构建诱饵载体pGBKT7-TaMBD2,利用酵母双杂交系统从小麦cDNA文库中筛选TaMBD2互作蛋白。结果共筛选到91个菌斑显蓝色的克隆,对其进行菌液PCR检测并测序,然后在NCBI上进行BLAST比对分析,共获得8个可能与TaMBD2互作的蛋白,分别为二磷酸核苷激酶(NDPK)、ENTH结构域蛋白、SIAN蛋白、Agenet结构域蛋白、C2H2型锌指蛋白、磷酸激酶和2个假定蛋白,其中最有可能的TaMBD2互作蛋白为NDPK。这些候选蛋白主要参与细胞信号传导、抗逆、能量代谢和蛋白质运输等。其中,检测结果中参与植物抗逆胁迫的蛋白质为主要互作蛋白,所占比例为54.9%;参与蛋白质运输的互作蛋白所占比例为25.3%,其余互作蛋白所占比例较小。因此,推测TaMBD2可能主要参与植物对干旱、低温和高盐等非生物胁迫逆境的响应及调控。     

鸡卵泡膜细胞中膜联蛋白A2互作细胞蛋白的筛选及其功能分析

【目的】从鸡卵泡膜细胞蛋白中筛选和鉴定与膜联蛋白A2（ANXA2）相互作用的细胞蛋白并进行功能分析,为深入研究ANXA2调控鸡卵泡发育的作用机制提供理论依据。【方法】制备开产后30周龄贵州黄鸡的卵泡膜细胞,提取卵泡膜总蛋白后利用His Pull-Down联合质谱技术（LC-MS/MS）从卵泡膜细胞中筛选出与鸡ANXA2互作的细胞蛋白,然后通过GO数据库和KEEG数据库分别进行GO功能富集分析及KEEG信号通路注释分析,并利用STRING Version 11.0绘制蛋白互作网络图。【结果】通过His Pull-Down联合LC-MS/MS共鉴定获得41个鸡ANXA2互作细胞蛋白,GO功能富集分析发现这些互作细胞蛋白在分子功能、生物学进程和细胞组成均发挥作用。其中,在分子功能方面主要涉及蛋白结合（占58.06%）、催化活性（占19.35%）、核糖体结构（占16.13%）及细胞骨架结构组成（占6.45%）,在生物学进程方面主要参与细胞骨架（占19.35%）、刺激反应（占19.35%）、翻译（占16.13%）、代谢过程（占12.90%）、细胞迁移（占12.90%）、蛋白折叠（占9.68%）和蛋白运输（占9.68%）,而细胞组分显示以定位于细胞膜的蛋白为主（占32.26%）。鸡ANXA2蛋白互作细胞蛋白参与的KEEG信号通路主要有应激反应、代谢、翻译、信号转导、免疫系统和蛋白定位等。鸡ANXA2互作细胞蛋白互作网络可分为3条,即CNN2-FN1-MYH9-MYH10-ACTN1-CSRP1、ANXA1-ANXA2-ENO1-PRDX4-GPI-ATP5B-PRDX3-HSPA8-TUBB2A和CCT7-CCT4-GNB2L1-ATP5A1-RPS3-RPS3A-RPL23A-RPL22-RPS7;互作细胞蛋白间存在复杂的互作关系,其中又以膜联蛋白A1（ANXA1）与烯醇化酶-1（ENO1）及ANXA2的互作关系最明显。【结论】鸡ANXA2互作细胞蛋白主要参与细胞骨架形成、应对刺激和翻译等生物学过程,涉及应激反应、代谢、翻译、信号转导、免疫及蛋白定位等信号通路。其中,PRDX3、PRDX4、MYH9和TCSC可能通过与ANXA2蛋白相互作用而参与鸡卵巢相关疾病的发生,而ANXA1与ANXA2相互作用可能在鸡卵泡的发育及排卵过程中发挥重要调节作用。     

苹果光响应转录因子MdHY5表达及蛋白互作分析

【目的】克隆苹果光响应过程中关键的bZIP（basic-leucine zipper）转录因子MdHY5,并进行表达分析及蛋白互作检测,为阐述苹果中MdHY5在光信号过程中的功能及作用机制奠定基础。【方法】对苹果中具有bZIP保守结构的基因设计半定量引物进行表达分析,筛选具有光响应的bZIP转录因子。对光响应的bZIP家族基因进行BLAST比对,根据同源比对分析将目的蛋白命名为MdHY5,同时对cDNA序列设计引物进行克隆;利用MEGA5软件将MdHY5蛋白与拟南芥基因组中所有的bZIP转录因子家族成员进行聚类分析,同时对蛋白进行保守结构域分析;取苹果各组织材料进行MdHY5时空表达分析;通过对MdHY5启动子序列进行预测分析,并结合拟南芥同源基因芯片数据,进一步利用RT-PCR与半定量PCR检测MdHY5对不同光质的表达响应。将MdHY5连接到原核表达载体PGEX-4T-1上,利用IPTG对转化的大肠杆菌BL21融合蛋白进行诱导表达、蛋白杂交检测,并进行蛋白纯化;利用pull down试验验证MdHY5与MdCOP1蛋白的互作。【结果】通过光响应分析,在苹果中筛选到一个bZip转录因子家族成员,聚类分析显示MdHY5基因与拟南芥AtHY5同源性最高,该基因位于苹果基因组12号染色体上,基因编号为MDP0000586302,与拟南芥AtHY5结构相似,MdHY5也含有4个外显子,3个内含子。该基因cDNA序列长度为1 112 bp,其中5′非编码区长度为214 bp,3′非编码区长度为403 bp,开放阅读框长度为495 bp,编码一个含有164个氨基酸残基的蛋白。蛋白保守域分析显示,MdHY5蛋白C端含有一个典型的亮氨酸拉链结构（bZIP domain）,其中在bZIP结构域的N端含有一个核定位信号区域（NLS domain）。时空表达分析显示MdHY5在各组织中均表达,其中叶片中表达水平最高,花和种子中表达水平较低。利用PLACE对启动子进行了顺式作用元件分析发现,MdHY5启动子上含有G-box、GT-1-box、I-box等多个光响应的作用元件,而定量表达分析显示MdHY5能够被白光、蓝光、紫外光诱导,而红光对MdHY5表达没有明显影响。将构建好的融合蛋白表达载体转化BL21并进行蛋白诱导,菌体经超声波破碎后显示,融合蛋白主要在上清中存在。将诱导的MdHY5-GST蛋白分别与MdCOP1-HIS及pET-HIS蛋白孵育进行pull down试验,结果显示,MdHY5在体外能够与MdCOP1蛋白互作。【结论】MdHY5为光诱导的bZIP转录因子,是拟南芥光形态建成关键转录因子AtHY5的同源基因,与AtHY5具有类似的基因与蛋白结构,在叶中表达量最高,同时对多种光质具有表达响应,能够与MdCOP1互作。     

大豆锌指转录因子GmDi19-5对高温的响应及互作蛋白的筛选

【目的】高温胁迫已经成为威胁作物生长发育的主要非生物胁迫因素之一,转录因子在植物非生物胁迫响应中起着重要作用。通过对大豆锌指转录因子基因Gm Di19-5在高温胁迫下的响应和功能鉴定,以及利用酵母双杂交技术从大豆c DNA文库筛选与其互作的候选蛋白,研究Gm Di19-5对高温胁迫的响应机制。【方法】以大豆c DNA为模板,利用实时荧光定量PCR检测Gm Di19-5在高温处理不同时间段的表达模式;通过Plant CARE和PLACE数据库预测Gm Di19-5启动子元件,并对Gm Di19-5启动子转基因拟南芥在高温处理下进行的组织化学染色,分析Gm Di19-5启动子在高温胁迫下的活性;构建p GBKT7-Gm Di19-5诱饵载体,验证自激活活性;利用酵母双杂交技术,以p GBKT7-Gm Di19-5为诱饵筛选大豆c DNA文库,筛选与其互作的候选蛋白;进一步用酵母双杂交系统验证Gm Di19-5与候选蛋白的互作;利用实时荧光定量PCR检测候选蛋白基因在对高温处理的响应情况;构建融合表达载体,用GFP-Gm Di19-5融合表达载体转化拟南芥原生质体,检测Gm Di19-5蛋白的亚细胞定位情况。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,Gm Di19-5在高温胁迫下上调表达;启动子元件分析表明,Gm Di19-5包含多种与胁迫应答相关的顺式作用元件,包括热响应元件HSE;组织化学染色分析发现,经高温处理后,过表达拟南芥幼苗的地上部分和地下部分均有报告基因的表达;亚细胞定位结果表明,Gm Di19-5蛋白定位于拟南芥原生质体的细胞核中;通过酵母双杂交技术筛选到了与Gm Di19-5互作的候选蛋白,试验进一步验证了Gm Di19-5与Gm Dna J在酵母细胞中互作;另外,实时荧光定量PCR结果显示,互作蛋白基因Gm Dna J受高温胁迫诱导表达。【结论】Gm Di19-5受高温诱导表达,Gm Di19-5可能与Gm Dna J互作,表明Gm Di19-5功能的发挥可能需要Gm Dna J的参与。     

茶树CsHIPP26.1互作蛋白的筛选与验证

【背景】‘黄金芽’属于光照敏感型黄化茶树（Camellia sinensis）品种,叶片色泽呈现强光黄化、弱光复绿的特点,但叶色响应光照的黄化机制并不明确。前期通过对黄化叶片、遮阴复绿叶片以及常绿品种叶片的蛋白组研究发现,重金属相关异戊二烯化植物蛋白CsHIPP26.1（TEA000549）的表达响应光照强度,表明CsHIPP26.1可能参与调控‘黄金芽’叶色黄化的光响应过程。【目的】通过筛选与CsHIPP26.1互作的光信号响应相关的蛋白,为叶片色泽响应光照信号变化提供科学依据。【方法】以‘黄金芽’茶树1芽2叶为材料进行CsHIPP26.1和互作基因的克隆,经酵母双杂交筛库,然后将筛选得到的目的蛋白进行酵母双杂交点对点验证、体内双分子荧光互补（BiFC）和体外pull-down等技术进行蛋白互作的进一步验证。【结果】通过酵母双杂交对茶树cDNA文库进行筛选,共筛选到26个候选互作蛋白,主要集中在细胞组分、结合以及催化活性方面发挥作用,其中生物素合成代谢过程富集程度较高,与光信号通路及叶绿素合成相关的蛋白只有编号为TEA026466.1的bHLH30转录因子。克隆bHLH30转录因子后发现,该转录因子与茶树光信号传导途径蛋白PIF4处于同一进化树分支,且含有与茶树PIF4蛋白相同的HLH和ACT结构域,将该bHLH30转录因子命名为CsPIF4.2,GenBank登记号为MW116834。进一步通过体外Pull-down蛋白互作和体内双分子荧光互补（BiFC）验证发现,CsHIPP26.1和CsPIF4.2蛋白能够发生互作,并且发生互作的部位在细胞核内。【结论】初步筛选出26个与CsHIPP26.1互作的蛋白,并验证发现CsHIPP26.1能够在细胞核内与其中一个光敏色素互作因子CsPIF4.2发生蛋白相互作用。     

小麦TaDREB6转录因子互作蛋白的筛选

 【目的】利用酵母双杂交技术从小麦cDNA文库中筛选TaDREB6互作蛋白,进一步研究DREB介导的小麦抗逆机制。【方法】以小麦的cDNA为模板扩增得到TaDREB6,构建小麦cDNA文库和pGBKT7-TaDREB6诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaDREB6以及pGADT7和cDNA文库混匀转入AH109酵母感受态细胞,在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp营养缺陷型培养基上,30℃培养3—5 d,挑取平板上直径大于2 mm的菌落,进行显蓝筛选。【结果】对筛选到的102个候选阳性克隆进行测序,在NCBI上进行BLAST比对分析,获得与能量代谢、抗逆和防御、转运、转录和翻译、信号转导以及生长发育等相关的候选蛋白。【结论】筛选得到候选蛋白的功能预测表明TaDREB6可能参与了多条信号转导途径,在抗逆境调控中具有重要作用。     

稻瘟病菌无毒效应因子Avr-PikD与水稻蛋白OsDjA9的互作鉴定

【目的】对从水稻cDNA文库中筛选出的一个候选互作蛋白OsDjA9与Avr-PikD的互作关系进行鉴定,以期获得稻瘟病菌无毒效应因子Avr-PikD的水稻靶标。【方法】通过酵母双杂交、pull-down、Co-IP、荧光素酶互补成像试验及水稻原生质体中的共定位分析来验证Avr-PikD与OsDjA9的互作关系,并进一步借助酵母双杂交鉴定OsDjA9中参与互作的关键结构域。【结果】Avr-PikD在体外及体内条件下均能与OsDjA9发生相互作用,且OsDjA9所含DnaJ结构域是其与Avr-PikD互作所必需的。【结论】在稻瘟病菌侵染水稻的过程中,水稻OsDjA9蛋白是稻瘟病菌无毒效应因子Avr-PikD的一个作用靶标。     

小麦蛋白激酶TaMAPK2互作蛋白的筛选与验证

【目的】利用构建的干旱胁迫处理的小麦cDNA文库,通过酵母双杂系统筛选与小麦TaMAPK2互作的蛋白,并对其进行验证分析。【方法】以小麦cDNA为模板克隆得到TaMAPK2,构建pGBKT7-TaMAPK2诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaMAPK2质粒以及pGADT7和小麦cDNA文库共转化酵母AH109菌株感受态细胞,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基上30℃培养3-5 d,挑选单克隆于YPDA培养基中培养,吸取1 μL各候选克隆的菌液点至于SD/Raf/Gal/x-gal平板上培养,筛选蓝色单克隆。将筛出的单克隆经测序、序列比对分析,初步获得与TaMAPK2互作的候选蛋白。采用双酶切的方法构建pGADT7-HSP90以及pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90双分子荧光互补表达载体,将重组载体质粒pGADT7-HSP90和pGBKT7-TaMAPK2共转化AH109酵母感受态细胞,利用酵母双杂交的方法验证TaMAPK2与候选蛋白HSP90的相互作用;采用PEG-Ca2+介导法将双分子荧光互补表达载体pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90共转化小麦原生质体细胞,激光共聚焦显微镜下观察相互作用产生的YFP荧光信号。根据HSP90的保守序列设计特异引物,在SYBR Green Ⅰ的检测模式基础上,构建HSP90的实时荧光定量PCR检测体系,检测HSP90在不同胁迫处理以及不同组织的小麦植株中的表达量。【结果】通过对候选蛋白的初步分析表明这些候选蛋白主要参与植物体的信号转导或免疫过程,表明TaMAPK2在植物的逆境信号转导、基因转录调控过程中发挥着重要作用。通过酵母双杂交显蓝系统和双分子荧光互补技术（BiFc）进一步确认HSP90与TaMAPK2的互作关系。HSP90定位在细胞核、细胞膜以及细胞质中,且在植物的根茎叶中均有表达,在根中的表达量最高。通过实时荧光定量PCR分析显示,HSP90基因受到高温、低温、高盐和ABA胁迫后表达量上调。【结论】HSP90作为分子伴侣,在降解这些受损或异常蛋白以及调控抗逆相关转录因子表达的过程中发挥着重要的作用。非生物胁迫会引起植物体内一些受损或异常蛋白聚合物的积累,HSP90能通过折叠已损坏的蛋白底物以及构象的维持来保持细胞的完整性。表明在植物逆境信号转导过程中,TaMAPK2功能的发挥可能需要HSP90蛋白的参与。     

拟南芥NBS1互作蛋白的筛选和鉴定

【目的】筛选拟南芥中NBS1的互作蛋白,探究NBS1蛋白的新功能,为后续研究奠定基础。【方法】利用酵母双杂交技术筛选拟南芥c DNA文库,对得到的序列进行BLAST比对、亚细胞定位分析和基因本体注释。【结果】共有221个阳性克隆,测序后通过BLAST比对得到97个与NBS1互作的蛋白,包括膜蛋白、转运蛋白和折叠蛋白等,它们主要定位于细胞质、细胞核和叶绿体等,主要富集于4个分子功能、5个细胞组分和13个生物过程。【结论】拟南芥中与NBS1互作的蛋白在刺激响应、信号转导和细胞代谢等方面发挥着重要作用,也证明NBS1是一种多功能蛋白,但其功能及分子机制还需进一步研究。     

红肉苹果MdMKK9互作蛋白的筛选与鉴定

MKK9是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族重要成员之一,是在植物细胞响应外界胁迫信号转导中发挥重要作用的酶。为深入研究苹果MKK9的相关功能,以红肉苹果‘黛红’为材料,克隆到MdMKK9基因CDS序列,利用酵母双杂交试验筛选苹果cDNA文库,并通过酵母双杂交筛选、体内双分子荧光互补(BiFC)和体外Pull-down试验进行MdMKK9互作蛋白验证。结果表明,通过对苹果cDNA文库的筛选,共获得11个参与调控植物生长发育及应答逆境胁迫的候选互作蛋白;选取花青苷合成相关蛋白MdCHS及氮胁迫调控相关蛋白MdSPX3进行酵母双杂交、体内BiFC及体外Pull-down试验,结果证明MdMKK9可与MdSPX3互作。     

小麦锌指转录因子TaDi19A对低温的响应及其互作蛋白的筛选

【目的】锌指类转录因子在植物逆境信号转导和非生物胁迫响应中发挥重要的作用。通过对小麦锌指转录因子基因Ta Di19A的耐冷性能进行鉴定,利用酵母双杂交技术筛选并获得与Ta Di19A互作的候选蛋白,以解析Ta Di19A介导的抗逆调控机制。【方法】通过对低温处理的小麦转录组测序结果进行分析,获得一个锌指类转录因子Ta Di19A。利用生物信息学的方法分析Ta Di19A的分子特性,用SMART在线工具进行蛋白结构分析;用GSDS和PHYRE2在线工具分别对Ta Di19A结构和蛋白三级结构进行分析;用Net Phos 2.0 Server数据库预测Ta Di19A蛋白磷酸化位点。以低温处理的小麦c DNA作为模板,通过SYBR Green染料法进行实时荧光定量PCR,检测Ta Di19A在低温处理不同时间段的表达模式。构建植物表达载体p BI121-Ta Di19A,通过花序侵染法转化拟南芥,用T3代拟南芥进行耐冷性鉴定,分析低温处理对转基因拟南芥的根长、鲜重和存活率的影响。检测转Ta Di19A拟南芥中抗逆相关基因表达变化,分析Ta Di19A调控植物耐冷性的作用机制。构建诱饵载体p GBKT7-Ta Di19A,验证自激活活性;利用酵母双杂交技术,将诱饵载体p GBKT7-Ta Di19A和小麦c DNA文库共转化酵母AH109感受态细胞,通过SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade和X-α-gal显蓝反应筛选得到阳性克隆,测序和BLAST分析获得候选蛋白。【结果】小麦Ta Di19A编码区全长747 bp,编码248个氨基酸,分子量为28.03 k D,等电点为4.74,基因含4个外显子,3个内含子。Ta Di19A蛋白靠近N-端包含锌指结合结构域,C端为Di19结构域,预测的Ta Di19A蛋白三级结构包含2个α螺旋结构。磷酸化位点分析结果显示Ta Di19A蛋白含有12个丝氨酸、9个苏氨酸和3个酪氨酸磷酸化位点。实时荧光定量PCR结果显示,Ta Di19A受低温胁迫诱导表达。正常生长条件下,转基因和野生型拟南芥没有明显差异,低温处理下,转基因拟南芥的根长明显大于野生型拟南芥,并且耐冷性强于野生型拟南芥。下游基因检测结果表明,低温处理后,CBL1、CBL2和KIN1等冷胁迫响应相关基因在野生型和转基因植株中表达量都升高,在转基因植株中的表达量显著高于野生型,表明Ta Di19A可能通过调节下游冷胁迫响应相关基因的表达提高转基因植物的耐冷性。通过对酵母双杂交系统筛选到的候选互作蛋白进行初步分析表明,这些候选互作蛋白主要参与植物体的信号转导和非生物胁迫响应过程,表明Ta Di19A在植物的逆境信号转导及非生物胁迫响应过程中发挥着重要作用。【结论】小麦Ta Di19A受低温诱导表达,过表达能够提高转基因拟南芥的耐冷性;而Ta Di19A功能的发挥可能需要其他蛋白的参与。     

葡萄类钙调磷酸酶B亚基互作蛋白激酶VvCIPK10的特性与表达

【目的】在葡萄中克隆丝苏氨酸蛋白激酶Vv CIPK10,分析其激酶特性和在逆境胁迫下的表达模式,为进一步研究该基因参与逆境胁迫的分子功能,探讨葡萄抗逆分子机制提供理论依据。【方法】利用电子克隆技术获得Vv CIPK10序列,设计特异引物进行RT-PCR反应,对克隆到的序列进行开放阅读框和保守结构域分析;构建原核表达载体,转化表达菌株后用IPTG进行诱导表达,收集菌体后裂解细胞,制备蛋白上样液,SDS-PAGE电泳对表达产物进行分析,同时对融合蛋白进行可溶性分析;IPTG大量诱导表达融合蛋白,收集菌体后进行超声破碎细胞,用麦芽糖结合蛋白纯化柱纯化MBP-Vv CIPK10融合蛋白,SDS-PAGE电泳进行分析;纯化后的融合蛋白与体外自磷酸化缓冲液进行自磷酸化反应,反应后SDS-PAGE电泳,压磷屏检测体外自磷酸化反应;构建重组瞬时表达载体p BI221-GFP/Vv CIPK10;分离拟南芥原生质体,通过PEG介导的瞬时转化方法将重组表达载体p BI221-GFP/Vv CIPK10转化至原生质体;通过基因枪介导的转化方法将重组表达载体p BI221-GFP/Vv CIPK10转化至洋葱表皮细胞,培养16 h后用激光共聚焦显微镜进行荧光信号检测;选择生长相对一致且健壮的葡萄植株,于干旱、低温和盐胁迫处理后不同时间取样,同时在田间取葡萄不同组织样品,实时荧光定量PCR检测Vv CIPK10在葡萄不同组织中的表达以及在不同逆境胁迫下的表达模式。【结果】PCR克隆获得葡萄Vv CIPK10全长为1 357 bp,5′端非编码区为30 bp,3′端非编码区为156 bp,开放阅读框为1 171 bp,编码436个氨基酸,理论等电点为8.59,分子量为48.7 k Da。保守结构域预测分析显示该蛋白5′端具有一个激酶结构域,3′末端具有一个PPI结构域和一个NAF结构域。BLSATP分析表明葡萄Vv CIPK10与桃树CIPK(XP_007205151)一致性最高(74%)。重组表达载体p MAL-C5X/Vv CIPK10在大肠杆菌中经诱导表达获得与理论分子量(43 k Da+48.7 k Da)相一致的融合蛋白。MBP-Vv CIPK10融合蛋白经柱纯化后获得单一的蛋白条带,Vv CIPK10的自磷酸化活性依赖于Mn~(2+),不依赖于Mg~(2+)和Ca~(2+),EDTA可以抑制Vv CIPK10的自磷酸化活性。亚细胞定位结果显示,Vv CIPK10定位在细胞核、细胞膜和细胞质。Vv CIPK10在葡萄各个组织中均有表达,主要在葡萄根和叶片中大量表达,葡萄茎、花序、果实和卷须中的表达量较低。在干旱、低温和盐胁迫处理后,Vv CIPK10呈现受诱导表达模式。Vv CIPK10的表达在低温胁迫后6 h达到峰值,干旱和盐胁迫后2 h即达到峰值。【结论】葡萄Vv CIPK10能够响应干旱、低温和盐胁迫,推测Vv CIPK10在葡萄抗非生物逆境胁迫中具有重要作用。     

根施褪黑素对NaCl胁迫下葡萄内源褪黑素及叶绿素荧光特性的影响

【目的】研究NaCl胁迫下内源褪黑素（melatonin,MT）及其关键代谢物的响应以及施加外源MT对NaCl胁迫下葡萄叶片的光抑制缓解作用,为MT的应用提供参考。【方法】以一年生盆栽‘威代尔’葡萄（Vitis vinifera cv. Vidal Blanc）为试材,进行100 nmol·L^-1 NaCl和100 nmol·L^-1 NaCl+MT处理,测定不同处理植株、不同器官内源MT、MT合成前体物质5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）和MT的主要代谢产物2-羟基褪黑素（2-Hydroxymelatonin,2-OHMel）的含量,分析根施MT对NaCl胁迫下叶片叶绿素荧光特性及内源MT代谢的影响。【结果】受NaCl胁迫后,植株不同器官的内源MT、5-HT及2-OHMel与清水对照相比有明显的时空变化,胁迫7 d时以根系的MT含量最高,其次是嫩梢,成叶中的最低;随着胁迫时间的延长,根系中的MT含量大幅度下降,而嫩梢中的5-HT含量增加。根施外源MT后与单纯的NaCl胁迫相比,显著提高了前期成叶中的5-HT含量以及后期新根中的MT含量,嫩梢和成叶中2-OHMel的含量。NaCl胁迫后快速叶绿素荧光曲线（OJIP）形状发生明显改变,最大荧光（F_m）及叶片最大光化学效率（F_v/F_m）显著下降了31.6%和11.6%,非光化学淬灭（NPQ）显著升高,光系统I（PSI）和光系统II（PSII）的线性电子传递速率ETR（I）和ETR（II）均显著下降;而根施MT后,叶片F_m和F_v/F_m的分别升高了12.9%和7.3%,OJIP曲线中K点和J点分别下降了23.6%和11.3%,增加了叶片对光能的利用效率,线性电子传递速率明显提高。【结论】NaCl胁迫严重抑制葡萄叶片光系统活性,但促进了植株中褪黑素的合成;根施MT缓解了光系统活性的抑制程度,促进MT在植株各器官中的代谢和分配,缓解NaCl胁迫对葡萄叶片光合作用的伤害程度。     

马铃薯品种耐弱光性评价及其指标的筛选

【目的】近年来,弱光胁迫逐渐成为冬作、保护地和间套作栽培马铃薯生产的重要限制因素。通过筛选马铃薯耐弱光性鉴定指标,评价不同品种的弱光耐受性,为马铃薯耐弱光品种选育和冬作马铃薯产业发展及马铃薯间套作栽培提供科学依据。【方法】采用大田试验,以10个马铃薯品种为供试材料,齐苗后用遮阳率为70%的遮阴网进行全生育期遮阴处理,以自然光照为对照。初花期测定株高、节间长、叶面积等形态指标,叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素等色素含量指标和净光合速率、气孔导度、蒸腾速率等光合生理指标,收获后测产并计算单株块茎重。通过计算马铃薯各品种耐弱光系数、耐弱光指数和各指标胁迫指数,使各指标间具有可比性。以耐弱光系数和耐弱光指数闭区间扩展值对各马铃薯品种耐弱光性进行评价,将各指标胁迫指数分别与耐弱光系数和耐弱光指数进行相关性分析,筛选出具有显著相关的指标。【结果】与对照相比,遮阴处理后马铃薯在形态、生理和产量等方面均发生改变:株高增加,节间伸长,叶面积增大;叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量增加,叶绿素a/b值减小,类胡萝卜素含量总体呈增加趋势;净光合速率、瞬时水分利用效率、气孔导度显著下降,蒸腾速率显著增加,胞间CO2浓度呈增加趋势;单株块茎重显著减少,减产幅度达62.14%—90.74%。根据耐弱光系数和耐弱光指数评价马铃薯耐弱光性结果基本一致,但耐弱光指数不仅反映了马铃薯产量对遮阴胁迫的敏感性,同时也反映了不同基因型差异对产量的影响,较耐弱光系数评价方法严格。叶面积、单株块茎重、叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素胁迫指数6个指标与耐弱光系数或耐弱光指数呈显著或极显著相关,可以作为马铃薯耐弱光性有效鉴定指标。【结论】中薯20高度耐弱光,woff中度耐弱光,费乌瑞它和会-2低度耐弱光,其余品种均不耐弱光。以耐弱光系数和耐弱光指数为主要鉴定指标,并结合与之显著相关的形态、生理和产量等指标对马铃薯耐弱光性进行综合评价较为客观、可靠,而且方便易行。     

谷子转录因子基因SibZIP42在拟南芥中对高盐和ABA的响应

【目的】分析谷子抗逆相关转录因子基因Sib ZIP42的特性和生物学功能,探讨Sib ZIP42提高植物耐盐性的调控途径,为作物抗逆分子育种提供新的候选基因。【方法】利用生物信息学方法分析谷子Sib ZIP42的特性:使用Clustal X 2.0和MEGA 5.05软件对谷子Sib ZIP42蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建系统进化树;从数据库Phytozome获取谷子Sib ZIP42上游2 000 bp作为启动子序列,在PLACE数据库对Sib ZIP42启动子顺式作用元件进行分析;使用Net Phos 2.0 Server数据库预测Sib ZIP42蛋白磷酸化位点;利用实时荧光定量PCR检测Sib ZIP42在不同胁迫条件下的表达模式;将Sib ZIP42与绿色荧光蛋白GFP融合表达,检测Sib ZIP42蛋白的亚细胞定位情况;构建植物表达载体p BI121-Sib ZIP42,转化拟南芥并检测转Sib ZIP42拟南芥的耐盐性及对ABA处理的敏感性。分析转Sib ZIP42拟南芥中ABA及脱水响应相关基因表达变化,分析Sib ZIP42调控植物耐盐性的作用机制。【结果】谷子Sib ZIP42全长546 bp,编码由181个氨基酸组成的亲水性蛋白,分子量约为20.3k D,基因编码区包含1个外显子;系统进化树分析表明该基因位于b ZIP基因家族的S亚组;Sib ZIP42与拟南芥Atb ZIP42序列同源性最高;启动子元件分析表明,Sib ZIP42包含ABRE、MYB、MYC等多种逆境胁迫应答相关元件;磷酸化位点分析结果显示Sib ZIP42含有14个丝氨酸、4个酪氨酸和1个苏氨酸磷酸化位点;实时荧光定量PCR结果显示,Sib ZIP42对多种非生物胁迫均有不同程度的响应,在高盐、干旱(PEG)和ABA处理条件下表达量明显上升,Sib ZIP42在根部的表达量显著高于在茎及叶子中的表达;亚细胞定位结果表明,Sib ZIP42蛋白定位于细胞核中;基因功能分析结果显示,在正常MS培养基上,野生型拟南芥WT和Sib ZIP42转基因拟南芥的萌发率基本一致,在Na Cl浓度为90、120和150 mmol·L~(-1)的MS培养基上,转基因拟南芥萌发率显著高于WT,在90 mmol·L~(-1) Na Cl处理条件下,转基因拟南芥的绿化率显著高于WT;在ABA浓度为0.5、1和2μmol·L~(-1)的MS培养基上,转基因拟南芥的绿化率显著低于WT;下游基因检测结果表明,HIS1-3、RD29B和RAB18等ABA胁迫响应相关基因以及脱水响应相关基因At PIP2A在转基因植株中表达量显著高于在WT中的表达,表明Sib ZIP42可能通过ABA信号途径提高植物对高盐胁迫的耐性。【结论】与WT相比,Sib ZIP42转基因拟南芥株系在种子萌发时期耐盐性显著提高。同时,在种子萌发后期Sib ZIP42转基因株系相比于WT对ABA处理的敏感性增强,Sib ZIP42可能通过ABA信号途径正向调控植物的耐盐性。     

响应月季花朵衰老的RhRRs基因筛选及表达特性分析

为筛选响应月季花朵衰老的RhRRs基因以及分析其表达特性,采用RT-PCR,RACE PCR以及MEGA等生物技术方法,检测了RhRRs基因在月季花朵不同开放阶段的表达谱,克隆了Rh39694基因全长,开展了进化树分析.结果表明,RU39694与RU12149的表达谱受月季花朵衰老显著抑制;其中RU39694基因全长1 292 bp,开放阅读框(ORF)为738 bp,编码245个氨基酸,含有A类RRs蛋白特有的DDK基序,蛋白分子式为C_(1176)H_(1912)N_(324)O_(401)S_(12),分子量为27.39 kDa,等电点(pI)为4.88; RU39694蛋白与拟南芥ARR8,ARR9亲缘关系最近,被命名为RhRR9;此外,RhRR9的表达谱受外源细胞分裂素(6-BA)处理显著诱导,而被脱落酸(ABA)与乙烯(C_2H_4)处理显著抑制,推测可能在植物激素(细胞分裂素、脱落酸、乙烯)拮抗调控月季花朵衰老中发挥重要功能.     

烟粉虱溶菌酶基因的鉴定及表达分析

【目的】鉴定烟粉虱（Bemisia tabaci）体内的溶菌酶基因,并对其序列特征、进化关系和表达模式进行分析,探索该基因在烟粉虱应对球孢白僵菌侵染过程中的作用,为进一步解析烟粉虱先天免疫过程提供理论依据。【方法】以第2代高通量测序的结果为依据,比对非冗余核苷酸数据库,筛选E值＜10^-5的基因为烟粉虱溶菌酶基因（lysozyme gene of Bemisia tabaci,BtLyz）,利用ORF Finder预测BtLyz的开放阅读框,并得到氨基酸序列;利用Pfam和SMART预测BtLyz的蛋白质结构域;利用SinglP 4.1 Server预测BtLyz序列的信号肽;利用MEGA6.0软件进行BtLyz的氨基酸多序列比对;利用MEGA6.0软件,对BtLyz与其他昆虫的31个同源蛋白序列进行系统进化分析,并利用邻接法构建系统进化树来进一步分析鉴定该基因;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析球孢白僵菌侵染烟粉虱卵、若虫、成虫后,在12、24、36、48、60 h时目标基因的时空表达模式。【结果】鉴定出烟粉虱4个溶菌酶基因,分别命名为BtLyz1、BtLyz2、BtLyz3和BtLyz4,基因序列全长分别为1 819、1 149、829和928 nt,分别编码159、160、148和160个氨基酸,且均含有信号肽。蛋白质结构分析、氨基酸序列比对和系统进化分析发现,BtLyz1和BtLyz4属于i型溶菌酶,BtLyz2和BtLyz3属于c型溶菌酶。BtLyz-1与豌豆长管蚜ApLyz-i1位于同一进化支上,BtLyz4与柑橘木虱DcLyz-i3和豌豆长管蚜ApLyz-i2位于同一进化支上。BtLyz2和BtLyz3与褐飞虱NlLyz-c1和异色瓢虫HaLyz-c3位于同一进化支上。与对照相比,卵期4个溶菌酶基因和若虫期BtLyz4的相对表达量没有显著变化;若虫期BtLyz1的相对表达量先上调再下调,而后又有所上调的波动趋势,24 h时上调表达最明显,为对照组的4.55倍;成虫期BtLyz1和BtLyz4的相对表达量均为先上调再下调,而后又有所上调的波动趋势,60 h时上调表达最明显,为对照组的11.31和4.21倍;若虫期BtLyz2和BtLyz3的相对表达量均为先上调再下调表达,在诱导24 h时上调表达最明显,为对照组的5.09和8.31倍,而后急剧下调,在60 h时下调表达最明显,为对照组的0.19和0.13倍;成虫期BtLyz2和BtLyz3的相对表达量均为先上调再下调的表达趋势,在24 h时上调最明显,为对照组的5.56和8.84倍。【结论】从烟粉虱体内鉴定了4个溶菌酶基因序列,其中2个为c型溶菌酶序列,2个为i型溶菌酶序列;在球孢白僵菌侵染烟粉虱不同虫态、不同时间后,卵期的相对表达量与对照相比没有显著变化;在若虫和成虫期,不同BtLyzs表现出不同的表达趋势。4个BtLyzs可能参与了烟粉虱对真菌侵染的免疫反应,有可能成为烟粉虱生物防治的潜在新靶标。     

玉米大斑病菌漆酶基因Stlac2结构分析及原核表达

【目的】对玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)漆酶基因Stlac2进行生物信息学分析,推测其蛋白功能,探究木质素降解过程中产生的小分子物质对Stlac2表达的影响,并对其进行克隆及原核表达,以便深入研究该基因在病菌生长、发育及致病过程中的作用。【方法】通过NCBI查询获得玉米大斑病菌EOA90070(Stlac2)基因的全序列,通过Clustal X与马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)PbrB(PMAA_082060)基因、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)Abr2(AFUA_2G17530)基因、构巢曲菌(Aspergillus nidulans)YA(AN6635)基因等漆酶家族基因进行蛋白序列比对,查看Stlac2中的铜离子结合位点,利用在线软件SOPMA和ProtParam对其二级结构及理化性质进行检测,通过SWISS-MODEL对Stlac2蛋白质的三维结构进行预测,采用SAVES对三维结构进行评价。通过对ABTS的氧化试验确定木质素降解过程中产生的小分子物质对玉米大斑病菌漆酶产量的影响;利用RT-qPCR方法分析小分子物质对Stlac2表达规律的影响;采用原核表达系统,以pET-30a表达载体为框架,对其进行原核表达,并将表达蛋白纯化,以ABTS为底物,420 nm下检测漆酶活性。【结果】Stlac2具有典型的Cu离子结合位点,与漆酶典型的Cu离子结构域相似。其蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲所占比例分别为18.59%、25.63%、11.91%和43.86%,分子量为61.64 k D,等电点为5.00,平均疏水性为-0.37,表明其为亲水蛋白。当在PDA中添加0.01 g·L~(-1)香草醛、4-羟基苯甲醛、丁香醛、香草酸、4-羟基苯甲酸和香兰素时,玉米大斑病菌胞外漆酶的产量为香草酸香兰素4-羟基苯甲醛4-羟基苯甲酸丁香醛对照。而在4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲酸存在时,玉米大斑病菌Stlac2的相对表达量明显升高,约为对照的5—8倍。利用原核表达系统,在67 k D处成功诱导表达出一条特异性蛋白条带,大量表达纯化后,漆酶活性为(40.7±0.3)U·L~(-1)。【结论】阐明了Stlac2的生物信息学特性,初步断定其为漆酶基因;4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲酸可显著提高Stlac2相对表达量,表明其在木质素降解过程中起到了一定的作用;该基因所编码的蛋白可通过pET-30a原核表达系统表达,体外漆酶活性可达(40.7±0.3)U·L~(-1),该研究结果为后期研究蛋白性质打下了基础。