橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库的构建与EST测序分析

 【目的】构建橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库,降低胶乳中存在的高丰度表达基因的拷贝数,提高胶乳表达基因的分离鉴定和EST测序分析效率。【方法】以橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳为材料,将胶乳全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了橡胶树胶乳的非剪切型全长cDNA原始文库,经检测原始文库的滴度为6.0×106 cfu/mL,平均插入片段长度大于1.5 kb,重组率约为100%,全长cDNA比例约为76%;利用基因组DNA饱和杂交技术对胶乳原始cDNA文库进行均一化处理,构建橡胶树胶乳的均一化全长cDNA文库。【结果】胶乳均一化全长cDNA文库的总库容量(总CFU)为1.87×105,重组率大于95%。定量RT-PCR检测表明,橡胶树胶乳2个高丰度表达基因,即小橡胶粒子蛋白(SRPP)和橡胶延长因子(REF)基因,在均一化cDNA文库中的表达量均下降了约1 000倍。【结论】构建了均一化效果良好的橡胶树胶乳全长cDNA文库,并对文库中随机的12 000个克隆进行了测序,获得高质量的有效EST(expressed sequence tag)序列为11 951条,经拼接共获得单一基因(unigene)为3 394个,其中包括片段重叠群(contig)2 061个和单一EST序列(singlet)1 333个。此cDNA文库将可用于橡胶树功能基因组研究、新基因筛选、高通量EST测序以及橡胶树胶乳cDNA芯片的制备。     

冬瓜均一化酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

[目的]通过构建冬瓜酵母双杂交cDNA文库,为开展冬瓜基因功能研究提供技术支撑.[方法]以冬瓜高代自交系B227(冬瓜参考基因组测序材料)的根、茎、叶、雄花、嫩果等不同组织为材料,利用CTAB法提取RNA、分离纯化获得mRNA并进行双链cDNA合成和DSN均一化处理后,与pDONR222载体进行BP重组反应,转化大肠杆...     

棉花花药全生育期均一化全长cDNA文库的构建和分析

【目的】深入了解棉花花药发育的分子机制,并为其不育机理的研究提供参考序列。【方法】构建棉花花药全生育期的均一化全长cDNA文库并测序获得9 896条高质量的EST,利用生物信息学和荧光定量相结合法对所得数据进行系统分析。【结果】该cDNA文库库容为1.2×107,插入片段分布在1—3 kb。将所测得的高质量EST进行拼接得到6 643条unigenes,平均长度为779 bp。经过序列比对注释和生物信息学分析,得到一系列在棉花花药发育过程中起重要作用的基因,并获得28条参与花粉壁合成的基因。荧光定量结果表明,这些基因均在花药发育前期优势表达,尤其是在四分体时期表达量最高。【结论】获得大量的棉花花药表达基因,并分析得到一些调节棉花花药发育的重要途径以及参与棉花花粉壁合成相关基因。     

鮸鱼全长均一化cDNA文库的构建及EST序列信息学分析

采用双链特异性核酸酶(DSN)均一化技术与SMART技术相结合,以经过鳗弧菌感染后获得的娩鱼脾脏材料构建均一化全长cDNA文库.该原始文库约含有7.5×106个重组子,插入片段在1～3kb之间,文库滴度为1.6×106 CFU.mL-1.从文库中随机挑选5 952个克隆进行测序,共获得5 053条表达序列标签(EST),其中高质量序列4 609条.对序列进行组装后,发现非冗余基因序列3 221条,重叠群656个,单拷贝序列2 565条,冗余率为30.11％.对全部序列分析后发现,其平均读长为550 bp,大部分序列长度在500～599 bp之间,GC含量大部分分布于40％～60％之间.1 397个基因能够进行GO( gene ontology)功能注释,并初步筛选到大量与免疫功能相关的蛋白家族及功能域的基因序列,为进一步娩鱼分子育种奠定了基础.     

亚洲棉（Gossypium arboreum L.）全生育期均一化全长cDNA文库的构建和鉴定

 【目的】构建二倍体亚洲棉石系亚1号全生育期均一化全长cDNA文库,建立亚洲棉功能基因组学研究基础平台,发掘亚洲棉发育、抗逆等相关基因。【方法】取石系亚1号子叶期、苗期、蕾期、花铃期不同组织器官,提取总RNA并分离纯化mRNA,采用SMART技术反转录全长双链cDNA。用DSN（duplex-specific nuclease）法对全长双链cDNA进行均一化,均一化的cDNA连接到λZAPⅡ载体,包装蛋白包装后构建石系亚1号全生育期均一化全长cDNA文库。【结果】初级文库滴度4×106 pfu?ml-1,库容2×106个独立克隆,重组率大于95%,插入片段平均长度大于1.5 kb。随机挑取192个克隆进行EST（expressed sequence tags）测序,冗余度仅为3.49%。BLASTN比对结果显示：78.31%的EST为新EST。【结论】文库均一化效果良好,质量符合要求,可能包含大量新基因,是进行EST测序、发掘新基因等棉花功能基因组学的研究平台。     

均一化cDNA文库的研究进展及其应用（摘要）

均一化cDNA文库是可获得表达序列标签和发现基因的一个新的有效平台。它降低在文库中高拷贝存在的cDNA的丰度,提高了发现随机序列和稀有基因的效率。本文综述了构建均一化cDNA文库的原理,步骤及其在植物和动物中的应用,以期可促进均一化cDNA文库的发展和它在发现新基因中的应用。     

石蒜叶片全长cDNA文库的构建

以石蒜叶片为材料,根据SMART[TM] cDNA文库构建试剂盒所示方法,提取叶片总RNA合成cDNA,连接到质粒载体pDNR-LIB上,采用电穿孔法将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中,构建了石蒜叶片全长cDNA文库.文库质量鉴定结果表明:文库滴度为1.15×106 PFU/ml,重组率99.17%,插入片段大小多为0.5～2.0 kb,1.0 kb以上的占60%.     

新疆陆地棉种质资源的综合评价

【目的】基于形态指标、产量指标和品质指标,综合评价棉花种质资源在新疆季节性水分匮缺条件下的表现,为旱区棉花主栽品种的确定和品种改良奠定基础。【方法】以126个棉花品种(系)为试验材料,对其在季节性水分匮缺状态下的株高、果枝数、生育期、有效铃数、单铃重、衣分、籽指、籽棉产量、皮棉产量、纤维长度、整齐度、比强度、伸长率、马克隆值、反射率、黄度和纺纱均匀性指数共17项数量性状指标进行测定,运用相关分析、主成分分析、聚类分析、逐步判别分析和多元方差分析等方法对这些棉花种质资源进行综合评价。【结果】首先,相关分析的结果表明,17项数量性状间存在一定的相关性和信息的重叠,因为56对数量性状的相关系数达到极显著水平,22对数量性状的相关系数达到显著水平。第二,主成分分析的结果表明,前8个主成分代表了126个棉花品种的17项数量性状86.34%的信息,其贡献率分别为27.45%、17.18%、11.61%、8.42%、6.66%、5.33%、5.08%和4.63%。第三,聚类分析的结果表明,当类间距离为12.5时,126个棉花品种被聚为7大类,第Ⅰ类有22个品种、第Ⅱ类有17个品种、第Ⅲ类有19个品种、第Ⅳ类有28个品种、第Ⅴ类有19个品种、第Ⅵ类有13个品种、第Ⅶ类有8个品种。第四,逐步判别分析的结果表明,114个棉花品种被正确判别,判对概率为90.48%;12个棉花品种被误判,误判率为9.52%,这说明聚类分析的结果是准确可靠的。最后,多元方差分析结果表明,第Ⅰ类为中产中等品质品种,第Ⅱ类为低产优质类品种,第Ⅲ类为高产优质类品种,第Ⅳ类为中高产中等品质类品种,第Ⅴ类为中高产中上等品质类品种,第Ⅵ类为高产中等品质类品种,第Ⅶ类为低产劣质类品种,同时科学地评价了7个类别的棉花品种,并提出了对应的改良方案。【结论】西北旱区棉花育种一方面在产量上进展明显,除了第Ⅵ类和第Ⅴ类外,大多数品种达不到纺高支纱的要求。适纺中支纱的主栽品种可在第Ⅲ类中选育。第Ⅱ类的纺纱指数达到了适纺高强力优质棉的要求,要着重改良产量指标。今后,西北旱区棉花育种工作要对不同类别的品种,选取适合的育种策略,以达到产量和品质均趋向最优。     

新陆早19号胚珠培养体系的建立

在Beasley和Ting方法的基础上,建立了新疆陆地棉品种新陆早19号棉花胚珠离体培养纤维体系.在不继代的条件下培养25 d,在培养期内,测定了离体胚珠培养纤维生长长度,并首次利用数字化的图像和图像处理软件确定了离体胚珠及纤维生长轮廓所形成的面积.测定结果表明,在离体培养发育早期(前8 d),纤维发育迅速,其伸长长度绝对值相对较高,第20 d时已接近纤维的最终长度.但生长10 d以内的纤维强度很低,影响长度测量的准确度.培养前15 d离体胚珠生长的轮廓面积增长较快,15 d以后增长变缓,第20 d接近轮廓最大面积.     

陆地棉叶片叶绿素含量与SSR标记的关联分析及优异等位变异的挖掘

【目的】筛选与陆地棉叶片叶绿素含量性状相关联的分子标记,挖掘其优异等位变异及典型材料,为陆地棉分子标记辅助育种提供技术支持。【方法】在3年6个环境中,对185份陆地棉品种(系)组成的自然群体进行倒4叶叶绿素相对含量(soil and plant analyzer development,SPAD)的测定,每年分3个时期(打顶后0、10和20 d)。采用Power Marker 3.25软件计算各位点的多态性信息含量,以分析群体的遗传多样性。利用STRUCTURE 2.3.4软件计算群体结构矩阵(Q),利用TASSEL 3.0软件计算亲属关系矩阵(K),通过GLM(general linear model,Q)和MLM(mixed linear model,Q+K)2种方法,同时对SPAD与SSR标记进行关联分析。依据计算的等位位点表型效应值,挖掘优异的等位变异及典型材料。【结果】137对SSR多态性引物共扩增出355个等位变异,平均每对引物扩增到2.6个多态性位点,PIC平均值为0.67,变化范围为0.01—0.95,高度多态性引物(PIC0.5)占85%,其中PIC最高的标记为HAU2146(PIC=0.95)和NAU2083(PIC=0.93)。当(35)K取得最大值时,K=2,因此,将185份陆地棉材料划分为2个亚群。通过GLM方法共检测到22个显著性位点(P0.001),表型变异解释率为5.28%—10.85%,平均为7.24%,贡献率最高的等位变异位点是SWU0529a(R2=10.85%)和NAU998c(R2=10.48%);通过MLM方法共检测到17个显著性位点(P0.01),表型变异解释率为3.72%—8.58%,平均为4.72%,贡献率最高的等位变异位点是SWU0923b(R2=8.06%)和SWU0662d(R2=6.74%);2种方法共同检测到的显著性位点有12个,等位变异NAU998c在3个时期2种方法能同时被检测到。通过等位变异的表型效应分析,找到2个增效效应最大的等位变异(HAU3318b和SWU0987b),利用找到的等位变异对材料进行筛选,获得携带2个增效效应等位变异的材料53份,2个增效效应位点都未检测到的材料有46份,统计结果显示,在打顶后10和20 d 2个时期,53份材料的SPAD均值显著高于46份材料的SAPD均值。【结论】检测到12个与SPAD值相关的显著性位点,并挖掘到2个增效效应优异等位变异,获得携带优异等位变异的载体材料53份,获得携带2个优异等位变异的典型材料1份。     

Construction of a Full-Length cDNA Library of Gossypium hirsutum L.and Identification of Two MADS-Box Genes

A full-length normalized cDNA library for the flower development stages of short-season cotton(Gossypium hirsutum L.)(CCRI36)was constructed.A total of 3 421 clones were randomly selected for sequencing,with a total of 3 175 effective sequences obtained after removal of empty-carriers and low-quality sequences.Clustering the 3 175 high-quality expressed sequence tags(ESTs)resulted in a set of 2 906 non-redundant sequences comprised of 233 contigs and 2 673 singletons.Comparative analyses indicated that 913(43.6%)of the unigenes had homologues with function-known genes or functionassumed genes in the National Center for Biotechnology Information.In addition,763(36.4%)of the unigenes were functionally classified using Gene Ontology hierarchy.Through EST alignment and the screening method,the full-length cDNA of two MADS-box genes viz.,GhMADS11 and GhMADS12 were acquired.These genes may play a role in flower development,Phylogenetic analysis indicated that GhMADS11 and GhMADS12 had high homology and close evolutionary relationship with AGL2/SEP-type and PI-type genes,respectively.The expression of both GhMADS11 and GhMADS12,genes was high in reproductive organs.In floral organs,GhMADS11 expression was high in petals(whorl2)and ovules,while GhMADS12 expression was high in petals(whorl2)and stamens(whorl3).Results show that the EST strategy based on a normalized cDNA library is an effective method for gene identification.The study provides more insights for future molecular research on the regulation mechanism of cotton flower development.     

陆地棉棕色纤维色泽的遗传分析

以抗虫陆地棉119-1和GK-2分别与棕色棉2号杂交组合的P1、P2、F1、B1、B2和F2 6个家系为材料,借助色差计分析仪,对棕色纤维的遗传进行了研究,结果表明：在这2个组合中,棕色纤维色泽性状受1对不完全显性基因控制,色泽值的大小与纤维品质性状密切相关,色差值越大,纤维品质越差。