朱砂叶螨几丁质酶TecCht1基因的原核表达与纯化

【目的】朱砂叶螨是世界范围广泛分布的重要经济害螨,害螨防治十分困难。而几丁质酶是昆虫体内几丁质代谢中分解几丁质的关键酶,在更替新旧表皮和降解围食膜中起着重要的作用,几丁质酶是潜在的螨害生物防治靶标。本研究对朱砂叶螨几丁质酶TecCht1进行原核表达和纯化。【方法】克隆朱砂叶螨TecCht1基因的催化结构域,连接到pColdⅡ载体上,构建pColdⅡ/TecCht1重组表达载体,在大肠杆菌中进行高效表达,采用镍柱纯化目的蛋白,并进行Western Blot检测。【结果】TecCht1在pColdⅡ载体上成功高水平表达,确定最佳诱导表达时间为24h。对TecCht1进行大量表达和纯化,经Western Blot验证,获得纯度较高的目的蛋白。【结论】实现TecCht1体外高效原核表达,获得大量的TecCht1重组蛋白。     

朱砂叶螨几丁质酶TecCht1基因的原核表达与纯化

【目的】朱砂叶螨是世界范围广泛分布的重要经济害螨,害螨防治十分困难。而几丁质酶是昆虫体内几丁质代谢中分解几丁质的关键酶,在更替新旧表皮和降解围食膜中起着重要的作用,几丁质酶是潜在的螨害生物防治靶标。本研究对朱砂叶螨几丁质酶TecCht1进行原核表达和纯化。【方法】克隆朱砂叶螨TecCht1基因的催化结构域,连接到pCold Ⅱ载体上,构建pCold Ⅱ/TecCht1重组表达载体,在大肠杆菌中进行高效表达,采用镍柱纯化目的蛋白,并进行Western Blot检测。【结果】TecCht1在pCold Ⅱ载体上成功高水平表达,确定最佳诱导表达时间为24 h。对TecCht1进行大量表达和纯化,经Western Blot验证,获得纯度较高的目的蛋白。【结论】实现TecCht1体外高效原核表达,获得大量的TecCht1重组蛋白。     

朱砂叶螨几丁质酶TecCht1基因的原核表达与纯化

【目的】朱砂叶螨是世界范围广泛分布的重要经济害螨,害螨防治十分困难。而几丁质酶是昆虫体内几丁质代谢中分解几丁质的关键酶,在更替新旧表皮和降解围食膜中起着重要的作用,几丁质酶是潜在的螨害生物防治靶标。本研究对朱砂叶螨几丁质酶TecCht1进行原核表达和纯化。【方法】克隆朱砂叶螨TecCht1基因的催化结构域,连接到pCold Ⅱ载体上,构建pCold Ⅱ/TecCht1重组表达载体,在大肠杆菌中进行高效表达,采用镍柱纯化目的蛋白,并进行Western Blot检测。【结果】TecCht1在pCold Ⅱ载体上成功高水平表达,确定最佳诱导表达时间为24 h。对TecCht1进行大量表达和纯化,经Western Blot验证,获得纯度较高的目的蛋白。【结论】实现TecCht1体外高效原核表达,获得大量的TecCht1重组蛋白。     

家蚕整合素基因Bmintegrin αPS3的鉴定及亚细胞定位

【目的】克隆家蚕整合素基因Bmintegrin αPS3,分析其mRNA表达及亚细胞定位特征,并进行原核表达及蛋白纯化,为进一步探究Bmintegrin αPS3在家蚕中的功能奠定基础。【方法】利用RACE方法克隆获得Bmintegrin αPS3的cDNA全长序列;采用RT-PCR方法检测Bmintegrin αPS3的时空表达;在原核表达系统中表达获得Bmintegrin αPS3重组蛋白;并构建Bmintegrin αPS3真核表达载体,转染家蚕胚胎细胞系分析其蛋白亚细胞定位。【结果】家蚕整合素基因Bmintegrin αPS3 编码框全长为2 895 bp,编码965个氨基酸,含有整合素家族蛋白典型的integrin alpha结构域,预测其为跨膜蛋白。构建了Bmintegrin αPS3的原核表达系统,并利用亲和层析纯化获得高纯度的Bmintegrin αPS3原核表达蛋白,为进一步制备抗体获得足够的抗原。在家蚕细胞系中外源表达Bmintegrin αPS3蛋白,显示其主要定位于细胞质和细胞膜中。另外,RT-PCR结果显示Bmintegrin αPS3 mRNA 在血细胞中为特异持续表达。【结论】获得了Bmintegrin αPS3的完整cDNA序列及表达特征,经原核表达、纯化获得其融合蛋白,在细胞水平上初步分析了其亚细胞定位情况。     

家蚕卵黄原蛋白受体BmVgR的体外表达

【目的】克隆家蚕卵黄原蛋白受体（vitellogenin receptor, VgR）,分析其在昆虫细胞中的表达特征,了解正常VgR和突变VgR的表达模式,为阐明其生物学功能提供参考依据。【方法】基于家蚕VgR的基因编码序列设计特异引物,扩增的目的片段连接到载体pET28a上,构建原核表达载体,转化E. coil BL21（DE3）表达菌株,IPTG诱导获得目的蛋白;用镍柱亲和层析方法纯化诱导表达的家蚕VgR肽蛋白;将纯化后的肽蛋白制备BmVgR的兔源多克隆抗体;PCR扩增获得大造和突变型白妙卵（scanty vitellin,vit）的LBD1+EGF1结构域（C11D和C11V）片段,连接到细胞表达载体上,通过细胞转染表达目的蛋白,采用细胞免疫组化检测大造和突变型vit的VgR在细胞里的表达情况;通过Western blot检测细胞培养液中大造和突变型vit VgR的表达量。【结果】原核表达获得了一个大小约为22 kD的融合蛋白,以包涵体形式表达;镍柱亲和层析初纯化得到BmVgR的肽蛋白,进一步切胶纯化后,以此为抗原制备BmVgR的兔源多克隆抗体,其抗体效价＞1﹕512 000,纯度为95%以上。转录水平检测表明Sf9和Spli221昆虫细胞中没有BmVgR和BmVg内源基因的表达;在Sf9昆虫细胞中成功表达了家蚕野生型和突变型vit BmVgR的结构域SP+LBD1+EGF1肽段,家蚕突变型vit在BmVgR第1个表皮生长因子同源区域的第3个ClassB区域有编码50个氨基酸残基的核酸序列缺失;细胞免疫组化试验表明,突变型和正常型的C11V和C11D都能在Sf9细胞质中正常表达;制备的BmVgR兔源多克隆抗体和Myc标签抗体同时检测到细胞表达的目的蛋白,表明试验所制备的VgR抗体特异性较好;由于SP+LBD1+EGF1肽段存在信号肽,细胞表达的蛋白会分泌进入细胞培养液中,Western blot对培养液进行蛋白检测,表明突变型vit存在氨基酸缺失,但并不影响肽蛋白的正常表达,且表达量没有明显差异。【结论】EGF1结构域的缺失并不影响SP+LBD1+EGF1肽蛋白的正常表达,可能是其蛋白功能异常导致突变型vit表型产生。     

家蚕bHLH转录因子Bmdimm与Bmchip的相互作用

【目的】bHLH转录因子Bmdimm是家蚕（Bombyx mori）5龄后期调控蚕丝蛋白丝素重链基因表达的重要转录因子。分析发现Bmdimm蛋白中包含有可能发生泛素化修饰的赖氨酸残基K43,因此推测Bmdimm可能发生泛素化修饰而被降解。Bmchip属于家蚕泛素连接酶E3家族中的U-box亚家族,在家蚕5龄期后部丝腺中有表达。论文旨在明确Bmdimm与Bmchip之间的相互作用,以便于更好地理解Bmdimm在家蚕体内的泛素化修饰及其对丝素重链基因转录调控的生物学意义。【方法】利用家蚕各组织基因芯片表达谱分析Bmdimm和Bmchip在后部丝腺中的表达情况;分别通过PCR和基因合成获得Bmdimm和Bmchip的CDS序列,将其构建到不同的原核表达载体并转化大肠杆菌表达目的蛋白,筛选最优的表达条件;利用镍柱亲和层析纯化融合蛋白,加入蛋白酶酶切,并再次通过镍柱亲和层析去除融合标签,纯化Bmdimm和Bmchip蛋白;利用凝胶过滤层析分析Bmdimm和Bmchip在溶液中的聚集状态;利用圆二色光谱研究Bmdimm和Bmchip蛋白的二级结构;利用Far-western blotting和Pull-down研究Bmdimm和Bmchip在体外的相互作用;利用微量热泳动研究Bmdimm和Bmchip结合的亲和力。【结果】基因芯片表达谱揭示Bmdimm和Bmchip在家蚕5龄期后部丝腺中都有表达。构建了Bmdimm和Bmchip多种表达载体,发现ppSUMO-Bmdimm和pET-32M·3C-Bmchip表达载体在16℃,0.3 mmol·L^-1 IPTG诱导下表达最好,并以此为基础表达纯化了Bmdimm和Bmchip蛋白;凝胶过滤分析表明Bmdimm和Bmchip蛋白在溶液中主要以二聚体的形式存在;圆二色光谱显示Bmdimm和Bmchip蛋白都含有α-螺旋结构; Far-western blotting和Pull-down结果表明Bmdimm和Bmchip可以在体外结合;利用微量热泳动实验计算出Bmdimm和Bmchip结合的平衡解离常数为(750±28.6)μmol·L^-1。【结论】家蚕bHLH转录因子Bmdimm和泛素连接酶Bmchip在家蚕5龄期后部丝腺中均有表达,二者可以在体外发生瞬时相互作用,暗示了Bmdimm可能通过Bmchip介导发生泛素化修饰从而下调丝素重链基因的转录。     

家蚕组织蛋白酶O（BmCatO）基因鉴定及表达分析

【目的】克隆家蚕（Bombyx mori）蛋白酶O基因Cathepsin O（BmCatO）,分析其mRNA表达特征,通过原核表达、蛋白纯化和多次免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,为进一步探究组织蛋白酶O在家蚕变态发育中的功能奠定基础。【方法】利用RACE技术克隆获得家蚕组织蛋白酶O的全长cDNA序列,然后采用RT-PCR对其时空表达特征进行研究。从NCBI下载其他物种组织蛋白酶O基因序列,利用Clustalx和MEGA 6.0软件进行同源比对和进化分析。选取特异性较高的片段设计特异性引物,将PCR扩增产物连接至PET32a质粒,转化至E. coil表达菌株Rosetta(DE3),经IPTG诱导获得组织蛋白酶O重组蛋白,然后利用Ni+亲和层析方法对重组蛋白进行纯化,最后多次免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。【结果】家蚕组织蛋白酶O基因存在于家蚕第14号染色体上,scaffold为nscaf2943,基因编号BGIBMGA009231。该基因有两种剪切形式,剪切体1开放阅读框（ORF）全长为1 071 bp,编码356个氨基酸,预测蛋白分子量36 kD,等电点8.594;剪切体2 ORF全长为942 bp,编码313个氨基酸,预测蛋白分子量40 kD,等电点7.951。两种剪切体均有6个外显子和5个内含子构成,剪切体2的第六外显子出现部分缺失。两种剪切体编码的蛋白结构相似,均含有信号肽、Inhibitor129和Pept-C1结构域。进化分析结果表明,无脊椎动物组织蛋白酶单独聚为一类,且家蚕组织蛋白酶O与同为鳞翅目成员的二化螟（Chilo suppressalis）组织蛋白酶O最为接近。RT-PCR结果显示该基因特异性持续表达于幼虫血细胞,剪切体1的表达水平明显高于剪切体2,但这两种剪切体在幼虫血细胞发育时期表达趋势一致。构建家蚕组织蛋白酶O原核表达系统,利用亲和层析纯化获得高纯度的家蚕组织蛋白酶O重组蛋白,并利用纯蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA显示其效价高达到1﹕1 280 000。Western印迹结果表明,该抗血清可以特异性识别家蚕组织蛋白酶O重组蛋白。【结论】获得了家蚕组织蛋白酶O基因的完整cDNA序列及表达特征,经原核表达、纯化获得高纯度的融合蛋白,通过多次免疫新西兰大白兔成功获得抗体。     

家蚕整合素β2的表达、纯化及其免疫功能

【目的】 分析家蚕（Bombyx mori）整合素β2的序列和结构特征及其在家蚕感染病原菌后血细胞中的表达变化,检测其重组蛋白对不同病原相关模式分子识别和病原菌的凝聚作用,为进一步探究家蚕整合素β2的蛋白功能打下基础。【方法】 利用生物信息学对整合素β2的序列和结构特征进行分析,利用实时荧光定量PCR检测家蚕分别注射大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）后整合素β2在血细胞中的表达变化。通过PCR技术扩增获得整合素β2完整的胞外域片段,构建至pET22b原核表达载体后转化至E.coli Rosetta(DE3)表达菌株。经IPTG诱导获得重组蛋白,利用Ni-NTA亲和层析得到纯化的体外重组蛋白,利用SDS-PAGE和Western blot对纯化获得的体外重组蛋白的纯度和质量进行检测。利用ELISA检测重组蛋白与两种不同病原相关分子模式LPS和PGN的结合情况,运用Western blot检测重组蛋白与不同病原微生物的结合情况,通过凝集试验检测重组蛋白对金黄色葡萄球菌的凝集能力,最后在个体水平探索重组蛋白在体内细菌清理中的作用。【结果】 家蚕整合素β2具有典型的β整合素亚基保守结构特征,即由一个较长的胞外域、一个单次跨膜结构域和一个较短的胞内域构成。家蚕整合素β2具有金属离子结合位点MIDAS、EGF结构域、半胱氨酸重复基序和NPxY等整合素典型的结构特征。实时荧光定量PCR检测结果表明家蚕在受到细菌感染后,整合素β2的表达发生显著变化。通过原核表达和蛋白纯化获得纯度较高的重组蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明纯化的重组蛋白纯度较高,可以用于后续试验。ELISA试验表明重组蛋白对LPS和PGN等病原相关分子模式具有较强的结合能力。细菌结合试验结果显示重组蛋白能够结合多种细菌,但与革兰氏阳性菌的结合能力要高于革兰氏阴性菌。细菌凝聚试验结果显示重组蛋白在Ca ²⁺的存在下对金黄色葡萄球菌具有较强的凝聚作用。细菌清除试验证实重组蛋白可以有效促进机体对外源入侵细菌的清理作用。【结果】 整合素β2具有典型的整合素β亚基的结构特征,可能具有识别病原相关分子模式,如LPS和PGN等的能力,通过与细菌的直接结合而实现对入侵病原微生物的凝聚作用,从而增强有机体的免疫能力,推测在家蚕免疫反应中发挥重要作用。     

家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141的表达特征及对饥饿的响应

【目的】分析家蚕(Bombyx mori)丝氨酸蛋白酶基因BmSP141序列信息,明确其时空表达模式,结合饥饿与重新喂食处理对其表达的影响,探究该基因在家蚕中的功能。【方法】对家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmSP141进行T-A克隆,得到其编码区核苷酸序列;应用生物信息学在线网站对该基因编码区推导的氨基酸序列、分子量、结构域等信息进行分析;利用ClustalX1.8和MEGA5.02软件对BmSP141与其他物种的丝氨酸蛋白酶进行多序列比对和系统发生树分析;构建原核表达载体p28-BmSP141,并转化到Rosetta（DE3）菌株中诱导表达,利用镍柱亲和层析纯化重组蛋白。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法对其组织和时期表达特征进行分析;采用蛋白质免疫印迹（Western blot）技术,分别分析BmSP141蛋白在家蚕5龄第3天各组织的表达情况和5龄幼虫中肠的表达变化;通过免疫荧光定位分析BmSP141蛋白在4龄幼虫中肠的分布情况;利用实时荧光定量PCR和Western blot方法对饥饿处理和再喂食后BmSP141的表达情况进行分析。【结果】BmSP141编码含有292个氨基酸的蛋白,其中第1-17位氨基酸为信号肽,其成熟体蛋白预测分子量为25.9 kD,等电点为7.8。同源序列比对表明,BmSP141与烟芽夜蛾丝氨酸蛋白酶和蓓带夜蛾丝氨酸蛋白酶序列同源性较高,分别达到62%和63%。这些同源序列具有保守的催化三联体,与活性相关的基序也很保守,但与胰凝乳蛋白酶保守的底物特异性位点相比,BmSP141的底物特异性位点发生改变。在16和37℃条件下诱导后,重组蛋白均以包涵体形式表达,经镍柱亲和层析纯化后得到了较纯的重组蛋白,并用该蛋白制备了效价较高的多克隆抗体。组织和时期表达特征分析表明,该基因主要在家蚕幼虫的中肠组织特异性表达, 且在幼虫起蚕到食桑期表达逐渐增加,但眠期表达下降,蛹期和成虫期表达水平较低。Western blot分析也表明,BmSP141蛋白仅在家蚕中肠组织表达,且从5龄起蚕到上蔟表达量先增加后降低。免疫荧光定位结果表明,BmSP141定位于中肠上皮细胞的细胞质中,进一步证实BmSP141在中肠特异表达。在转录和翻译水平,BmSP141饥饿处理后表达量显著下调,而重新喂食后其表达量上调,表明BmSP141的表达受到消化道食物的诱导。【结论】家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141在中肠组织表达,在幼虫期食桑期高表达,蛹期和成虫期表达水平较低,受消化道食物的诱导而上调表达,推测该基因可能参与家蚕中肠的消化过程。     

Bt Cry1类毒素共性结构域的分析、表达及鉴定

【目的】分析定位Bt Cry1类毒素Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F的共性结构域,克隆并表达共性结构域蛋白,为筛选Bt毒素广谱抗体及建立广谱检测方法打下基础。【方法】利用生物信息学和分子模拟技术,通过SWISS-MODEL同源建模分别对5种Cry1类毒素进行三维建模,并结合Ramachandran plot、ERRAT和Verify3D方法评价模型构象的合理性。通过分析比对5种Cry1类毒素的三维结构,确定DomainⅠ区域作为5种Cry1毒素的共性结构域。以含Cry1Ac基因的苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种为模板设计引物,PCR扩增获得共性结构域DomainⅠ基因,将其经NcoⅠ和NotⅠ双酶切连接至原核表达载体pET-26b(+),构建原核表达载体pET-26b-DomainⅠ。重组质粒经菌液PCR、双酶切以及测序鉴定验证正确后,转化至E.coli BL21(DE3),经终浓度为1 mmol·L~(-1)的IPTG在20℃下诱导表达16h后检测共性结构域蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达。利用His-Trap HP镍亲和柱纯化上清中的可溶性融合蛋白,经SDS-PAGE电泳、Western blot和ELISA试验验证纯化的共性结构域蛋白的生物活性。【结果】基于氨基酸序列及三维空间比对分析,发现5种Cry1类毒素的DomainⅠ的序列一致性最高,而且它们的DomainⅠ三维结构几乎完全重合,确定DomainⅠ区域作为5种Cry1毒素的共性结构域,通过PCR、双酶切及测序鉴定成功构建原核表达载体pET-26b-DomainⅠ,经IPTG诱导表达、His-Trap HP镍亲和柱纯化获得了可溶性的DomainⅠ共性结构域蛋白,SDS-PAGE和Western blot证实表达的共性结构域蛋白的分子量约为33.4 kD,且能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应,ELISA试验证实共性结构域蛋白与5种Cry1类毒素特异性抗体均具有很强的结合能力,抗原表位分析结果显示共性结构域蛋白具有和完整的Cry蛋白存在多个潜在抗原表位位点的特征,抗原表位区域所占的比例分别为48.4%和63.6%,表明共性结构域蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。【结论】基于分子模拟与分子克隆技术,成功定位及表达纯化获得共性结构域蛋白,为下一步利用共性结构域为靶标分子制备广谱特异性识别Cry1类毒素抗体打下基础。     

飞蝗几丁质脱乙酰基酶的真核表达、亲和纯化及酶活性

【目的】体外真核表达飞蝗(Locusta migratoria)几丁质脱乙酰基酶1和2(chitin deacetylase 1and 2,LmCDA1和LmCDA2)并测定其酶活性,为进一步明确飞蝗LmCDA1和LmCDA2在几丁质降解途径中的生理功能及研发新型绿色环保杀虫剂提供依据。【方法】使用BLASTP和SMART软件在线预测LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的结构域;PCR克隆获得目的基因LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的全长序列,并分别构建p Fast Bac-LmCDAs重组质粒,转化获得Bacmid重组质粒后,转染至昆虫Sf9细胞进行目的蛋白的体外表达。采用Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱和阴离子(Q-Sepharose)交换层析柱对蛋白产物进行纯化。12%SDS-PAGE检测蛋白纯度后,采用分光光度法以对硝基乙酰苯胺为底物检测目的蛋白的酶活性,T检验法对LmCDA2a和LmCDA2b酶活力进行差异显著性分析。【结果】BLASTP和SMART软件预测结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b均含有4个结构域:N-端信号肽(signal peptide)、几丁质结合域(chitin binding peritrophin-A,Ch BD)、A型低密度脂蛋白受体结构域(low-density lipoprotein receptor class A,LDLa)和脱乙酰基酶催化结构域(catalytic domain,CDA)。3个基因的几丁质结合域中均包含6个保守的半胱氨酸。LmCDA2a和LmCDA2b两个剪切子除在其第3个半胱氨酸和第4个半胱氨酸之间(67—84 aa)的氨基酸数目和组成及在第4和第6个半胱氨酸(84—106 aa)之间的序列存在差异外,其余部分完全一致。Western blot结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的蛋白分子量约为61 k D左右,与预测的蛋白分子量大小一致,表明Bacmid重组质粒在昆虫Sf9细胞中成功表达。采用12%SDS-PAGE胶电泳对各蛋白纯化组分进行检测,结果显示Ni-NTA亲和层析柱可将大部分杂蛋白洗脱,而Q-Sepharose交换层析柱可对蛋白进行更彻底地纯化。酶活检测结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力分别为0.268、0.354、0.228 U·μL~(-1),并且LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力存在显著差异。【结论】体外真核表达LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b蛋白并进行酶活测定后发现三者均具有几丁质脱乙酰基酶活力,且LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力具有显著性差异,推测前期研究中沉默LmCDA2a和LmCDA2b后分别出现不同飞蝗表型的原因可能是由于它们酶活力存在显著性差异。     

小麦WPBF与高分子量谷蛋白基因上游Prolamin-Like box的特异结合

【目的】克隆普通小麦胚乳特异表达转录因子基因WPBF,对其原核表达条件进行优化,并验证其编码蛋白和小麦高分子量谷蛋白亚基基因（HMW-GS）上游Prolamin-Like box的结合特性,为小麦HMW-GS表达调控机制的阐明奠定基础。【方法】利用RT-PCR扩增得到WPBF编码区,将其连接到pET-21a-MBP载体中,并分别在E.coli T7 Express和Origami B（DE3）菌株中诱导表达。依次利用Amylose和Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白,最后通过凝胶迁移阻滞试验（EMSA）对重组蛋白的DNA结合特性进行分析。【结果】在33℃的Origami B（DE3）菌株中表达含MBP和His双标签的重组WPBF大部分以可溶性形式存在,其表达量占细菌总蛋白的48.0%。重组WPBF和含HMW-GS上游Prolamin-Like box的两类DNA探针能发生特异结合,但重组WPBF和含“TGCAAAG”基序DNA探针的结合强度高于其和含“TGCAAG”基序DNA探针的结合。【结论】建立了优化的WPBF原核表达系统,并获得具有生物活性的重组蛋白;重组WPBF能与HMW-GS启动子来源的两种Prolamin-Like box特异性结合, 但结合能力存在差异。     

家蚕空泡型ATP酶（V-ATPase）基因的基本信息及表达特征

【目的】鉴定家蚕（Bombyx mori）中的空泡型ATP酶（vacuolar-type ATPase, V-ATP酶）A、B亚基的编码基因,并调查其在家蚕幼虫5龄第3天不同组织和上蔟时期丝腺不同区段的表达特征。【方法】利用生物信息学的方法鉴定家蚕的V-ATP酶A、B亚基的编码基因并在线预测V-ATP酶两个亚基所具有的结构域,采用软件将其分别与其他物种中V-ATP酶A、B亚基的氨基酸序列进行同源序列比对和进化树的构建,通过荧光定量PCR技术分析家蚕V-ATP酶A、B亚基的编码基因在5龄第3天家蚕各组织的表达情况。进一步利用向家蚕幼虫上蔟时期的气孔注射pH值指示剂溴酚蓝,对丝腺进行染色,通过颜色变化对丝腺不同区段的pH值进行调查。最后,采用荧光定量PCR对家蚕上蔟时期丝腺不同区段V-ATP酶A、B亚基编码基因的表达情况进行分析。【结果】获得了家蚕V-ATP酶A、B亚基的编码基因BGIBMGA008295(GenBank登录号NM_001098359.1)和BGIBMGA002241(GenBank登录号NM_001098358.1)。结构域预测发现这两个亚基均具有3个非常保守的结构域,分别为位于N端的β筒结构域、序列中部的核苷酸结合结构域和C端结构域。将这两个基因编码的V-ATP酶A、B亚基的氨基酸序列与其他物种V-ATP酶A、B亚基的氨基酸序列进行同源性比对和进化树的构建,同源比对结果发现不同物种中V-ATP酶A、B亚基的氨基酸相似度为90%,保守结构域间相似度高达95%以上,说明不同物种间V-ATP酶A、B亚基高度保守。进化树显示家蚕V-ATP酶A、B亚基与同属于鳞翅目的其他昆虫的V-ATP酶A、B亚基亲缘关系较近。5龄第3天家蚕各组织中V-ATP酶A、B亚基编码基因的荧光定量PCR结果显示,这两个基因主要在中肠、脂肪体、生殖腺和丝腺中表达。使用溴酚蓝染色的方法分析上蔟期丝腺不同区段的pH情况,结果显示家蚕后部丝腺、中部丝腺后区和中区为中性或碱性环境,中部丝腺前区pH急剧下降到酸性环境,前部丝腺也为酸性环境。进一步对V-ATP酶A、B亚基编码基因在上蔟期丝腺不同区段进行表达情况分析,发现V-ATP酶A、B亚基基因在前部丝腺和中部丝腺前区高量表达,推测V-ATP酶可能与这两个区域低pH环境的产生和维持相关。【结论】明确了V-ATP酶在家蚕各组织的表达情况,V-ATP酶可能与中部丝腺前区和前部丝腺腺腔的酸化相关,这为进一步研究V-ATP酶的生理功能提供了理论依据。     

家蚕丝腺生物反应器表达狂犬病病毒核蛋白

【目的】采用家蚕丝腺生物反应器这一蛋白高效表达系统,尝试建立一种高效、低廉、稳定生产狂犬病病毒核蛋白（RVNP）的技术体系,为生产基因工程疫苗奠定基础。【方法】通过RT-PCR方法克隆获得RVNP序列,采用家蚕丝胶蛋白基因（Ser1）启动子为特异性启动子,将RVNP构建到含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）筛选标记基因的piggyBac转座子表达载体（pBA3EGFP）中,并采用显微注射转基因家蚕技术构建家蚕丝腺生物反应器。【结果】G1代通过EGFP标记的筛选获得转基因家蚕阳性蛾区26个,蛾圈阳性率为59.09%。PCR实验证实RVNP已经整合到家蚕基因组中,Western blot分析表明RVNP蛋白可能附着于丝胶蛋白并随家蚕吐丝行为分泌到蚕茧中。【结论】获得了能够表达外源的RVNP蛋白的转基因家蚕品系,该系统有望成为高效、低廉、稳定地生产狂犬病基因工程疫苗的技术体系之一。     

临床型奶牛乳房炎乳腺组织的比较蛋白质组研究

 【目的】采用比较蛋白质组学技术分析、检测了临床健康与乳房炎奶牛乳腺组织中的差异表达蛋白,以寻找药物治疗目标,探讨奶牛乳房炎的发生机理。【方法】采用二维凝胶电泳分离临床健康与乳房炎奶牛的乳腺组织蛋白,考马斯亮蓝染色,PDQuest7.4软件自动匹配检测差异表达蛋白斑点,高效液相色谱串联离子阱质谱分析鉴定。【结果】凝胶图谱中检测出15个差异蛋白斑点,串联质谱分析后有12个蛋白斑点可搜索到相应的结果,对应于10种蛋白质,主要涉及结合、运输和催化活性等分子功能,参与细胞、代谢及生物调节等生理过程。【结论】临床健康与乳房炎奶牛的乳腺组织中蛋白的表达模式存在差异,表达差异蛋白与奶牛乳房炎的发生相关,对其分析有利于探索机体的生理病理状态,还可为揭示奶牛乳房炎的发生机理提供直接依据。     

两种方法测定绿盲蝽气味结合蛋白AlucOBP21配体结合特性的结果比较

【目的】比较荧光竞争结合试验(fluorescence competitive binding assay)和微量热涌动(microscale thermophoresis,MST)技术在研究绿盲蝽(Apolygus lucorum)气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)Aluc OBP21配体结合特性上的差异,探索一种新的测定昆虫OBPs结合功能的方法。【方法】提取绿盲蝽雌、雄成虫触角总RNA并进行反转录,获得绿盲蝽成虫触角c DNA。采用特异性克隆引物,以绿盲蝽成虫触角c DNA为模板进行PCR扩增,构建p ET32a/Aluc OBP21重组质粒。将重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,获得含表达标签的重组Aluc OBP21蛋白。通过高亲和Ni-NTA纯化介质对重组粗蛋白进行纯化,采用重组肠激酶切掉His-tag标签,最终获得无表达标签的重组Aluc OBP21蛋白。利用荧光竞争结合试验,以1-N-phenylnaphthylamine(1-NPN)为荧光探针研究重组Aluc OBP21蛋白与候选配体的结合特性,其中1-NPN和气味标样均溶解在质谱纯级的甲醇中。同时,利用MST技术解析重组Aluc OBP21蛋白与候选配体的结合特性,候选配体标样溶解在二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液中。候选配体化合物包括8种潜在的盲蝽性信息素及性信息素类似物、12种植物绿叶挥发物和绿盲蝽驱避剂主要组分二甲基二硫醚等。【结果】重组Aluc OBP21蛋白在上清液和包涵体均能够表达,最终选择上清组分进行目标蛋白纯化,利用重组肠激酶在22℃切除His-tag标签得到无标签的重组Aluc OBP21蛋白。荧光竞争结合试验结果显示,重组Aluc OBP21与荧光探针1-NPN的解离常数为(6.88±0.31)μmol·L~(-1),Aluc OBP21能够与β-紫罗兰酮和β-石竹烯结合,解离常数分别为(13.74±1.93)和(13.24±2.12)μmol·L~(-1),而其他候选配体均不能与重组Aluc OBP21有效结合。MST测试结果显示,Aluc OBP21可以与β-石竹烯、β-紫罗兰酮、β-蒎烯和柠檬烯有效结合,解离常数分别为(0.20±0.02)、(0.05±0.01)、(0.70±0.04)和(0.40±0.06)μmol·L~(-1)。其余候选配体化合物与Aluc OBP21的热涌动不能随配体浓度变化而表现有规律的变化,故这些气味化合物不能与Aluc OBP21发生结合作用。【结论】MST检测与荧光竞争结合试验相比,MST所得配体结合谱更广,不会遗漏一些结合力较弱的气味配体。