擎天凤梨GAPDH基因的克隆及序列分析

管家基因GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)常被用作定量、半定量PCR试验的内参,以确定目标基因的相对表达量。基于前期从全长cDNA文库中获得GAPDH基因的EST单克隆,进行Primer Walking测序,获得一个GAPDH的全长cDNA序列,序列长1 790 bp,编码421个蛋白氨基酸,命名为GoGAPDH1。采用Blast,ExPASy,ProtParam,SPOMA,Find Conserved Domains(NCBI),ClustalX, MEGA等生物信息学软件对cDNA 序列、氨基酸序列、保守区、亲缘关系等特征进行分析。结果表明,GoGAPDH1与玉米的细胞质GAPDH基因源性最高,为82%。初步推断GoGAPDH1可能是一个胞质型GAPDH。     

低温胁迫对日本结缕草叶绿素代谢的影响

[目的]日本结缕草是具有众多优良性状,被广泛应用的暖季型草坪草.通过对其叶绿素合成及降解的研究,探究日本结缕草秋冬季节在我国北方地区较早出现叶片脱绿现象的内源机理.[方法]对日本结缕草进行14h光照(4℃)、10h黑暗(2℃)的循环低温处理,并对叶绿素、叶绿素合成与降解途径中重要酶的活性、中间产物含量以及叶绿素代谢相关...     

小麦叶绿素酶及脱镁叶绿素水解酶活性测定条件的优化

叶绿素降解是植物叶片衰老最明显的标志。为探明小麦叶绿素降解途径中叶绿素酶和脱镁叶绿素水解酶2个关键酶反应的最佳环境条件,对其反应的最佳环境温度及时间进行了探讨。结果表明,小麦叶片叶绿素酶的最适反应温度和最佳反应时间分别是40℃和80 min,脱镁叶绿素水解酶的最佳反应温度和最佳反应时间分别是35℃和90 min。该研究结果可为2种酶活性的测定提供重要参考。     

酿酒酵母菌关键酶基因剔除对谷胱甘肽合成的影响

[目的]通过基因工程手段改良酿酒酵母菌以提高谷胱甘肽的产量。[方法]利用基因重组技术分别构建CYS3基因剔除菌和CYS4基因剔除菌,对比了野生菌与突变酵母菌的生长曲线,并定量检测2者中谷胱甘肽和氨基酸的含量,得出CYS3基因和CYS4基因剔除对谷胱甘肽和氨基酸代谢的影响程度。[结果]与野生菌株相比,CYS3基因剔除菌中谷胱甘肽含量降低了26.1%,CYS4基因剔除菌中谷胱甘肽含量提高了6.0%。[结论]综合CYS3和CYS4基因剔除和其他在谷胱甘肽代谢途径中关键酶基因剔除试验结果所得数据,可以建立酿酒酵母谷胱甘肽代谢网络系统生物学模型。     

月季新型PKSⅢ基因的生物信息学分析及原核表达

【目的】对月季Ⅲ型聚酮合酶基因（RcPKSⅢ）进行生物信息学和原核表达分析,为进一步探究该基因的催化功能奠定基础。【方法】以‘月月粉’花瓣为研究材料,从其基因组中筛选月季PKS基因（RcPKSs）家族成员,并对其进行生物信息学分析;利用MEGA软件对RcPKSs与其他植物PKS氨基酸序列进行系统发育分析;利用DNAMAN软件对RcPKSs和紫花苜蓿查尔酮合酶2（CHS2）基因进行序列比对分析;对RcPKSs和紫花苜蓿CHS2活性位点上的氨基酸残基进行比较,分析其催化特征;利用SWISS-MODEL对RcPKSs进行同源建模,并与紫花苜蓿CHS2蛋白三维结构进行比较。利用实时荧光定量PCR方法,分析RcPKSs和间苯三酚甲基化酶编码基因在‘月月粉’花蕾期、半开期和盛开期的表达模式;克隆RcPKSs基因全长,构建其原核表达载体pET-32a-RcPKSs,进行诱导表达,并对重组蛋白进行纯化。【结果】从‘月月粉’基因组中共鉴定出6个RcPKSs,生物信息学分析表明,RcPKS1、RcPKS2和RcPKS3为CHS基因,RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6为新型PKSⅢ基因。系统发育分析表明,RcPKS1、RcPKS2和RcPKS3编码CHS蛋白,RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6编码新型的非CHS蛋白。序列比对分析表明,RcPKS1、RcPKS2和RcPKS3蛋白与紫花苜蓿CHS2相似度均为72.16%,RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6与紫花苜蓿CHS2相似度分别为67.52%,33.85%和32.73%。活性位点上氨基酸残基比较发现,RcPKS1、RcPKS2和RcPKS3活性位点上氨基酸残基均保守,RcPKS4氨基酸残基在起始口袋和延伸口袋处发生替换,RcPKS5和RcPKS6氨基酸残基均在延伸口袋处发生替换。对RcPKSs蛋白质结构的分析结果显示,RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6蛋白质采用了几乎相同的αβαβα三维整体折叠形式。实时荧光定量分析表明,RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6表达量在‘月月粉’花朵盛开期最高,间苯三酚O-甲基转移酶基因（POMT）、苔黑酚O-甲基转移酶基因1（OOMT1）和OOMT2表达量在盛开期最低。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果表明,重组蛋白诱导并且纯化成功。【结论】鉴定了‘月月粉’新型RcPKSⅢ基因,该基因可能参与花发育调控过程。克隆了RcPKSs基因,并诱导表达获得了RcPKSs重组蛋白。     

烟草碳代谢产物及关键酶基因对移栽期的响应

探究威宁黑石地区移栽期对云烟87大田期碳代谢产物含量、碳代谢酶活性及其关键基因表达量的影响,为明确威宁黑石地区最适宜的移栽时期,提高烟叶品质提供理论依据。以云烟87为试验材料,采用随机区组试验设计,移栽期设4个水平：T1(4月10日)、T2(4月20日)、T3(4月30日)、T4(5月10日),2022年于毕节市威宁地区开展田间试验,在大田不同生育时期测定云烟87碳代谢产物及关键酶基因对移栽期的响应。结果表明,云烟87旺长期、现蕾期烟叶中还原糖含量呈先升后降的趋势,且随生育进程推进,各移栽期处理的还原糖含量也呈先升后降的趋势,T2处理烟叶还原糖含量在多数生育期处于较高水平;各移栽期处理的总糖含量的变化规律在各生育期都不尽相同,T2处理烟叶总糖含量在多数生育期处于较高水平;淀粉含量则随移栽期推迟,在生育前期呈先降后升的趋势,在生育后期呈先降后升再下降的趋势。碳代谢酶活性方面,移栽后30～70 d,α-淀粉酶(α-Amylase)活性最低的处理均为T3或T4处理,T2处理活性均为最高或第二高;在同一生育时期内,蔗糖合成酶(SS)、蔗糖转化酶(INV)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性最高的多数...     

萝卜花变叶病病原鉴定及赤霉素合成与代谢途径中关键酶基因的表达

【目的】明确云南元谋地区发生的萝卜花变叶病病原以及赤霉素合成途径中关键酶基因表达量的变化。【方法】对自然表现花变叶、丛枝和节间缩短的萝卜感病植株总DNA进行植原体16S rRNA基因扩增、克隆、测序及系统进化树构建,并采用实时荧光定量PCR技术分析赤霉素合成及代谢途径中关键酶基因(GA20ox1、GA3ox1和GA2ox1)表达量的变化。【结果】该植原体株系与16SrⅡ-A亚组相似性最高(0.98),并与16SrⅡ-A亚组中的其他植原体株系明显形成一个进化支。【结论】萝卜花变叶植原体(Raphanus sativus phyllody,RsPh-YNym)为植原体16SrⅡ-A亚组成员,且与候选种Candidatus Phytoplasma aurantifolia相关,明确了该株系的分类地位;感病植株茎中3种关键酶基因GA20ox1、GA3ox1和GA2ox1表达水平发生了变化,表达量均下调,说明植原体的侵染造成了植株赤霉素稳态被破坏,从而导致植株表型改变。     

利用同框敲除技术研究Ⅲ型聚酮合酶基因orf18的代谢产物

为了阐明Streptomyces sahachiroi ATCC 33158中Ⅲ型聚酮合酶基因orf18的功能,利用同源双交换的方法对该基因进行同框敲除,采用异位表达的方法进行了相应的回补实验。通过高效液相色谱及液相色谱-质谱联用分析发现基因orf18的敲除会明显降低发酵产物中苯甲酸盐的含量,回补该基因能够在一定程度上恢复苯甲酸盐的产量,表明orf18在原宿主中极有可能参与苯甲酸盐的生物合成。     

牛耳皮肤成纤维细胞的分离培养及转染线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因研究

为了核移植法制作转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因克隆牛提供供体细胞,体外分离培养牛耳成纤维细胞并进行了线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因.采用胰蛋白酶消化法分离培养牛耳皮肤成纤维细胞,线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因表达载体以脂质法介导转染细胞,通过G418筛选9d获得稳定转染的细胞克隆.PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,对...     

玉米大斑病菌漆酶基因Stlac2结构分析及原核表达

【目的】对玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)漆酶基因Stlac2进行生物信息学分析,推测其蛋白功能,探究木质素降解过程中产生的小分子物质对Stlac2表达的影响,并对其进行克隆及原核表达,以便深入研究该基因在病菌生长、发育及致病过程中的作用。【方法】通过NCBI查询获得玉米大斑病菌EOA90070(Stlac2)基因的全序列,通过Clustal X与马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)PbrB(PMAA_082060)基因、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)Abr2(AFUA_2G17530)基因、构巢曲菌(Aspergillus nidulans)YA(AN6635)基因等漆酶家族基因进行蛋白序列比对,查看Stlac2中的铜离子结合位点,利用在线软件SOPMA和ProtParam对其二级结构及理化性质进行检测,通过SWISS-MODEL对Stlac2蛋白质的三维结构进行预测,采用SAVES对三维结构进行评价。通过对ABTS的氧化试验确定木质素降解过程中产生的小分子物质对玉米大斑病菌漆酶产量的影响;利用RT-qPCR方法分析小分子物质对Stlac2表达规律的影响;采用原核表达系统,以pET-30a表达载体为框架,对其进行原核表达,并将表达蛋白纯化,以ABTS为底物,420 nm下检测漆酶活性。【结果】Stlac2具有典型的Cu离子结合位点,与漆酶典型的Cu离子结构域相似。其蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲所占比例分别为18.59%、25.63%、11.91%和43.86%,分子量为61.64 k D,等电点为5.00,平均疏水性为-0.37,表明其为亲水蛋白。当在PDA中添加0.01 g·L~(-1)香草醛、4-羟基苯甲醛、丁香醛、香草酸、4-羟基苯甲酸和香兰素时,玉米大斑病菌胞外漆酶的产量为香草酸香兰素4-羟基苯甲醛4-羟基苯甲酸丁香醛对照。而在4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲酸存在时,玉米大斑病菌Stlac2的相对表达量明显升高,约为对照的5—8倍。利用原核表达系统,在67 k D处成功诱导表达出一条特异性蛋白条带,大量表达纯化后,漆酶活性为(40.7±0.3)U·L~(-1)。【结论】阐明了Stlac2的生物信息学特性,初步断定其为漆酶基因;4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲酸可显著提高Stlac2相对表达量,表明其在木质素降解过程中起到了一定的作用;该基因所编码的蛋白可通过pET-30a原核表达系统表达,体外漆酶活性可达(40.7±0.3)U·L~(-1),该研究结果为后期研究蛋白性质打下了基础。     

稻曲病菌T-DNA插入突变菌株B1241侧翼基因克隆

【目的】分析稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)致病力减弱的T-DNA插入突变菌株B1241的生物学性状和致病力,并结合分子生物学手段研究其T-DNA插入位点的侧翼基因,以解析突变基因在稻曲病菌生长和致病过程中的作用,从而为阐明稻曲病菌致病机制提供理论基础。【方法】以野生菌株P1作为对照,观察并检测突变菌株B1241的菌落形态、生长速率、孢子形态、产孢量等生物学性状;采用注射接种的方法将菌丝和孢子的混合液接种于水稻穗苞中,统计每穗发病的病粒数,分析B1241的致病性变化;突变菌株B1241在不含有潮霉素的PSA平板上转接5代之后,PCR检测T-DNA插入的稳定性并通过Southern杂交分析B1241中T-DNA插入的拷贝数;利用HiTail-PCR获得T-DNA插入位点的侧翼序列,经NCBI比对得到侧翼基因;运用RACE-PCR克隆插入位点侧翼基因全长;qRT-PCR分析侧翼基因的表达情况。【结果】经生物学特性观察及田间接种发现,与野生菌株P1相比,突变菌株B1241在固体培养基MM、PSA和TB3上的菌落和孢子形态以及生长速率无显著差异,其致病力、产孢能力均呈极显著下降。B1241在不含潮霉素的PSA平板上转接5代之后,仍能扩增到GFP和HPH基因,说明T-DNA已经稳定地插入到其基因组中。Southern杂交结果显示T-DNA在该突变菌株中以单拷贝的形式插入。经扩增并比对侧翼序列,T-DNA的插入位点处少了28 bp的稻曲序列,有37 bp在T-DNA及稻曲病菌基因组中都没有比对到。NCBI比对发现,侧翼基因Uvt-1241与UV-8b菌株的UV8b-7878基因同源,开放阅读框长2 317 bp,包含81和106 bp的2个内含子,编码709个氨基酸。经RACE-PCR获得基因全长2 650 bp,5'非编码区长度为14 bp,3'非编码区长度为319 bp。T-DNA插入在基因Uvt-1241的启动子区域,位于起始密码子之前516 bp处。qRT-PCR分析结果表明,Uvt-1241在该突变体中表达量下降。该基因编码一个糖基水解酶18家族的蛋白,同时含有一个保守结构域D××D×D×E。【结论】稻曲病菌突变菌株B1241中,T-DNA插入到基因Uvt-1241的启动子区域,从而导致该启动子功能部分缺失,基因表达量下降,使得突变菌株的生长、产孢等生物学特性及致病力发生改变,由此推测该基因可能在稻曲病菌生长及致病过程中起着重要的作用。     

二斑叶螨多重抗性品系解毒酶基因表达模式解析

【目的】二斑叶螨（Tetranychus urticae）是一种重要的农业害螨,由于个体小、繁殖快等特点,极易产生抗药性,论文从生理生化和分子水平探讨二斑叶螨mRNA水平相对表达量的变化,旨在明确二斑叶螨对混剂的多重抗性机制,为该螨的综合治理提供依据。【方法】在温度（25±l）℃,相对湿度60%±5%,光周期L﹕D=16 h﹕8 h的室内条件下,于盆栽豇豆苗上饲养不接触任何药剂的二斑叶螨敏感品系（SS）和用螺螨酯、甲氰菊酯、阿维菌素以其单剂的致死中浓度（LC50）为汰选浓度混合连续汰选的多重抗性品系（Mp-R）;Mp-R品系用药4-5次待其种群扩增后,参照FAO推荐的叶片残毒法进行室内毒力测定一次,计算其LC₅₀,求出抗性倍数（RR）,并记为一个汰选周期;连续汰选3个周期后,逐渐增加汰选浓度,用PoloPlus软件求其毒力回归方程、LC50、抗性指数及卡方值;采用生化分析法测定选育50代的二斑叶螨SS与Mp-R品系卵、幼螨、若螨、雄成螨、雌成螨的谷胱甘肽S转移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarEs）、多功能氧化酶（MFOs）的活性,以ELFn为内参基因,采用RT-qPCR技术以比较Ct值的方法计算二斑叶螨Mp-R品系中10个与抗性相关的解毒酶基因的表达量。【结果】在室内经50代抗性选育,二斑叶螨对阿维菌素、甲氰菊酯及螺螨酯的LC₅₀分别达到1 103.55、5 993.33和2 345.62 mg·L^-1,抗性倍数分别为603.03、167.65和51.77倍。卵中Mp-R品系MFOs比活力显著高于SS品系,GSTs、CarEs比活力差异不显著;其他发育阶段Mp-R品系的GSTs、CarEs比活力显著高于SS品系,MFOs比活力则差异不显著;Mp-R品系雌成螨的GSTs、CarEs比活力显著高于其他发育阶段,卵的MFOs比活力显著高于其他发育阶段。与敏感品系相比,二斑叶螨TuGSTd05、TuGSTd06与TuGSTd09基因表达量在Mp-R品系各发育阶段显著上调1.80倍以上,TuGSTd01表达量在若螨期显著上调1.63倍,其他发育阶段差异不显著;CYP392E10表达量在卵中极显著上调5.87倍,幼螨、若螨阶段显著上调2.15倍和2.09倍,成螨阶段表达量差异不显著;CYP392A6在卵、幼螨与若螨阶段表达量均显著上调1.89、1.64和1.59倍,在成螨阶段表达量差异不显著。CYP392A16在各发育阶段均极显著上调,卵中上调6.97倍,幼螨中上调8.20倍,若螨中上调8.88倍,雄成螨上调7.34倍,雌成螨上调8.59倍。CYP392D 8在卵、幼螨和雄、雌成螨中表达量均显著上调2.18、2.00、2.03和2.41倍,在若螨阶段表达量差异不显著;TuCCE35在若螨及雄、雌成螨中表达量显著上调1.58、1.86和2.65倍;TuCCE36在卵和雄、雌成螨中表达量显著上调1.73、1.89和2.14倍。【结论】与敏感品系相比,二斑叶螨Mp-R品系10个与抗性相关的解毒酶基因表达量在其不同发育阶段均有不同程度的变化。CYP392A16表达量在各发育阶段上调较大,可能参与了二斑叶螨多重抗性的形成;其余基因表达量均未见大幅度上调,这些基因是否参与了对3种药剂的代谢还需进一步验证。     

中华稻蝗羧酸酯酶家族基因生物信息学及组织表达特异性分析

【目的】对重要农业害虫中华稻蝗（Oxya chinensis）羧酸酯酶（carboxylesterases,Ces）家族基因进行生物信息学分析,并对部分基因的组织表达特性进行研究,为揭示中华稻蝗Ces基因功能及研发新的分子靶标提供依据。【方法】基于中华稻蝗转录组数据库,通过关键词搜索获得Ces基因序列,采用生物信息学方法进行比对拼接、氨基酸序列推导和开放阅读框分析,选择全长序列构建系统发育树,采用在线软件分析中华稻蝗Ces氨基酸序列结构、理化性质、信号肽和N糖基化位点等特征。采用实时定量PCR技术,通过geNorm 与Normfinder 软件分析4个候选内参基因β-肌动蛋白（β-actin）、延长因子（EF1α）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）和核糖体蛋白49（RP49）表达稳定性,筛选中华稻蝗5龄若虫不同组织部位最适内参基因并检测10个羧酸酯酶基因在不同组织部位相对表达量。【结果】从中华稻蝗转录组数据库搜索获得Ces基因cDNA片段180个,经筛选获得28个Ces基因全长序列进行生物信息学分析。推导的氨基酸序列与其他昆虫物种的聚类分析结果显示,中华稻蝗28个Ces分布于4个功能簇中,其中A簇直翅目和部分双翅目昆虫α酯酶（20个）、D簇表皮特异酯酶（2个）、E簇β酯酶（4个）和F簇非鳞翅目保幼激素酯酶（2个）。氨基酸序列分析结果显示,中华稻蝗大部分Ces的等电点（pI）均为偏酸性或弱酸性,pI为4.38-6.84,只有3个Ces的pI值偏碱性。中华稻蝗所有的Ces基因都具有N糖基化位点、N端保守的半胱氨酸残基及氧离子洞,信号肽预测结果表明19个Ces具有完整的信号肽;21个Ces具有典型的催化三联体S-E-H,其余7个Ces催化三联体发生了不同的替换。GeNorm与Normfinder分析结果显示,4个候选内参基因稳定性EF1α=RP49＞β-actin＞GAPDH。选择EF1α作为内参基因,RT-qPCR结果显示10个羧酸酯酶基因在7个不同组织部位均有表达,其中OcCesA1、OcCesA6、OcCesA12、OcCesA14、OcCesA18和OcCesA19在中肠和胃盲囊高表达,此外OcCesA6、OcCesA18和OcCesA19还在马氏管高表达,OcCesA2在后肠高表达。OcCesD1在马氏管表达量最高,脂肪体和表皮次之;OcCesE1在胃盲囊表达量最高;OcCesF2在中肠表达量最高。【结论】基于中华稻蝗转录组数据库获得28个全长Ces基因,聚类分析结果显示,这些基因分布于4个功能簇中,其中分布于A簇的基因数目相对较多,且多在中肠、胃盲囊和马氏管等代谢解毒器官中高表达。研究结果为Ces基因功能的深入探索和中华稻蝗Ces基因分子靶标研发提供了依据。     

偃麦草基因组特异重复序列的分离与应用

【目的】偃麦草(Thinopyrum)是小麦(Triticum aestivum L.)的多年生野生近缘植物,具有许多可用于小麦品种改良的优异基因。利用基因组特异重复序列可以研究物种的进化关系、绘制染色体指纹图谱及检测外源染色质。克隆十倍体长穗偃麦草(Th.ponticum(Host)Liu and Wang)基因组特异重复序列,可用于鉴定和追踪导入到小麦背景中的偃麦草遗传物质。【方法】通过构建十倍体长穗偃麦草小片段质粒文库,并对文库进行高密度点杂交(Dot-blot hybridization)筛选,结合荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术,获得偃麦草基因组特异的重复序列,分析其在不同基因组及染色体上的分布特点。利用Repeat Masker在小麦族重复序列数据库(Triticeae repeat sequence database,TREP)及NCBI Gen Bank对特异重复序列进行比对分析,并设计偃麦草基因组特异重复序列的PCR引物。通过FISH分析和特异PCR引物扩增,对小麦-偃麦草衍生后代进行鉴定和选择。【结果】获得7条偃麦草基因组特异的重复序列。FISH分析表明,其在十倍体长穗偃麦草和六倍体中间偃麦草所有染色体两臂上均呈弥散型分布,且在不加小麦封阻DNA的情况下,能明确区分八倍体小偃麦中的偃麦草和小麦染色体。将其应用到小麦-偃麦草代换系和易位系的分子细胞学检测中,特异重复序列同样可以在不加封阻的情况下分辨出偃麦草染色体及染色体片段,而且信号相比基因组原位杂交(genomic in situ hybridization,GISH)更加特异和清晰。基于偃麦草基因组特异重复序列开发了90对引物,通过在中国春、十倍体长穗偃麦草和八倍体小偃麦中的扩增产物比较分析,筛选出36对(40%)偃麦草基因组特异PCR标记;利用这些特异引物对109份小麦-偃麦草衍生材料进行扫描,发现10对扩增效果较好的特异引物,其检测效率为73.3%—95%。【结论】获得偃麦草基因组特异的重复序列,开发了特异PCR扩增引物,可应用于小麦背景下偃麦草遗传物质的高效检测和跟踪。     

库尔勒香梨果实发育成熟的糖代谢和呼吸代谢响应特征

【目的】通过对库尔勒香梨果实发育及成熟过程果实糖代谢和呼吸代谢响应特征的研究,以探讨代谢互作对果实糖分动态积累的作用。【方法】花后60—150 d,每隔10 d取香梨样果,测定果肉、果心和果皮的质量,纵横径,淀粉及4种可溶性糖组分含量,不同途径呼吸速率,12种糖代谢酶与9种呼吸代谢酶活性的变化。通过回归分析、分阶聚类和主成分分析,确定果实发育及成熟不同阶段的质量与糖分的关系,呼吸主路径、代谢酶聚类关系对糖分构成的影响,以此讨论和构建香梨果实糖代谢和呼吸代谢的关联路径及不同部位的代谢特征。【结果】果心以糖酵解为呼吸主路径,果肉的糖酵解与三羧酸循环交替构成呼吸主路径,果皮呼吸主路径由糖酵解和三羧酸循环共同构成。果心和果肉的糖代谢与呼吸代谢可从花后90 d分为两种不同的响应模式,果皮的代谢响应在花后120 d变化明显。成熟期果心的淀粉、蔗糖、山梨醇代谢酶与糖酵解、磷酸戊糖途径、细胞色素途径代谢酶关联聚类;果肉的淀粉、蔗糖代谢酶与糖酵解、三羧酸循环、交替途径、细胞色素途径代谢酶关联;果皮的蔗糖、山梨醇代谢酶与糖酵解、三羧酸循环、交替途径、细胞色素途径代谢酶存在较高的聚类相关。聚类关联酶活性升高或达到峰值,与果心和果肉的果糖、葡萄糖积累,果皮山梨醇转化和果糖、葡萄糖含量升高显著关联。【结论】库尔勒香梨果实以果糖和葡萄糖为主成分的糖分积累构成典型的内在品质,存在果实成熟时糖分构成与甜度的部位异质,是发育与成熟不同阶段糖代谢与呼吸代谢不同动态响应累积的结果。磷酸己糖异构酶与细胞色素氧化酶是香梨果实3个部位同时在成熟阶段交联呼吸代谢与糖代谢的关键酶。     

橡胶草法尼基焦磷酸合酶基因的克隆与功能分析

【目的】法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase,FPS）是天然橡胶生物合成的甲羟戊酸途径中的关键酶,获得橡胶草FPS基因并转化野生橡胶草,为研究FPS基因在橡胶草橡胶生物合成过程中的调控作用奠定基础。【方法】采用同源克隆的方法获得橡胶草FPS基因全长cDNA序列,并对该基因进行生物信息学分析。对橡胶草和其他18种不同高等植物的FPS氨基酸序列进行多序列比对及进化树分析。提取橡胶草不同组织：根、叶柄、叶、花梗、花和种子RNA,对FPS基因进行组织特异性表达分析,并对不同生长时期的橡胶草FPS表达量进行比较,分析橡胶草生长过程中FPS的调节作用。将该基因在野生型橡胶草中过表达,对得到的转基因和野生型植株FPS相对表达水平进行分析,比较转基因和野生型植株橡胶含量的变化。碱煮法提取转基因和野生型橡胶草根部的橡胶,测定橡胶含量。【结果】获得橡胶草FPS基因全长cDNA序列,命名为TKFPS（GenBank登录号 KJ558350.1）。序列分析表明该基因包含1个1 029 bp的完整开放阅读框,编码342个氨基酸,编码的蛋白质相对分子量为39.35 kD,理论等电点（pI）为5.41,平均疏水性为-0.242。多序列比对结果表明,橡胶草FPS氨基酸序列含有高等植物FPS基因的5个保守结构域,系统发育分析结果显示新疆野生橡胶草与蒲公英处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和TargetP亚细胞定位分析得知,TKFPS 蛋白无跨膜区域,可能定位于细胞质中发挥功能。组织特异性分析结果表明TKFPS在橡胶草的根、叶柄、叶、花梗、花、种子中均有表达,其中,在叶中表达量最高,根次之,在花中表达量最低。重组子pCAMBIA2300-35S-TKFPS经农杆菌介导法转化野生橡胶草叶盘,得到6株转基因植株。实时荧光定量PCR检测发现,与野生型相比,转基因株系FPS的相对表达量水平明显升高,6株转基因株系TKFPS表达量平均约是野生型的2.8倍。橡胶含量测定结果表明6株转基因株系的根中橡胶质量分数平均比野生型增加了3.92%。【结论】成功从橡胶草中克隆获得TKFPS,并转化野生橡胶草得到转TKFPS的高产橡胶草株系,FPS在橡胶草产胶过程中发挥重要功能。     

茄萼花色苷合成相关基因DFR和MYB克隆及表达分析

【目的】花色苷是一类通过类黄酮途径合成的水溶性次生代谢产物,既能使植物的不同器官呈现红、紫、蓝等颜色,还有利于人体健康。紫茄富含花色苷,但是有关茄萼花色苷生物合成的分子机制还不是很清楚。本研究旨在通过克隆茄萼花色苷合成相关基因DFR和MYB,测定其在不同发育时期不同颜色茄萼中的表达量,探究DFR和MYB在茄萼花色苷合成中的作用。【方法】选用绿萼和紫萼长茄(Solanum melongena L.)果萼为试材,测定不同p H条件下茄萼花色苷含量;通过RACE方法分离克隆DFR和MYB cDNA全长序列,分析DFR和MYB的保守结构域及序列特征;分别对DFR和MYB及其同源蛋白序列进行系统进化分析,构建系统进化树来进一步分析鉴定基因;使用Ex PASy网站提供的在线分析软件SOPMA预测蛋白质二级结构;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在不同发育阶段果萼中的表达情况。【结果】从绿萼和紫萼长茄果萼中克隆了DFR和MYB片段,分别命名为ouSmDFR、dongSmDFR和ouSmMYB、dongSmMYB,Gen Bank登录号分别为:KX224250、KX224251和KX224253、KX224254。ouSmDFR和dongSmDFR全长分别为1 285 bp和1 249 bp,开放阅读框为858 bp和864 bp,分别编码285个和287个氨基酸;ouSmMYB和dongSmMYB全长分别为969 bp和959 bp,开放阅读框均为462 bp,编码153个氨基酸。蛋白质二级结构分析表明α-螺旋和无规则卷曲均为两个DFR蛋白和两个MYB蛋白的主要二级结构元件。序列比对表明DFR蛋白具有NADPH结构域(NADPH binding domain)和底物特异性结合结构域(Substrate specific binding domain),属于NADB-Rossmann超基因家族;MYB蛋白属于R2R3-MYB转录因子,具有R2、R3两个MYB结构域和b HLH结合域。ouSmDFR和dongSmDFR与St DFR和Sl DFR具有相对较高的同源性;ouSmMYB和dongSmMYB与Es MYB同源性较高。花色苷含量测定显示,紫萼果茄萼花色苷含量较高且随着果实的发育成熟而逐渐增加;而绿萼茄萼几乎检测不到花色苷。荧光实时定量PCR分析表明,DFR和MYB在紫萼长茄果萼中表达量均远高于绿萼长茄;从初蕾期到盛花期,紫萼长茄果萼中DFR和MYB表达量逐渐升高,而绿萼长茄则几乎没有变化,与两个品种茄萼颜色变化相一致。【结论】ouSmDFR和dongSmDFR属于NADB-Rossmann超基因家族,ouSmMYB和dongSmMYB为典型R2R3-MYB转录因子,DFR和MYB在紫萼长茄果萼中表达明显高于绿萼长茄。推测DFR和MYB在茄萼呈色中发挥作用,并且参与花色苷生物合成。     

橘小实蝇幼虫解毒酶系基因应对高效氯氰菊酯胁迫的组织特异性表达

【目的】基于橘小实蝇（Bactrocera dorsalis）转录组数据,系统分析橘小实蝇幼虫解毒代谢酶系基因在受到高效氯氰菊酯持续胁迫时的表达模式,鉴定其中起主要作用的基因,并探讨这些基因组织差异表达的生物学意义。【方法】利用qPCR技术检测橘小实蝇幼虫受到高效氯氰菊酯持续胁迫后,30个解毒代谢酶系（GSTs、P450s、CCEs）基因在整虫、中肠以及脂肪体的表达水平变化情况。【结果】在高效氯氰菊酯持续胁迫作用下,橘小实蝇8个GSTs基因中,其mRNA表达量出现明显上调的主要是Delta家族的4个基因,它们在中肠和脂肪体均出现了5.6-32.5倍的过量表达,而其他家族的GSTs基因经高效氯氰菊酯胁迫后没有出现明显的应激反应。同时,Delta家族的GSTs基因虽然在中肠和脂肪体对药剂胁迫有积极的响应,但是它们的表达在整虫却没有明显的变化。6个CCEs基因在整虫中出现一定程度的上调,其中α-E3基因的表达量上调了4.1倍,但是这些基因在中肠和脂肪体均没有出现上调的情况。16个P450s基因的定量分析结果表明,有多个P450s基因的mRNA的表达出现了上调,且大部分基因属于CYP4和CYP6两个家族。其中,CYP4家族中出现明显上调反应的主要有CYP4D47（中肠）、CYP4E9（整虫、脂肪体）和CYP4P5（整虫、脂肪体）。CYP4AD1的表达量在中肠和脂肪体均有一定程度的上调,而在整虫中没有变化。另外,CYP4S18和CYP4AC4没有出现应激表达或者表达量的变化不明显。CYP6家族中,CYP6A48和CYP6A41在脂肪体的表达量显著上调,分别提高了18.0和9.6倍,CYP6G6和CYP6A50在脂肪体的表达量也有一定程度的上升,而CYP6EK1的表达量虽然在整虫提高了4.8倍,但是在中肠和脂肪体并没有明显的变化。其他家族的P450s基因,如CYP12C2、CYP9F6、CYP12N1和CYP309B1等基因的表达量经高效氯氰菊酯胁迫后在脂肪体中也出现了显著的上调,而CYP317B1的表达量在药剂压力下并没有明显的变化。【结论】橘小实蝇幼虫在应对高效氯氰菊酯胁迫时,体内的解毒代谢酶系基因集中在中肠和脂肪体高水平表达,但存在整体保持平衡的现象,推测橘小实蝇在应对杀虫剂的持续胁迫时,存在趋于平衡的能量分配策略,即通过提高能量的利用效率,减少在抵御外源杀虫剂伤害时额外能量的消耗。这种可以避免出现适合度代价的策略可能是昆虫应对环境压力的一种重要适应机制。     

拟南芥硫苷生物合成相关基因的组织和胁迫诱导表达谱的全基因组分析

【目的】分析拟南芥中硫代葡萄糖苷（Glucosinolatcs,简称硫苷）生物合成相关基因在不同组织器官、不同发育时期及不同生物和非生物胁迫处理条件下的表达谱,为筛选控制硫苷合成的关键基因、解析硫苷的生物合成规律及其在植物抗逆胁迫过程中的作用奠定基础。【方法】利用AtGenExpress和PLEXdb中的10组表达谱芯片数据和2组转录组数据分析拟南芥中硫苷生物合成途径82个结构基因和调控基因的时空表达特性及其受生物和非生物胁迫的表达模式;采用Real-time PCR技术对10个硫苷合成途径的关键结构基因和调控基因的表达谱进行验证;并利用STRING v10软件分析硫苷生物合成途径相关基因的表达模式的相关性。【结果】组织表达特性分析结果表明,拟南芥硫苷生物合成相关基因在营养器官和生殖器官中的表达模式差异较大,相关基因在营养器官中具有较高的表达量,在生殖器官中的表达量则较低,表明硫苷主要在营养组织中合成;其中脂肪族硫苷合成相关基因在茎、叶等地上营养组织中的表达量较高,而吲哚族硫苷合成相关基因则在根、茎、叶等地上和地下组织中均有较高的表达,且基因在同一组织的不同发育时期的表达量通常具有差异,表明基因的表达还具有时空特异性;荧光定量PCR分析结果证明10个硫苷合成途径代表基因的表达谱与芯片数据的结果保持一致;胁迫表达分析结果表明,脂肪族和吲哚族硫苷合成相关基因的表达均受到部分生物和非生物胁迫因子的诱导表达,其中吲哚族硫苷合成相关基因更易受到丁香假单胞杆菌（Pseudomonas syringae）、甘蓝链格孢菌（Alternaria brassicicola）、桃蚜（Myzus persicae）等生物和低温（4℃）、高盐、高温（38℃）等非生物胁迫因子的诱导表达;共表达分析结果表明,脂肪族和吲哚族硫苷合成分支途径内相关调控基因与结构基因的表达模式的相关性较高。【结论】拟南芥硫苷生物合成相关基因主要在营养组织中高表达,在种子中低表达;植物中存在一个硫苷转运系统,负责将营养组织中合成的硫苷转运到种子中贮藏;硫苷合成相关基因的表达受到病原菌、虫害、高温等逆境因子的影响,其中吲哚族硫苷合成相关基因更易受到生物和非生物胁迫因子的诱导表达,说明吲哚族硫苷可能对植物抗性更为重要。