基于比较转录组学分析揭示中华蜜蜂及意大利蜜蜂幼虫的球囊菌抗性差异机制

为探究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,以下简称中蜂)与意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,以下简称意蜂)幼虫的球囊菌(Ascospahaera apis)抗性差异产生的原因,利用Venn分析、GO分类分析、KEGG代谢通路分析以及Ka/Ks分析对二者的转录组进行比较研究。Venn分析结果显示,中蜂与意蜂的同源基因有17 656个,归属于8 111个基因家族,二者的特有基因分别有1 158和241个,分别归属于468和86个基因家族。GO分类结果显示,中蜂和意蜂的特有基因分别富集在38和28个GO条目。KEGG代谢通路富集分析结果显示,中蜂和意蜂的特有基因分别富集于96和21个代谢通路;进一步分析发现中蜂的特有基因富集在内吞作用、溶酶体、泛素介导的蛋白水解和黑化作用等4个细胞免疫通路,以及MAPK信号通路和Toll-like受体信号通路等2个体液免疫通路,而意蜂仅有1个特有基因富集在MAPK信号通路。Ka/Ks分析结果显示受到强烈正向选择、弱正向选择、中性选择和负向选择的单拷贝同源基因分别有37、281、2 630和3 269个。对受到强烈正向选择的基因进行GO分类和KEGG代谢通路富集分析,GO结果显示中蜂和意蜂的单拷贝同源基因富集的GO条目类型相同;KEGG结果显示中蜂的单拷贝基因仅富集在氧化磷酸化。上述结果表明免疫相关基因数量的差异是二者的球囊菌抗性差异产生的重要原因之一,中蜂在与球囊菌的协同进化过程中可能通过提高能量利用从而限制球囊菌的增殖。本研究结果可为阐明中蜂及意蜂幼虫的球囊菌抗性差异产生的分子机制提供参考。     

胁迫中华蜜蜂幼虫肠道的球囊菌及其体外培养的高表达基因分析

利用RNA-seq技术对胁迫中华蜜蜂(简称中蜂)6日龄幼虫肠道的球囊菌及其体外培养进行深度测序,根据基因的FPKM值筛选得到高表达基因(HEGs),进而对HEGs进行GO及KEGG代谢通路(pathway)富集分析.Illumina测序数据经质控和过滤得到100814558条有效读段(clean reads),平均Q30均在93.81%以上.GO富集分析结果显示处理组(Aac T)的HEGs富集于39个GO term,基因富集数最多的是细胞(1872 unigene)、细胞组件(1872 unigene)和细胞进程(1748 unigenes);对照组(Aa CK)的HEGs富集于37个GO term,基因富集数最多的是细胞(785 unigenes),其次是细胞组件(785 unigenes)和代谢进程(776 unigenes).KEGG pathway富集分析显示,Aac T的HEGs富集在119个代谢通路上,基因富集数最多的是核糖体(176 unigenes)、碳代谢(147 unigenes)及氨基酸的生物合成(134 unigenes);Aa CK的HEGs富集在110个代谢通路上,基因富集数最多的是核糖体(179 unigenes)、氨基酸的生物合成(70 unigenes)以及碳代谢(62 unigenes).深入分析发现,对于富集在MAPK信号通路上的高表达基因数量,胁迫中蜂幼虫肠道的球囊菌远多于体外培养的球囊菌,说明病原的该通路在胁迫后期被显著激活.     

基于RNA-seq数据大规模挖掘蜜蜂球囊菌的SSR分子标记

基于已获得的球囊菌转录组数据预测微卫星标记(SSR),并进行SSR位点的信息分析和SSR引物的挖掘.利用软件MISA对球囊菌转录组中42610条unigenes进行搜索,共预测出7968个SSRs,分布于5233条unigenes中,其中最主要的重复类型为三核苷酸重复(53.15%),其次为二核苷酸重复(32.32%)和四核苷酸重复(8.46%).二核苷酸重复中的基序主要是AG/CT(占总量的15.8%).针对所有的SSR位点,利用Primer Premier 5软件设计出6956对SSR特异性引物,随机选取20对引物对两个不同来源的球囊菌样品进行SSR位点扩增,共有6对引物成功扩增出符合预期的目的片段.研究结果表明,利用球囊菌转录组数据开发SSR引物是可行的.     

意大利蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫的可变剪接基因分析

为探讨可变剪接基因在宿主响应球囊菌(Ascosphaera apis)胁迫过程中的作用,基于前期已获得的意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)幼虫肠道转录组数据进行可变剪接基因分析。在正常的意蜂4日龄幼虫肠道(AmCK),球囊菌胁迫的意蜂4、5和6日龄幼虫肠道(AmT1、AmT2、AmT3)中共鉴定出55 895个可变剪接事件,以外显子跨越和可变3′端剪接为主。各样品的共有可变剪接基因数为8 157个,AmT1、AmT2、AmT3的特有可变剪接基因数分别为207、334和542个。GO分类结果显示共有可变剪接基因分布在50个GO条目。KEGG代谢通路富集分析结果显示,共有可变剪接基因富集在290个pathway,基因富集数最多的是内质网蛋白加工、RNA运输和碳代谢。上述分析结果揭示了可变剪接基因在意蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫过程中的重要作用,为深入研究可变剪接基因的功能打下了基础。     

中华蜜蜂幼虫肠道参考转录组的de novo组装及SSR分子标记鉴定

【目的】利用RNA seq技术对中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫肠道参考转录组进行de novo组装,并进行功能及代谢通路注释,进而利用该转录组数据进行中蜂幼虫的SSR分子标记鉴定。【方法】实验室条件下饲养中蜂幼虫,将纯化的蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)孢子饲喂3日龄幼虫,剖取4、5和6日龄幼虫肠道,液氮速冻。将健康幼虫肠道与感染球囊菌的幼虫肠道同时进行Illumina测序。通过对raw reads的过滤得到clean reads,利用Trinity软件组装得到unigenes。通过BLASTx(E-value10-5)比对NCBI Nr、Swiss-Prot、KOG和KEGG数据库,对unigenes进行功能和代谢通路注释。利用MISA软件对所有unigenes进行SSR搜索,并利用Primer Premier 5软件设计特异性SSR引物,通过常规PCR对来源于北京、辽宁兴城和四川成都的中蜂幼虫肠道样本进行SSR位点鉴定。【结果】中蜂幼虫肠道的RNA seq共得到35 670 000条reads,de novo组装得到43 557个unigenes,平均长度为898 nt。共有18 225个unigenes可被注释到上述公共蛋白数据库,单独注释到NCBI Nr、Swiss-Prot、KOG和KEGG数据库的unigenes数分别为3 899、443、37和10个。KOG注释结果显示,11 442条unigenes分布于25个基因家族,其中注释到RNA加工和修饰家族的基因数最多,达1 249个。9 679个unigenes的GO分类结果显示,在生物学进程分类中,注释到细胞进程的基因最多,达4 201个,在分子功能和细胞组分类中,注释到结合与细胞的基因数最多,分别为4 935和2 900个。4 517个unigenes可注释到KEGG数据库中的216个代谢通路,注释到核糖体的基因数最多,达385个。利用MISA软件,可在7 763个unigenes搜索到13 448个SSR位点,随机选取20对SSR引物对国内3个不同来源的中蜂幼虫肠道样本的SSR位点进行扩增,有6对引物可鉴定出SSR分子标记。【结论】成功组装并注释了中蜂幼虫肠道参考转录组,可为中蜂及其幼虫的分子生物学及组学研究提供重要的参考信息,也可用于补充、丰富和检验东方蜜蜂的参考基因组,基于此转录组数据开发出6个中蜂的SSR分子标记,可应用于中蜂的基因图谱构建、基因多样性分析、基因定位等研究,也说明利用转录组数据开发非模式生物SSRs的方法可行。     

二化螟幼虫热胁迫响应的转录组分析

二化螟(Chilo suppressalis)对温度的适应能力很强,在高温环境下,二化螟幼虫体内能产生热激蛋白、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等抗氧化物质来消除氧化应激反应对其身体的伤害。本研究旨在通过高通量测序技术对分别置于38℃和26℃中2 h的二化螟幼虫进行比较转录组学分析,从转录组水平揭示短时高温胁迫对二化螟幼虫的影响。分析结果显示,所有样品的转录组序列比对到参考基因组上的序列占总体的百分比均超过89%,在参考基因组中有唯一比对位置的测序序列占总体的百分比均高于82%,有多个比对位置的序列占总体的百分比均不超过9%。通过差异表达分析得到387个差异表达基因,其中,热激蛋白和细胞色素P450这两类与二化螟热胁迫响应相关的基因为上调表达。对上调的差异基因进行KEGG富集分析,发现内质网内蛋白质加工、寿命调节通路-多物种、植物病原体相互作用和抗原处理及呈现这4条通路为显著富集。本研究揭示了二化螟幼虫热胁迫响应相关基因的总体表达特征,同时可为二化螟热胁迫响应的相关试验提供参考。     

中华蜜蜂幼虫肠道中微小RNA的鉴定及分析

[目的]利用small RNA-seq(sRNA-seq)技术和生物信息学方法对中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫肠道的微小RNA(microRNA,miRNA)进行全转录组鉴定和分析,旨在丰富中蜂的miRNA信息,并为深入研究miRNA调控中蜂幼虫肠道发育的分子机理提供依据.[方法]利用s...     

中华蜜蜂幼虫信息素鉴定

 【目的】分析鉴定中华蜜蜂(Apis cerana cerana)幼虫是否含有与西方蜜蜂（Apis mellifera）幼虫相同的幼虫利它素和信息素及其在不同日龄阶段幼虫的分布情况。【方法】以中华蜜蜂为试验材料,取2日龄、6日龄（即将封盖）和7日龄（封盖后）的工蜂幼虫及2日龄、7日龄（即将封盖）和8日龄（封盖后）的雄蜂幼虫,经过正己烷浸泡碾碎,取上清液并进行层析过柱分离,应用气相色谱来研究中华蜜蜂幼虫利它素和信息素。【结果】本研究首次发现中华蜜蜂幼虫信息素含有甲基棕榈酸酯（MP）、甲基油酸酯(（MO）、甲基硬脂酸酯（MS）、甲基亚油酸酯（ML）、甲基亚麻酸酯（MN）、乙基棕榈酸酯（EP）、乙基油酸酯（EO）、乙基硬脂酸酯（ES）、乙基亚油酸酯（EL）和乙基亚麻酸酯（EN）。【结论】中华蜜蜂幼虫含有与西方蜜蜂幼虫相同的幼虫利它素和10种脂肪类信息素,但这两种蜜蜂信息素的含量及在不同日龄幼虫分布规律不同。     

蜜蜂球囊菌分泌多种胞外酶侵染蜜蜂幼虫

对健康和患病蜜蜂幼虫血淋巴进行SDS-PAGE电泳和蛋白酶、酯酶的活性染色,以研究蜜蜂球囊菌分泌的胞外酶种类及对蜜蜂侵染的作用.结果表明:健康蜜蜂幼虫血淋巴中的蛋白含量丰富,主要由4种高分子质量的蛋白组成,而患病幼虫血淋巴中的蛋白含量很少,主要蛋白组分被降解;在患病幼虫血淋巴中可以检测到健康幼虫所没有的多种蛋白酶和酯酶...     

利用第三代纳米孔长读段测序技术构建和注释蜜蜂球囊菌的全长转录组

[目的]利用第三代纳米孔(nanopore)长读段测序技术对蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)的纯化菌丝(Aam)和孢子(Aas)进行测序,构建和注释球囊菌的高质量全长转录组.[方法]通过Oxford Nanopore PromethION平台对Aam和Aas进行测序.利用Guppy软件对原始读...     

中华蜜蜂和意大利蜜蜂耐寒性能差异比较

【目的】研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)和意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)体内抗寒系统的组成,为探究中蜂和意蜂耐寒性能的差异提供理论依据。【方法】试验选取室外相同环境条件越冬的中蜂和意蜂各5群,于2015年12月20日每群随机选取蜜蜂立即测定两者的过冷却点、冰点,比较其耐寒性能差异。然后分别测定蜂体游离水、结合水、脂肪、糖原和蛋白质含量以及海藻糖酶的活性。利用高效液相色谱测定血淋巴中山梨醇、海藻糖、甘露醇的含量。在海藻糖的生物合成通路中确定4个重要调控基因,选择β-action和β-肌动蛋白分别作为中蜂和意蜂的内参基因,采用实时荧光定量PCR检测中蜂和意蜂海藻糖4个相关调控基因在越冬期时m RNA相对表达量的差异。【结果】越冬期中蜂和意蜂过冷却点差异显著,中蜂的过冷却点显著低于意蜂(P0.05),但二者冰点没有显著性差异(P0.05);越冬期中蜂和意蜂蜂体含水量存在显著差异,中蜂体内游离水含量显著低于意蜂(P0.05),而结合水含量显著高于意蜂(P0.05);越冬中期蜂体脂肪含量在两蜂种间差异不显著(P0.05);中蜂和意蜂蜂体和血淋巴蛋白质含量差异不显著(P0.05);意蜂在越冬期时体内糖原含量明显低于中蜂,并且差异显著(P0.05);中蜂血淋巴中甘露醇、山梨醇含量接近于意蜂的两倍,海藻糖含量也相对高于意蜂,差异显著(P0.05);中蜂蜂体和血淋巴的海藻糖酶活性均显著低于意蜂(P0.05);以中蜂为对照组,实时荧光定量PCR检测意蜂的海藻糖酶基因(Tre-2)和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGP)表达量明显高于中蜂(P0.05);而基因Tre-1表达情况相反;海藻糖合成酶基因(TPS)表达量在中蜂和意蜂体内无显著差异(P0.05)。【结论】与意蜂相比,中蜂能够通过降低体内游离水含量,提高糖原和小分子糖含量,调节海藻糖酶活性和相关基因表达等方式降低体内过冷却点,提高自身耐寒性能。     

气味受体基因Orco在中华蜜蜂雄蜂触角中的表达及定位分析

【目的】昆虫气味受体（odorant receptors, Ors）在其发挥嗅觉识别过程中采用的是配体门控离子通道信号传导机制,这一离子通道是由一个特定的共受体与一个普通气味受体结合为异源二聚体而形成的。其中,气味共受体（odorant receptor coreceptor, Orco）是一个十分独特的家族,在不同种类昆虫中高度保守,并在调控昆虫的嗅觉行为方面发挥关键作用。论文在对中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）工蜂Orco研究基础之上,进一步探讨雄蜂Orco的表达特性。【方法】采集中蜂1日龄雄蜂的触角、头（去除触角）、胸、腹、足5部分组织,以及不同发育阶段的幼虫、蛹及成蜂触角。提取各样本的总RNA,利用real-time quantitative PCR（qPCR）技术鉴定Orco在雄蜂不同组织及不同发育时期的表达谱;采集1日龄雄蜂触角制备冰冻切片,合成地高辛标记的寡核苷酸探针,利用原位杂交技术对Orco在雄蜂触角中的表达进行细胞定位分析。【结果】qPCR分析结果表明,Orco转录本在不同组织中的表达量表现为触角>头>足>腹>胸,其中触角表达量约为头部的100倍;Orco在雄蜂不同发育阶段均有表达,其中幼虫期和蛹期表达量较低,羽化后开始逐渐升高,性成熟后维持在一个较高的水平。此外,结合前期工蜂荧光定量试验数据,分析得到Orco在雄蜂触角中的表达量极显著高于工蜂触角表达量（P＜0.01）。原位杂交结果显示,Orco阳性杂交信号大量表达于雄蜂触角的板型感器和毛型感器的神经元细胞中。【结论】气味受体基因Orco在中蜂雄蜂的触角中大量表达,且在性成熟后表达量达到高峰。结合前期研究结果,推测Orco在中蜂中是偏雄性表达的。     

中华蜜蜂二倍体雄蜂人工培育及形态测定

【目的】研究中华蜜蜂（Apis cerana cerana）二倍体雄蜂并进行人工培育,测定其形态指标,明确中华蜜蜂二倍体雄蜂的生物学特性。【方法】采用复式移虫方法培育中华蜜蜂蜂王,待蜂王性成熟时进行CO₂麻醉处理后放回原群,用糖水进行奖励饲喂。蜂王产下大量未受精卵,待雄蜂出房后采用颜料进行标记。雄蜂性成熟后,利用蜂王人工授精技术使蜂王与本群子代雄蜂进行母子回交（多雄交配）。控制蜂王产卵,将工蜂巢房中刚孵化的幼虫移至恒温恒湿培养箱（相对湿度：95%;温度：35℃）中进行人工培育。幼虫前3日龄食物配制为：蜂王浆90％,无菌水10％;第4-6日龄食物成分比例为：蜂王浆50％,葡萄糖6％,果糖6％,酵母抽出物1％,无菌水37％;从第7日龄起食物比例为：蜂王浆43％,葡萄糖9％,果糖9％,酵母抽出物1％,无菌水38％,直到幼虫进入排便期为止。采用流式细胞仪对人工培育和蜂群工蜂巢房出房的雄蜂进行倍性鉴定,并对蜂群工蜂巢房出房的单倍雄蜂和二倍体雄蜂进行形态指标测定比较。【结果】室内人工培育的中华蜜蜂总羽化率偏低,平均为36％,其中26.9％为雄蜂;通过流式细胞仪分析雄蜂倍性发现人工培育的雄蜂92％为二倍体,蜂群工蜂巢房中出房的雄蜂82%为二倍体雄蜂;形态指标测定显示,二倍体雄蜂的初生重与生殖器官重分别为99.78和6.05 mg,均比单倍体雄蜂（分别为105.64和7.02 mg）显著偏小,而前翅长、前翅宽、翅钩数等指标差异不显著。【结论】中华蜜蜂近亲交配的蜂群会产生二倍体雄蜂,部分二倍体雄蜂可在蜂群中发育至成蜂出房,其形态指标与单倍体雄蜂存在一定差异。     

环介导等温扩增（LAMP）技术检测蜜蜂球囊菌

【目的】建立一种快速、灵敏的检测蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,为监测和防治蜜蜂白垩病提供技术支撑。【方法】根据蜜蜂球囊菌特异性序列ITS区,用在线引物设计软件PrimerExplorer V4.0设计并合成4条特异性引物A.apis-F3 (5′-ACATTGCGCCCTCTGGTA-3′)、A.apis-B3 (5′-TGGTTAGACCGGACAGTCG-3′)、A.apis-FIP (5′-TAAGACGGGACGATCGCCC AACCTGTCCGAGCGTCATTG-3′)和 A.apis-BIP (5′-GAAAGGCAGTGACGGCGTCGGGCCACTAGAGCGAAAGAC-3′),进行LAMP扩增试验,分别设置Mg²⁺终浓度为0、2、4、6、8、10、12、14 mmol·L^-1, dNPTs终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L^-1, 内引物FIB/BIF终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol?L^-1,甜菜碱终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol·L^-1,反应温度为58、60、63、65℃,反应时间分别为30、40、50、60 min,并利用实时浊度仪测定浊度值和扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳来检测LAMP反应的结果,确定优化的LAMP检测体系。以东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）、蜜蜂微孢子虫（Nosema apis）、蜜蜂残翅病毒（Deformed wing virus,DWV）、蜜蜂囊状幼虫病毒（Sacbrood virus,SBV）、黑蜂王台病毒（Black queen cell virus,BQCV）和以色列急性麻痹病毒（Israel acute paralysis virus,IAPV）基因组为模板进行特异性验证。并用PvuⅠ酶切验证产物,最终确定LAMP反应体系的准确性;进而通过将蜜蜂球囊菌基因组DNA进行10倍梯度稀释,分别获得DNA浓度0.2231、0.2231×10^-1、0.2231×10^-2、0.2231×10^-3、0.2231×10^-4、02231×10^-5、0.2231×10^-6、0.2231×10^-7、0.2231×10^-8 μg·μL^-1作为模板,比较LAMP和普通PCR检测灵敏度,并检测验证该技术在临床应用上的可行性。【结果】建立了一种特异检测蜜蜂球囊菌的方法,反应条件优化后的检测体系为4 mmol·L^-1 Mg²⁺、1.2 mmol·L^-1 dNTPs、1.6 mmol·L^-1 FIP/BIP、0.4 mol·L^-1甜菜碱,并在63℃反应60 min可完成检测。选用蜜蜂球囊菌、东方蜜蜂微孢子虫、蜜蜂微孢子虫、蜜蜂残翅病毒、蜜蜂囊状幼虫病毒、黑蜂王台病毒和以色列急性麻痹病毒的基因组作为LAMP反应模板进行特异性检测,结果显示仅有蜜蜂球囊菌有扩增曲线和梯状条带,建立的LAMP检测体系有很好的特异性。将蜜蜂球囊菌基因组DNA浓度0.2231、0.2231×10^-1、0.2231×10^-2、0.2231×10^-3、0.2231×10^-4、0.2231×10^-5 μg·μL^-1作为模板进行PCR反应后,检测结果为阳性,随DNA浓度降低,电泳检测不能观察到PCR的扩增产物。进行LAMP反应时,浊度曲线和电泳条带显示可检测DNA浓度为0.2231×10^-6 μg·μL^-1。LAMP每反应检出量比PCR高10倍,并且方法简单、节省时间。【结论】成功建立了准确、快速、低成本的LAMP检测蜜蜂球囊菌技术,为相关研究和应用提供了技术支持。     

中华蜜蜂CREB基因的克隆及表达

【目的】克隆中华蜜蜂（Apis cerana cerana）的cAMP反应原件结合蛋白（cAMP response element binding protein,CREB)基因全长cDNA序列,预测该基因及其编码蛋白的理化性质,并解析中华蜜蜂CREB在大脑中的表达特征,为研究该基因在中华蜜蜂学习记忆过程中的生物学功能提供基础。【方法】以中华蜜蜂为试验材料,解剖其大脑获得脑组织,提取大脑组织的总RNA。在此基础上,利用RT-PCR技术克隆中华蜜蜂大脑的CREB基因(AcCREB),然后用DNAstar软件中的Seqman程序将CREB正反向测序后的序列拼接获得CREB基因的cDNA序列,其氨基酸序列通过Bioedit软件按照六框翻译而成;用BLASTn和BLASTp进行序列比对分析;用ClustalX进行多重序列比对和同源性比较;用MEGA软件的邻接法（neighbor-joining）构建系统进化树,明确其系统进化关系。并通过SMART数据库分析AcCREB的结构域。另外,将解剖好的蜜蜂大脑制成石蜡切片,并采用地高辛原位杂交技术分析AcCREB在中华蜜蜂大脑中的分布表达情况。【结果】中华蜜蜂CREB基因的cDNA全序列全长890 bp,编码240个氨基酸残基,序列提交到GenBank（登录号为KC814690）。其编码的蛋白预测分子质量为25.691 kD,等电点为5.82。结构域分析结果显示,该蛋白具有AA 89-131的PKID和AA 176-237的BRLA两个保守结构域。氨基酸序列比对结果显示,中华蜜蜂与西方蜜蜂、熊蜂、切叶蜂、大黄蜂、印度跳蚁、家蚕、埃及伊蚊、疟原虫、人类、小鼠10个物种的同源蛋白相似度分别为98.76%、98.35%、97.11%、94.09%、72.22%、58.97%、44.69%、41.69%、36.89%、36.89%。系统发育树显示该基因编码的蛋白质与西方蜜蜂的CREB亲缘关系最近,与熊蜂、大黄蜂之间的亲缘关系次之。另外,经过地高辛原位杂交技术处理后,在中蜂大脑蘑菇体的凯尼恩细胞、触角叶周围的细胞和大脑的髓质与小叶之间的细胞均有阳性着色,而且AcCREB在中华蜜蜂工蜂左右大脑的阳性着色不对称。【结论】AcCREB的氨基酸序列与西方蜜蜂、熊蜂、切叶蜂、大黄蜂高度同源,且基因在大脑中的分布暗示其可能参与了中华蜜蜂学习记忆过程。     

中华蜜蜂化学感受蛋白CSP1的功能模式分析及亚细胞定位

【目的】研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)重组化学感受蛋白CSP1与不同化学信息素的结合功能、模式及其亚细胞定位,明确触角特异表达的CSP1蛋白功能。【方法】将克隆的中蜂CSP1构建至p ET-32a(+)载体并转入BL21(DE3)感受态细菌中,挑取单克隆菌落接种于LB培养基,培养过夜后按1%(V/V)进行转接,继续培养至OD600≈0.4左右时,加入IPTG至终浓度为1 mmol·L~(-1)后继续诱导5 h。将诱导好的CSP1大肠杆菌菌液离心弃上清,再加入细菌裂解液超声破碎,离心后上清用镍柱对CSP1重组蛋白进行亲和层析纯化,再经PBS透析液透析后,最终获得可溶的具有生物活性的CSP1重组蛋白。设定荧光分光光度计的激发波长为281 nm,测定竞争性荧光探针1-NPN与CSP1的相互作用,用Scatchard方程计算其解离常数,再计算获得CSP1与各种候选化学信息素的亲和力。以CSPMbra A6晶体结构(PDB代码:1n8v)为模板,通过同源建模和分子对接解析CSP1蛋白与化学信息素的结合模式,根据Mol Dock Score选出最佳对接模型进行作用机理分析,获得结合时配基周围的CSP1残基分布以及氢键产生情况,以此获得信息素与CSP1的结合模式。最后将CSP1免疫注射兔子获得多克隆抗体,并对中蜂工蜂触角进行低温固定、脱水和包埋后进行超薄切片,然后对样品切片进行免疫胶体金电镜定位,以解析CSP1在触角感器中的亚细胞分布。【结果】成功诱导获得可溶性的重组中蜂CSP1蛋白,利用荧光光谱分析1-NPN与CSP1的解离常数K1-NPN为2.1μmol·L~(-1),结合位点数n为0.99,表明结合时基本以1:1结合,线性相关系数为0.9933。在9种化学信息物质中,CSP1与两种蜜蜂蜂王信息素成分对羟基苯甲酸甲酯(HOB)和9-羰基-2癸烯酸(9-ODA),和植物挥发物成分3-蒈烯均具有较强的结合能力,其中与CSP1亲和力最强的对羟基苯甲酸甲酯的[IC50]和解离常数KD分别达到10.1和7.68μmol·L~(-1)。分子对接显示不同配基与CSP1的结合分别是通过与CSP1疏水腔中特定氨基酸残基(或借助于氢键)作用结合。典型的如CSP1与HOB相互作用过程中,预测主要由8个氨基酸残基贡献能量,包括4个疏水性残基(Phe30、Phe44、Leu70和Phe85),3个极性中性残基(Tyr26、Tyr27和Ser41)以及1个酸性残基(Asp40),其中Asp40中两个羧基上的氧原子分别与HOB苯环中羟基上的氧原子分别产生一个氢键。免疫电镜定位结果显示CSP1主要表达于板形感器周围附属支持细胞中,少量表达于感器内部,这与气味结合蛋白的定位存在明显区别。【结论】中蜂CSP1与两种蜂王信息素成分和某些植物花香成分具有较强的结合能力,集合了信息素结合蛋白和普通气味结合蛋白的功能和相似的作用模式,但其亚细胞定位与气味结合蛋白存在明显区别,显示化学感受类蛋白生理特征的多样性。     

免移虫育王和两种酯类幼虫信息素对中华蜜蜂蜂王质量的影响

【目的】比较中华蜜蜂(Apis cerana cerana)免移虫育王和人工移虫育王培育的蜂王质量,明确幼虫信息素中的甲基棕榈酸酯（methyl palmitate,MP）和甲基亚油酸酯（methyl linoleate,ML）在育王过程中能否提高蜂王质量。【方法】以中华蜜蜂为试验材料,选择蜂群群势、蜂王年龄、子脾面积等基本一致的健康蜂群3群作为哺育群,群势均为5框,采用郎氏标准蜂箱饲养。另选择一群健康、蜂王产卵性能好的蜂群作为母群。免移虫育王和人工育王的比较过程中,每个哺育群中每种育王方式至少育王3次。幼虫信息素试验过程中,每个哺育群每种信息素至少采用人工育王法育王3次。试验期间,对蜂群进行奖励饲喂,提高工蜂哺育积极性。利用自主研制的塑料免移虫育王生产器进行免移虫育王,人工移虫育王则采用自制的蜡质王台。测定育王过程中的幼虫接受率和蜂王出房率,待蜂王出房后测定蜂王初生重、胸重、胸宽,将蜂王的单侧卵巢制成石蜡切片进行卵巢管计数,并采用荧光定量PCR测定蜂王腹部的卵黄原蛋白基因（Vitellogenin,Vg）和转铁蛋白基因（Transferrin,Trf）表达量,从而比较蜂王的质量。为了研究中蜂幼虫信息素中MP和ML在人工育王中使用能否提高蜂王的质量,采用人工移虫育王,在幼虫60—63 h的王台内分别注射1 µL MP和ML（浓度梯度为0、0.1%、1.0%、10.0%）,同样测定蜂王初生重、胸重、胸宽和卵巢管数以及其腹部Vg和Trf表达量等指标。【结果】免移虫育王的幼虫接受率为40.87%,蜂王出房率38.52%;人工移虫育王的幼虫接受率为74.38%,蜂王出房率69.13%。显然工蜂对于人工移虫育王中的蜡质王台更易于接受。免移虫育王培育的蜂王在初生重、胸重、胸宽、单侧卵巢管数和Trf表达量等与人工移虫育王的比较均差异不显著（P＞0.05）,平均值也较接近,但蜂王腹部Vg表达量显著高于人工移虫育王（P＜0.05）。在人工移虫育王蜂王幼虫60—63 h时加入MP（或ML）,不同浓度的MP对蜂王的各项指标均无显著影响（P＞0.05）;0.1% ML对蜂王质量也无显著影响（P＞0.05）;1.0% ML显著降低蜂王初生重、胸重及其腹部Vg的表达（P＜0.05）,对卵巢管数量无显著影响（P＞0.05）;10.0% ML显著降低蜂王的各项指标（P＜0.05）。MP和ML对蜂王Trf表达量均无显著影响（P＞0.05）。【结论】免移虫育王与人工移虫育王相比,王台接受率显著偏低（P＜0.05）,蜂王腹部的Vg表达量增加,但在蜂王初生重、胸部指标、单侧卵巢管数量及Trf表达量方面均无显著差异（P＞0.05）。MP和ML在人工移虫育王过程中的应用并不能达到提高蜂王质量的作用。