甘薯病毒病原相关的microRNA的挖掘及分析

【目的】甘薯的病毒种类比较多,不同的病毒感染会引起相应的症状变化,田间自然发病的甘薯表型不一,这可能与病毒感染类型有关。论文旨在鉴定和研究甘薯中与不同甘薯病毒感染相关的microRNA（miRNA）。【方法】采用Illumina公司高通量测序技术,对来自福建泉州地区同一品种（龙薯9号）、具有不同症状的叶片样本（畸形黄化、疱疹、褪绿矮化和曲叶,样本编号分别为Fj01、Fj02、Fj03和1H）进行高通量测序,利用生物信息学手段挖掘和分析差异表达miRNA,并对差异miRNA和病毒表达进行PCR验证,鉴定基因和病毒在样本中表达情况,分析测序数据的可靠性,利用生物信息学分析进行miRNA靶基因预测和功能分析,探究差异miRNA与病毒种类的相关性。【结果】通过与病毒数据库的比对,发现Fj01、Fj02、Fj03样本（除1H外）均感染了甘薯常见病毒,如甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV）、甘薯病毒2号（Sweet potato virus 2,SPV2）、甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）、甘薯G病毒（Sweet potato virus G,SPVG）、甘薯C病毒（Sweet potato virus C,SPVC）等,但Fj01、Fj02和Fj03这3个样本的症状并不一致,样本之间只在甘薯不常见的病毒种类中有差异,通过PCR验证了SPFMV和SPVC病毒在样本中的表达情况与测序数据基本一致。在4个样本中共鉴定出679个已知的miRNA和1 004个新的miRNA,通过配对比较分析,其中288个已知的miRNA和433个新的miRNA在4个样本之间有差异性表达,并且这些miRNAs,如miR-156、miR-157、miR-166等家族的成员在4个样本中表达模式各异。同时,采用实时荧光定量PCR验证几个差异miRNAs（如miR-156、novel-miR-40和miR-319m）在各个样本间的表达情况与测序结果基本一致,另外,与脱毒苗样本进行比较,检测到3个miRNA（miR-160a、miR-2096和miR-5387b）在4个症状样本中具有不同程度的上调表达,证明miRNA的表达与植株的表型有关。通过对miRNA靶基因的预测与分析,发现这些差异miRNA的靶基因多数为转录调控因子,编码蛋白多含有ZFP、WD、Myb、SPL等功能区域,这些因子多参与调控植物的基因、代谢通路和抗原识别等来调控植物生长发育、形态建成和抗逆性,表明这些miRNA靶基因的功能多样性。【结论】不同病毒感染确实能够引起miRNA差异表达,并且这些miRNA通过其靶基因参与调控植物的生长发育、抗胁迫性和防御。     

甘薯羽状斑驳病毒和褪绿矮化病毒双重 RT-PCR 检测方法的建立

根据 GenBank 中公布的甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）外壳蛋白（CP ）基因和甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV）热激蛋白（Hsp70）基因序列保守区域设计了2对特异性引物,通过 RT-PCR 反应程序的优化,建立了能同时检测 SPFMV 和 SPCSV 的双重 PCR检测体系。该检测体系能够1次扩增出 SPFMV 和 SPCSV 的特异性片段,片段大小为461 bp 和304 bp,测序结果表明,2种病毒序列与参考序列的同源性达93％以上。     

甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和矮化退绿病毒(SPCSV)的双重RT-PCR检测技术体系构建

在大田生产中,甘薯极易受到甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)和甘薯矮化退绿病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)的混合侵染,导致甘薯产量和品质严重下降,因此构建能同时检测SPFMV和SPCSV两种病毒的检测技术体系对甘薯病毒病(sweet potato virus disease,SPVD)的预防具有重要意义。RT-PCR病毒检测技术具有灵敏度高、特异性强的优点。针对SPFMV和SPCSV病毒分别设计4对和3对特异性引物,通过单一RT-PCR检测技术筛选出特异性强的引物和最佳退火温度;在双重RT-PCR检测体系中,针对SPFMV和SPCSV两种病毒的引物浓度组合设置5个处理,优化双重RT-PCR病毒检测技术体系。单一RT-PCR检测结果表明,SPFMVS2/A2和SPCSVS2/A2引物的特异性最强,目的片段大小为461bp,对于SPCSV病毒来说,SPCSVS2/A2引物的特异性最强,目的片段大小为304bp,最佳退火温度为56℃;在双重RT-PCR检测技术体系中,SPFMV/SPCSV的引物组合浓度比为1∶3时,目标片段扩增效果最好。对两种病毒最低检测浓度的测试结果表明,SPFMV和SPCSV两种病毒RNA的最低检测浓度相当于模板RNA浓度的10-4μL。双重RT-PCR检测技术体系的构建,为大田生产中受SPFMV和SPCSV共侵染的甘薯病毒病的预防提供技术支持。     

0.1%大黄素甲醚防控甘薯病毒病害介绍

一、研发背景甘薯病毒病害(SPVD)是由甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)同时感染甘薯并互作时,产生的甘薯病毒病害,是世界范围内对甘薯产业危害最大的病害之一。     

甘薯病毒病发生关键因素研究

【目的】 明确甘薯种薯携带的病毒种类与苗期病毒病发生率和严重度之间的关系,以及甘薯田烟粉虱发生量和带毒率与种薯带毒率之间的关系,建立甘薯苗期病毒病预测预报方法和种薯质量早期预警技术,为甘薯无病毒种薯生产和病毒病防控提供理论依据。【方法】 利用PCR和RT-PCR方法对随机采集的不同来源的甘薯种薯进行病毒检测,检测的病毒种类包括马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的甘薯羽状斑驳病毒（sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）、甘薯病毒C（sweet potato virus C,SPVC）、甘薯病毒G（sweet potato virus G,SPVG）、甘薯潜隐病毒（sweet potato latent virus,SPLV）和甘薯病毒2（sweet potato virus 2,SPV2）,毛形病毒属（Crinivirus）的甘薯褪绿矮化病毒（sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV）和黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus,CMV）以及甘薯双生病毒（sweepoviruses）等我国甘薯上常见的8类主要病毒。然后对检测的种薯进行育苗,出苗后调查薯苗的发病情况,分析种薯携带的病毒种类与苗期病害严重度之间的关系。2018年和2019年分别在河南、宁夏和陕西等地设置试验点,种植背景相同的甘薯品种商薯19原原种苗和脱毒试管苗,在甘薯生长期,采用黄板诱虫法调查各试验点烟粉虱发生量并采集烟粉虱活体,检测烟粉虱SPCSV带毒率。种薯收获后,随机取样对种薯SPCSV带毒率进行检测,分析甘薯田烟粉虱发生量和带毒率对种薯带毒的影响。【结果】 在检测的665块甘薯种薯中,有463块种薯携带病毒,育苗后有333块种薯的薯苗表现出叶片黄化、明脉、皱缩和植株矮化等病毒病症状。当种薯携带一种或多种马铃薯Y病毒属病毒时,薯苗病毒病症状主要为0—1级（其中,0级占60.6%;1级占31.8%）;当种薯携带甘薯双生病毒或甘薯双生病毒与马铃薯Y病毒属病毒的组合时, 薯苗病毒病症状主要为0—1级（其中,0级占55.3%;1级占32.9%）;当种薯携带SPCSV时,苗期病毒病症状显著加重,特别是当种薯同时携带SPCSV与马铃薯Y病毒属病毒时,薯苗显症率为100.0%,症状主要为3—9级（其中,3级和5级占49.0%、7级和9级占51.0%）。连续2年田间试验结果表明,甘薯田烟粉虱发生量和带毒率与种薯带毒率密切相关,回归方程为Y=9.628X₁+0.008X₂+6.537,R²=0.914,其中,Y为种薯SPCSV的带毒率,X₁为烟粉虱带毒率,X₂为烟粉虱发生量。【结论】 种薯携带SPCSV是苗期病毒病严重发生的关键因素,当种薯同时携带SPCSV与马铃薯Y病毒属病毒时,薯苗病毒病显症率和严重度显著增加。甘薯田烟粉虱发生量和SPCSV带毒率与种薯带毒率密切相关,烟粉虱是影响种薯携带SPCSV的关键因素。     

甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒检测方法的建立

为了建立甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)和甘薯矮化褪绿病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus, SPCSV)的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法，提高检测灵敏度，实现结果的可视化。根据SPFMV外壳蛋白基因(CP)的核苷酸序列和SPCSV的热休克蛋白基因(Hsp 70)的核苷酸序列设计4条RT-LAMP特异性引物，采取单因素优化试验，对RT-LAMP反应体系中的多个因素包括时间、温度、BST聚合酶、Mg²⁺、RNase抑制剂、dNTPs和Betaine浓度优化，恒温扩增60 min。经琼脂糖凝胶电泳分析，SYBR Green I可视化显色，结果表明：SPFMV的优化反应体系为：FIP/BIP 2μL、F3/B3 0.5μL、BST聚合酶1.0μL、dNTPs 0.6μL、MgSO₄ 1.5μL、RNase抑制剂1.0μL、Betaine 7μL,62℃60 min。SPCSV的优化反应体系为：FIP/BIP 2μL、F3/B3...     

反向斑点杂交法快速检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯G病毒

[目的]以克隆得到的甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）和甘薯G病毒（Sweetpotato virusG,SPVG）基因片段为探针建立反向斑点杂交技术体系,应用于甘薯组培脱毒苗带毒情况检测,为生产优质甘薯组培脱毒苗提供保障.[方法]根据已公布的侵染甘薯的SPFMV和SPVG的核苷酸序列设计两对特异引物,以RT-PCR法从染病的甘薯叶片扩增SPFMV和SPVG的两个片段,并以克隆到的两个病毒片段及内参基因Actin片段为探针建立反向斑点杂交体系.[结果]分别克隆出长度约310和500 bp的片段,经BLAST比对,所获得的310 bp片段为SPFMV的外壳蛋白基因片段,同源性为97％,500 bp片段为SPVG的外壳蛋白基因片段,同源性为99％.分别用带有SPFMV和SPVG片段的重组质粒pUC-SPFMV和pUC-SPVG进行反向斑点杂交,发现不同病毒能获得单一信号,无交叉现象.以染病甘薯和脱毒甘薯苗为样品,用该种病毒的探针进行反向斑点杂交,染病植株样品中能获得单一信号,而脱毒苗甘薯样品未见任何信号,杂交结果与RT-PCR检测结果一致.[结论]用建立的反向斑点杂交技术体系能有效检测甘薯中的SPFMV和SPVG,无交叉信号,可用于甘薯组培脱毒苗的前期检测.     

甘薯病毒病复合体（SPVD）对甘薯产量形成的影晌

为探索SPVD对甘薯生长发育和产量形成的影响．本试验以高淀粉甘薯品种西成薯007的病毒苗、常规苗和脱毒苗为试验材料研究了SPVD在甘薯植株上的作用机理．得出以下结论：SPVD可导致甘薯地上部丛生和矮化、叶片变小而体现有效叶面积低,叶绿素含量降低,“源”变小,同化能力和光合能力降低：“流”变小,最终导致生物产量降低．而汰除SPVD可增大叶“源”和叶绿素含量．提高植株的光合能力和“流”的通畅性,从而增加产量。SPVD可使甘薯植株的SOD、POD和CAT活性降低,MDA含量上升．抗氧化活性降低．细胞膜受到伤害,最终导致产量降低,而脱除SPVD可增加SOD、POD和CAT在植株体内的活性,从而降低MDA对植株的危害。SPVD的脱除可增加3．4％的茎叶产量和2．9％的鲜薯产量,而SPVD浸染可使茎叶和鲜薯分别降低69．9％和49．1％。     

甘薯羽状斑驳病毒RT-PCR检测

根据已报道的甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）外壳蛋白（CP）基因的核苷酸序列设计并合成特异性引物,建立SPFMV的RT-PCR检测程序。特异性和重复性实验结果表明,该方法能够检测SPFMV,具有很好的特异性和重复性。并对PCR产物进行测序鉴定,结果与报道的序列同源性为88.3%和98.6%,证实所扩增的片段是病毒基因的部分片段。     

日本紫色甘薯常见病毒病的检测

采用硝化纤维素膜酶联免疫吸附检测法 (NCM -ELISA)和症状诊断法 ,对从日本引进的紫色甘薯病毒病发生情况进行检测。NCM -ELISA检测结果表明 ,从日本引进的紫色甘薯分别感染了甘薯羽状斑驳病毒 (SPFMV)、甘薯轻度斑驳花叶病毒 (SPMMV)、甘薯褪绿斑点病毒 (SPCFV)、甘薯潜隐病毒 (SPLV)、C - 6病毒和C - 8病毒。其中 ,SPFMV和SPMMV感染最普遍 ,SPCFV和SPLV次之 ,而C - 6和C - 8感染较少。在供试的 14个日本紫色甘薯品种 (系 )中 ,A4、A5和山川紫等 3个品系 (种 )感染上述全部 6种病毒 ,其余 11个甘薯品系只是感染了其中几种病毒 ;症状观察结果表明 ,感染病毒的紫色甘薯叶片出现明显的症状 ,主要表现为褪绿斑驳、畸形、坏死、变色等 4种类型。     

甘薯羽状斑驳病毒O株系和RC株系中国分离物全基因组 序列分析及其遗传特征

【目的】对甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）O株系中国分离物（SPFMV-O-Ch1）和RC株系中国分离物（SPFMV-RC-Ch1）的基因组全序列进行克隆,明确SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1的基因组结构特征及其遗传变异情况,为研究甘薯羽状斑驳病毒的致病机制打下基础。【方法】根据GenBank中登录的SPFMV基因组全序列设计2对简并引物和3对特异性引物,利用RT-PCR方法,从感染SPFMV的甘薯叶片中扩增SPFMV O株系和RC株系中国分离物的基因组全长序列,将目的片段分别克隆到pMD19-T载体上,经序列测定、分析和拼接,获得SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1的全序列,利用DNAMAN和MEGA7对SPFMV基因组全序列及不同编码区序列进行遗传变异和系统进化树分析,利用RDP软件分析SPFMV基因组重组情况。【结果】经序列测定和拼接,结果表明SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1基因组分别包含10 922和10 851 nt,均包含一个开放阅读框,分别由10 557和10 482 nt组成,编码一个多聚蛋白,分别由3 518和3 493个氨基酸残基组成。两个分离物均在P1蛋白内编码一个P1N-PISPO蛋白,在P3蛋白内编码一个P3N-PIPO蛋白。基因组全序列核苷酸一致性分析表明,SPFMV-O-Ch1与SPFMV-RC-Ch1的一致性为87.3%,与GenBank登录的其他分离物基因组全序列一致性为86.0%—95.8%,与Ruk73分离物的一致性最高,为95.8%,与11-1分离物的一致性最低,为86.0%。SPFMV-RC-Ch1与GenBank登录的其他分离物基因组全序列一致性为85.9%—98.7%,与IS90分离物的一致性最高,为98.7%,与Aus1-2B分离物的一致性最低,为85.9%。基于多聚蛋白基因核苷酸序列的遗传进化树分析表明,SPFMV-O-Ch1与Ordinary、10-O和17-O等O株系的分离物形成一个分支,SPFMV-RC-Ch1与S、IS90和CW137等RC株系的分离物形成一个分支。重组分析结果表明,O-Ch1分离物中发现3个重组事件,分别发生在7 731—9 710、135—10 012和4 825—6 948 nt,RC-Ch1没有发现重组事件。【结论】我国的SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1分离物的基因组结构与其他分离物相同,O-Ch1与O株系分离物一致性较高,RC-Ch1与RC株系分离物一致性较高,O-Ch1分离物检测到3个重组事件,RC-Ch1未发现重组事件。     

南阳市甘薯病毒病调查与病原血清学鉴定

普查了南阳市 13县 (市、区 )甘薯病毒病的发生情况 ,以甘薯叶片作样本 ,采用NCM -ELISA方法检测病害样品 2 2 14个。结果表明 ,甘薯病毒病病田率达 10 0 % ,品种发病率 10 0 % ,未脱毒甘薯田病株率平均为 75 .9% ,脱毒甘薯田平均病株率 12 .1% ;初步认定南阳市甘薯病毒病病原至少有 6种 ,即SPFMV、SPLV、SPCFV、SPMMV、C - 6、C - 8。以SPFMV和SPLV为主。     

甘薯病毒病检测技术研究进展

简要概述了侵染甘薯的羽状斑驳病毒(SPFMV)、潜隐病毒(SPLV)、轻斑驳病毒(SPFMMV)、退绿矮缩病毒(SPCSV)、脉花叶病毒(SPVMV)等10余种病毒种类;着重综述了检测甘薯病毒常用的生物学、血清学、分子生物学等几种主要检测技术的原理和特点。生物学方法是依据病毒侵染后在甘薯或指示植物上的外观症状进行识别,但检测速度慢,易受季节限制;血清学技术是利用病毒外壳蛋白的抗原性,据特异性的抗体抗原免疫学反应检测病毒存在,但制备抗血清需时间长,对含量少和无蛋白外壳的病毒无法检测;分子生物学方法是以核酸为基础,通过检测病毒核酸来证实病毒的存在,该技术具有灵敏度高、特异性强、适应范围广等特点。     

甘薯病毒病研究进展

综述了国内外近年来侵染甘薯的主要病毒种类、症状、传播方式以及甘薯病毒病的诊断和检测方法;甘薯羽状斑驳病毒（ＳＰＥＭＶ）的血清学和分子生物学等方面的研究进展,简要介绍了我国甘薯脱毒研究的一些概况。