解磷细菌 K3 的 GFP 标记及其解磷能力检测

本文运用构建成功的含有假单胞菌属自身启动子及绿色荧光蛋白(GFP)的质粒pTRGFP电转至假单胞菌解磷细菌K3中,通过激光共聚焦显微镜及质粒检测,获得了发光稳定的标记菌株K3GFP。7天液体摇瓶试验中,标记菌株K3GFP的可溶性P含量在第4天达到最高774μg/ml,而出发菌株K3在第3天时已经达到了最大含量780μg/ml,说明pTRGFP质粒的转入对K3菌株解P能力有一定的影响。标记菌株K3GFP施入自然土壤10天后数量维持在5.47×106CFU/g～2.40×106CFU/g,35天后降到5.0×103CFU/g,说明解磷细菌K3GFP可以在自然土壤中定殖。本试验为研究解磷细菌在根际及土壤中的生长动态等行为特征奠定了基础。     

钩状木霉 ACCC31649的GFP标记及其对辣椒定殖和促生作用

【目的】旨在建立农杆菌介导的绿色荧光蛋白 (GFP) 基因转化钩状木霉 (Trichoderma hamatum) ACCC31649的技术方法,筛选遗传稳定的GFP标记转化子,并研究该菌株在辣椒植株中定殖和对辣椒的促生作用,为进一步阐明木霉在辣椒根际定殖及其与辣椒病原菌在辣椒根际和植株中的定殖、互作和生防作用奠定基础。【方法】通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法筛选遗传稳定的GFP标记转化子,通过灌根接种方法和组织切片的水玻片荧光观察研究了钩状木霉在辣椒植株中定殖过程和对辣椒的促生作用。【结果】获得了遗传稳定GFP标记的钩状木霉转化子。荧光显微观察表明,辣椒根、茎、叶组织中都检测到GFP标记菌株的定殖。标记菌株首先在根部定殖,然后通过根部维管束逐步定殖到茎和叶片组织中。野生型菌株和GFP标记菌株灌根接种4叶期辣椒幼苗,30天后,GFP标记菌株与水处理对照相比,辣椒的株高增长13.5%,根长增长16.2%,鲜重和干重分别增加了43.8%和45.3%,而且野生型菌株与GFP标记菌株对辣椒的促生作用没有显著差异。【结论】钩状木霉能够在辣椒植株根、茎和叶组织中定殖,并且对辣椒具有显著的促生作用。同时,GFP标记的钩状木霉将在进一步阐明该菌株在辣椒根际定殖及其对病原菌拮抗和互作研究中发挥重要作用。     

GFP标记的植物促生菌B96-Ⅱ-gfp的定殖能力研究

采用绿色荧光蛋白基因标记技术研究了植物促生菌B96-Ⅱ的标记菌B96-Ⅱ-gfp在盆栽黄瓜土壤中的时间、空间定殖动态以及在黄瓜植株上的分布。研究表明: B96-Ⅱ-gfp在土壤中具有持久的定殖能力, 接种180 d时在自然土和黄瓜枯萎菌病土中的定殖数量分别为2.7×10⁴ cfu·g^-1和6.6×10⁴ cfu·g^-1, 360 d时在土壤中仍可检测到B96-Ⅱ-gfp的存在。B96-Ⅱ-gfp可在盆栽植株生长土壤的表层(0~4 cm)、中层(4~8 cm)和底层(8~12 cm)定殖, 定殖数量随土壤深度的增加而增加。此外, B96-Ⅱ-gfp还可在黄瓜的根、茎和叶上定殖, 根部定殖的数量(7.2×10⁴ cfu·g^-1)显著高于茎部和叶部定殖的数量; 黄瓜植株体内定殖的数量多于体表定殖的数量。对土壤中可培养的3大微生物类群影响的研究表明: B96-Ⅱ-gfp对土壤中真菌数量具有显著抑制作用, 而对细菌和放线菌数量则没有明显影响。防病促生试验表明: B96-Ⅱ-gfp可增加黄瓜株高、鲜重和干重, 对黄瓜枯萎病有一定的防治效果, 且与未标记菌株B96-Ⅱ的防病促生作用无显著差异。     

短小芽孢杆菌BX-4抗生素标记及定殖效果研究

为研究短小芽孢杆菌BX-4在作物根际的定殖及防病效果,通过浓度梯度法用氨苄青霉素对其进行了抗性标记,并通过番茄盆栽试验研究了其在根际土壤中的定殖规律。结果表明,筛选出的突变体菌株BX-4＇能够耐受浓度为200 μg·mL^-1的氨苄青霉素,并且具有耐药和遗传双重稳定性;应用试验显示该突变体菌株能成功在番茄根际定殖,接种20 d后根际土壤中存活数量达到最高值1.34×10^8 cfu·g^-1干土,以后逐渐下降,到50 d时趋于稳定;筛选的突变体菌株对番茄青枯病具有明显的防治效果,防效达37.9%-50.9%。短小芽孢杆菌BX-4在作物根部的定殖规律为揭示其生防机理及应用该菌提供了科学根据。     

巨大芽孢杆菌在油菜根部定殖和促生作用的研究

采用基因标记技术和常规方法跟踪巨大芽孢杆菌A6 (gusA)在缩影系统油菜根际的定殖情况。A6 (gusA)菌在油菜不同根段部位的定殖密度表现从上到下逐渐递减的现象。随着接种后时间的延长而逐渐下降。在根段 8cm以外的根区几乎检测不到接种菌。在油菜播种后 3d ,定殖密度可达最高水平 (8 7×10 5cfug-1根 ) ,然后急速下降 ,30d后保持相对稳定的较低水平 (2 2× 10 2 cfug-1根 )。在促生试验中 ,表现在不同程度上增加植株干重、全氮、全磷和全钾的含量     

内生菌YN201728的定殖能力及其防治烟草白粉病的效果研究

为研究生防菌YN201728在烟草体内的定殖规律及防病机制,本研究利用其绿色荧光标记菌株YN28-P43GFPmut3a实时动态观测标记菌的定殖部位及密度,并探究其对温室烟草白粉病的盆栽防效与定殖的关系。结果表明,YN28-P43GFPmut3a发酵液处理烟草种子和幼苗后,种子内的标记菌含量可达2.18×10⁶ CFU·g^-1,在幼苗的根表土、根际土、根、茎、叶等组织中均能检测到标记菌,且其定殖密度表现为根表土>根际土>根>茎>叶。激光共聚焦显微镜观察显示,标记菌主要聚集在烟草根表皮、木质部导管、茎表皮、韧皮部及维管束组织、叶片表面和叶肉细胞间隙以及种皮与胚等部位。盆栽防效试验结果表明,YN201728野生型和标记菌株对烟草白粉病均有较好的保护和治疗效果,持效期长达21 d。此外,烟草叶片中内生菌的定殖量与其防效呈正相关。本研究结果表明,内生菌YN201728在烟草体内有良好的定殖和防治白粉病效果,具很好的开发潜力,为烟草病害的生物防治提供了一定的理论基础。     

荧光假单胞杆菌RB-42 RB-89的趋化性与烟草根部定殖研究

烟草PGPR(PlantGrowth PromotingRhizobacteria)菌株RB 89、RB 42对烟草根部收集液有较强的趋化性。在稀释浓度为10-5时,RB 89、RB 42的趋化值依次为1 79、1 83。RB 42和RB 89对氨基酸趋化性差异显著,对酪氨酸、脯氨酸、甘氨酸、笨丙氨酸表现出较强的趋化性,对组氨酸、苏氨酸没有表现出趋化性;RB 42和RB 89菌株对有机酸的趋化性没有明显区别,只是RB 42对乳酸的趋化性表现得比对其它有机酸的强些;菌株对糖类物质的趋化性最弱。菌株RB 89、RB 42在烟株根表的定殖受灭菌、趋化剂影响较大,土壤灭菌、趋化剂处理可增加菌株在根表的定殖量。     

荧光假单胞杆菌RB-42 RB-89的趋化性与烟草根部定殖研究

烟草PGPR(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria)菌株RB-89、RB-42对烟草根部收集液有较强的趋化性。在稀释浓度为10^-5时，RB-89、RB-42的趋化值依次为1．79、1．83。RB-42和RB-89对氨基酸趋化性差异显著，对酪氨酸、脯氨酸、甘氨酸、笨丙氨酸表现出较强的趋化性，对组氨酸、苏氨酸没有表现出趋化性；RB-42和RB-89菌株对有机酸的趋化性没有明显区别，只是RB-42对乳酸的趋化性表现得比对其它有机酸的强些；菌株对糖类物质的趋化性最弱。菌株RB-89、RB一42在烟株根表的定殖受灭菌、趋化剂影响较大，土壤灭菌、趋化剂处理可增加菌株在根表的定殖量。     

用绿色荧光蛋白基因（gfp）标记产酸克雷伯氏菌SG—11研究其在水稻苗期根部的定殖

本研究以自水稻根面分离的产酸克雷伯氏菌SG－11为出发菌株，分别用携带gfp和nifH-gfp的质粒转化SG－11进行基因标记，得到了转化子SG－11A和SG－11B。对两转化子的生长曲线和质粒稳定性进行了测定，在LB培养基中，SG－11的倍增时间为0.815h，对数期是3.20－5.28h，样品各点与其曲线的相关系数R^2=0.9975;SG-11A的倍增时间为1.02h，对数期是3.27－5.37h，R^2=0.9987，在无选择压力的条件下，连续传80代时质粒的保存率为0％。在K中这培养基中，SG－11的倍增时间为1.159h，对数期是2.50-4.92h，相关系数R^2=0.9922;SG-11B的倍增时间为1.163h，对数期是2.50－4.92h，相关系数R^2＝0.9698，连续转100代时质粒的保存率为65.6%。激光共聚焦显微镜观察结果表明：在试管限菌培养条件下，SG－11A主要定殖在水稻根部的伸长区和根毛区，并且在次生根形成处有菌团存在，在水稻根通气组织的细胞间隙和维管束导管内发现了SG－11A，在根的伸长区只是偶尔观察到了表达nifH-gfp的SG－11B。砂培条件下，在水稻根伸长区观察到了少量SG－11A的定殖，未检测到SG－11B。稻田土盆栽实验中，在水稻的根部既未检测到SG－11A也未检测到SG－11B。     

两株香蕉枯萎病拮抗菌在香蕉体内的定殖

本研究将2株香蕉枯萎病拮抗细菌0202和1112分别涂布于含有不同浓度的利福平培养基上,筛选出抗药性标记菌株0202-r和1112-r。将香蕉枯萎病菌Foc4接种于香蕉植株根部,3d后再将抗药性标记菌株接种在同一部位或位点,于不同时间测定拮抗细菌在根际、根内、球茎和假茎的定殖情况。研究结果显示,将拮抗细菌接种香蕉根部1～3d后,在植株根际土壤内存在大量拮抗细菌,而根内、球茎和假茎内存在少量拮抗细菌;接种7～14d后,在植株根内、球茎和假茎内定殖的拮抗细菌增多,并达到最大量;在接种14～21d后,在植株根内、球茎和假茎内定殖的拮抗细菌量急剧下降;在接种28~35d后,在植株根内、球茎和假茎内定殖的拮抗细菌量稍有回升。     

大白菜-结球甘蓝易位系AT4系列抽薹相关基因表达差异的cDNA-AFLP分析

抽薹开花时间是大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)的重要性状,未熟抽薹直接影响大白菜的产量和品质.本研究以添加结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)4号染色体片段的大白菜-结球甘蓝易位系AT4系列为材料,结合抽薹性鉴定,获得了45株耐抽薹和15株易抽薹植株;利用cDNA-扩增片段长度多态性(cDNA-amplified fragment length polymorphism,cDNA-AFLP)技术,对不同春化处理的耐抽薹和易抽薹植株叶片差异表达片段进行分离,获得了126条与抽薹性相关的差异表达条带,这些差异包括条带的有无和表达量的差异;通过差异条带回收、克隆和测序,获得了74条差异表达序列.同源性比对结果表明,61条差异表达序列具有同源序列,其中41条差异表达序列功能预测涉及代谢、能量、细胞物质运输、信号转导、表达调控、DNA修饰、细胞周期等,20条差异表达序列功能未知;13条在NCBI中找不到同源序列,可能是一些新基因.本研究获得了耐抽薹大白菜-结球甘蓝易位系,为耐抽薹大白菜新品种的培育提供新材料;同时获得了耐抽薹和易抽薹材料间的差异表达序列,为获得影响大白菜抽薹性的关键基因,揭示大白菜抽薹开花机制提供支撑.     

大白菜BrTCP24基因的克隆与功能分析

近年来,由于家庭结构的变化,市场对小株型大白菜的需求日益迫切.开展负调控叶球大小发育相关基因的克隆与功能研究有助于加快小株型大白菜品种的选育进程.本研究利用RT-PCR方法从大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)自交系福山包头叶片中分离了一个TCP第二亚族成员基因,命名为BrTCP24.BrTCP24基因编码区内无内含子,开放阅读框(ORF)全长1 221 bp,预测编码406个氨基酸.利用MEGA4.0软件将BrTCP24与拟南芥(Arabidopsis thaliana)TCP家族基因进行进化分析发现,BrT-CP24与AtTCP3同属于一个分支,在进化上具有较近的亲缘关系.用DNAMAN软件对BrTCP24和AtTCP3蛋白进行多序列联配分析发现,二者的氨基酸一致性可达到55.17％,在保守的TCP结构域其一致性可高达91.53％.这种进化上的亲缘关系和序列上的保守性,暗示二者可能具有类似的生物学功能.通过半定量RT-PCR分析发现,BrTCP24基因在大白菜的根、茎、莲座叶、包叶、盛开的花、受精后10 d的果夹和花蕾中均有表达,其中莲座叶中表达量最高,根、包叶、盛开的花、受精后10d的果夹和花蕾中的表达量次之,短缩茎中表达量最低;另外,在5 μmol NAA处理的12h内BrTCP24的表达水平未发生明显变化.为进一步研究BrTCP24基因的功能,我们构建了转化拟南芥的正义表达载体(35S::BrTCP24),并转入拟南芥中.通过卡那霉素筛选以及基因组DNA PCR鉴定,共得到17株转基因拟南芥植株.通过对其中5株的RT-PCR分析发现,它们都能够转录表达BrTCP24基因.利用荧光实时定量PCR方法对部分转基因植株的插入拷贝数进行检测发现,BrTCP24基因以单拷贝形式插入拟南芥基因组.进一步研究发现,与野生型拟南芥相比,过量表达BrTCP24基因可导致转基因拟南芥的下胚轴和叶器官明显减小.此外,过量表达BrTCP24基因抑制了与器官大小相关基因ANT、AtEXP10、AtGRF5、AtGIF1和CycD3;1的表达.这些结果表明,大白菜BrTCP24基因可能通过抑制细胞的生长参与调节植物器官大小的发育.     

与大白菜TuMV抗病基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记开发

分子标记辅助选择可大大加快育种进程,然而由于大白菜抗病毒病遗传规律的复杂性,目前所定位的基因和筛选的连锁标记远不能满足育种需要,为了更好地对抗病毒病白菜(Brassica campestris ssp.pekinensis)进行分子标记辅助选择,本研究筛选了与大白菜抗芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)抗性基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记.本研究在对该基因进行定位的基础上,利用回交1代(backcross1,BC1)分离群体,采用分离群体分组分析法(bulked segregation analysis,BSA)、简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)和序列特异引物(sequence specific primer,SSP)标记技术,筛选与该基因紧密连锁的分子标记.通过对13对SSP引物和16对SSR引物的分析表明,有8对引物在两亲本间表现多态性,有5对引物扩增出的标记与基因TuRBCS01紧密连锁或共分离,分别为mBr4072、Bra025493-1、Bra025493-2、Bra025467-4和Bra025467-5.筛选出与大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记2个,分别为SAAS_mBr4072_240 (1.5 cM)和Bra025493-1(1.0 cM),另有3个标记与基因TuRBCS01共分离,分别为SAAS—Bra025493-2_749、SAAS_ Bra025467-4—780和SAAS—Bra025467-5_ 956.上述标记丰富了大白菜抗TuMV分子标记的数量和种类,有望用于大白菜抗病毒病分子标记辅助选择.     

大白菜InDels标记开发及其在剩余杂合体鉴定中的应用

大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)参考基因组序列的公布及测序成本的降低为大规模开发插入/缺失(Insertion/Deletion,InDel)标记提供了可能.本研究以性状差异明显的大白菜自交系He102与06-247为亲本,开展了全基因组重测序、标记开发和验证工作.二者测序深度分别为10×和8×,经筛选共获得330 218个InDels差异位点,出现频率为1.2个/kb,其中有11 238个差异位点位于编码区,包括5 184个差异基因,每个基因平均包含2.2个差异位点.分别以He102与06-247测序数据中筛选出的多态性InDels位点为参照,从10条染色体上随机选择933个位点进行了PCR扩增及电泳检测验证.结果表明,测序深度对假阳性率有直接影响,以测序较深的材料中筛选到的差异位点为参照,其验证结果的假阳性率亦较高,反之则较低.本研究中以He102与06-247为参照选择InDels位点验证的平均假阳性率分别是51.9％和22.5％.从933个位点中共筛选出593个在亲本之间实际表现为多态性的位点,这些差异位点中有375个位于编码区,是潜在的功能性标记.利用上述差异位点,检测了He102与06-247衍生的F7代重组自交系群体,明确了F7代各株系在593个位点的纯/杂合状态,为利用剩余杂合株系精细解析和精准定位大白菜耐抽薹、抗病毒、抗干烧心等重要农艺性状奠定了基础.     

大白菜硫代葡萄糖甙合成基因SSR标记的开发

硫代葡萄糖甙(glucosinolates,GS)是一种含氮、硫的重要植物次生代谢产物,是十字花科蔬菜风味的主要来源。本研究根据拟南芥(Arabidopsis thaliana)和大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)基因组序列信息,比对GS生物合成相关基因的序列信息,发现大白菜中与GS含量相关的候选基因102个,分布于10条染色体上。拟南芥GS合成基因在大白菜中的同源基因个数分别为:零拷贝基因8个、单拷贝基因13个、2拷贝基因17个、2个以上多拷贝基因14个。通过FASTPCR6.0软件分析目标基因上下游序列各5kb,共开发出237个简单重复序列(SSR)位点,16个基因没有发现SSR位点,72个基因存在1~4个SSR位点,5个基因存在5个SSR位点,4个基因存在6个SSR位点,4个基因存在7个SSR位点,1个基因存在8个SSR位点。所开发的SSR位点中,共发现4种重复类型:单核苷酸重复最多,共122个,占SSR总数的51.4%;其次是二核苷酸重复类型,共48个,占SSR总数的20.3%;三核苷酸重复类型最少,共7个,占SSR总数的3.0%,另外60个SSR无明显的重复类型。具有SSR位点的86个基因中,77个基因可以设计SSR特异引物,其中49对特异引物在供试的75份大白菜高代自交系中得到有效扩增。其中16对引物具有多态性,占全部引物的20.8%;18对引物无多态性,占全部引物的23.4%;15对引物杂带多,占全部引物的19.5%;另外28对引物无扩增产物,占全部引物的36.4%。最终11对获得了清晰多态性扩增产物,共检测出26个等位基因。本研究为分子标记辅助选择培育高有益GS成分的大白菜新品种提供了基础资料,进而加快大白菜营养品质育种的进程。     

大白菜-结球甘蓝AT4系列易位系抽薹相关基因的表达分析

未熟抽薹会对大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)生产造成重大损失.为研究大白菜抽薹开花相关基因,本研究对添加结球甘蓝(B.oleracea var.capitata)4号染色体片段的大白菜耐抽薹和易抽薹易位系间存在差异的cDNA-扩增片段长度多态性(cDNA-amplified fragment length polymorphism,cDNA-AFLP)条带进行回收测序,其差异条带的同源性比对和功能性分析结果表明,差异基因可分为3种:转录翻译类、信号传导类和膜运输类.其功能预测涉及细胞物质运输、信号转导、物质能量代谢、胁迫应答、基因表达调控、细胞周期等.对其中8条序列进行qRT-PCR检测结果表明,在春化处理过程中P65M58-11、P65M58-12和P75M47-9在极晚抽薹材料中表达量峰值极显著高于极早抽薹材料,P65M58-11和P65M58-12条带的表达量峰值出现在春化处理14d时.而P75M47-9在极晚抽薹材料中表达量峰值出现在春化处理7d,在极早抽薹材料中从春化处理开始就呈现出下调趋势;P77M58-9、P77M58-12、P63M49-8-1和P63M61-4-2在极晚抽薹材料中表达量峰值极显著低于极早抽薹材料,P63M49-8-1在极早抽薹材料中表达量的峰值出现在春化处理7d,而在极晚抽薹材料中从春化处理7d后表达量逐渐上调.P77M58-9、P77M58-12和P63M61-4-2表达量峰值出现在春化处理14d时;另外P63M49-1-2条带在极晚抽薹和极早抽薹两种材料中表达量差异无明显规律,在极早抽薹材料中表达量峰值出现在春化处理7d时,而在极晚抽薹材料中峰值出现在春化处理21d时.本研究获得了在6个易位系、2个自交系、2个商品种的耐抽薹和易抽薹材料间表达量及表达模式存在差异的8个基因,为深入挖掘大白菜抽薹开花相关基因、开展基因功能验证以及获得耐抽薹大白菜材料提供基础资料.     

用EST—SSR分子标记技术构建大白菜核心种质及其指纹图谱库

摘要利用EST-SSR分子标记对大白菜种质资源基因库中686份样品所代表的1900份大白菜种质资源进行分析研究。构建大白菜种质资源的核心种质并且形成核心种质的EST—SSR指纹图谱库。结果表明利用4组鉴定白菜品种的EST—SSR的特异性标记组合,获得近158个EST—SSR多态的标记,对大白菜种质资源基因库中686份样品所代表的1900份大白菜种质资源进行核心种质的构建提供了分析数据。形成的核心种质包括168份样品,占库存资源的8．8％,它的多态位点百分率保持了原群体的100％。所构建的核心种质涵盖了原资源的绝大部分区域来源的品种,包含了早、中、晚熟品种中所有典型的大白菜类型和其相关的特征特性。并进一步进行了核心种质资源遗传多样性分析。核心种质的EST—SSR指纹图谱库中,每一份样品的指纹都是唯一的,为登记、评价、整理、分发、繁殖等种质资源库的管理和育种者对其材料的利用提供了重要的有价值的信息。EST-SSR标记组合是构建中国大白菜核心种质及其指纹图谱的经济、高效的方法。     

大白菜抽薹相关基因BrFLC1的KASP标记开发

为了提高大白菜耐抽薹品种的分子育种效率,本研究针对大白菜抽薹相关基因BrFLC1第6个内含子的第一个碱基(Pi6+1)G-A的SNP变异开发进行高通量检测的竞争性等位基因特异性PCR(KASP)标记。结果表明,开发的KASP标记BrFLC1-KASP1可有效将晚抽薹类型材料Y177-12(G)和早抽薹类型材料Y195-93(A)分为2组。利用BrFLC1-KASP1标记可以对57份大白菜材料的基因型进行有效鉴别,且鉴定结果与酶切扩增多态性标记(CAPS)G-MvaI以及直接测序法的鉴定结果完全一致。综上所述,BrFLC1-KASP1标记在大白菜材料中具有通用性,且具有准确率高、成本低、效率高的特点。本研究结果对大白菜耐抽薹性的分子标记辅助选择具有重要的育种实践价值。     

不同基因型小白菜硝酸盐积累差异及筛选研究

采用溶液培养方法研究了43种基因型小白菜在不同硝铵比条件下体内硝酸盐含量的变化情况。结果表明,不同基因型小白菜的硝酸盐含量差异较大,东妃青梗菜、上海白叶四月蔓和夏优高抗为低硝酸盐含量基因型小白菜,而高雄甜脆小白菜、宝大矮棋青和苏州青为高硝酸盐含量基因型小白菜。硝铵比50/50是最适宜筛选的氮素形态比例,而叶片中的硝酸盐含量也是最适宜的筛选指标。对上述6个基因型小白菜进一步分析结果表明,不同部位硝酸还原酶、根系硝态氮最大吸收速率以及亲和力这三个因素对小白菜各部位的硝酸盐积累都有显著的影响,但在不同部位,这三个因素所起的贡献率不同。