H9亚型禽流感病毒环介导等温扩增检测方法的建立与荧光指示剂的应用

利用反转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP),建立了一种特异、灵敏、便捷的H9亚型禽流感病毒(H9subtype of avian influenza virus,H9-AIV)的检测方法。该方法使用了对应于H9亚型禽流感病毒血凝素(hemagglutinin HA)基因的8个不同区域的6条特异引物,在63℃的等温条件下反应,最低可检测到103拷贝的目的基因重组质粒片段,较RT-PCR方法敏感10倍。通过对15种H亚型禽流感病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的检测表明,该方法具有良好的特异性。在反应体系中使用钙黄绿素与Mn2+的混合溶液作为荧光指示剂可以用于RT-LAMP结果判定,并且其判断结果与浊度判断结果一致。对109份禽咽喉拭子及泄殖腔拭子临床样品进行检测,RT-LAMP与RT-PCR检出阳性样本数分别为61份和46份,表明RT-LAMP方法阳性检出率高于RT-PCR。     

荧光显色在环介导等温扩增（LAMP）检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的应用

介绍了一种应用荧光显色的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)的检测方法.该方法使用了针对靶序列M+N基因的一组引物,并且能在63 ℃等温条件下30 min内完成反应.在敏感性检测中RT-LAMP与RT-PCR都能检测103个包含靶基因片段的重组质粒.几种其它病原的核酸也被用来比较这两种方法的特异性,两种方法只能检测PRRSV.在荧光显色剂应用试验中,证实0.05 mmol/L钙黄绿素以及0.6 mmol/L锰离子可以用于LAMP扩增产物的判断,并且其判断结果与浊度判断结果一致.在对103个临床血液样本的检测中,RT-LAMP与RT-PCR检出的阳性样本数量分别是56个和48个.结果说明,应用荧光显色剂的RT-LAMP检测方法可以快速检测PRRSV.     

对虾白斑综合征病毒可视化环介导等温扩增(LAMP)检测技术的建立与应用

针对当前对虾(Penacus orientalis)养殖业亟需研究开发一种简便快速、敏感特异的检测技术来实现对对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)进行检测监控的现状,本研究根据WSSV基因组ORF120保守区序列,设计合成6条环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)特异性引物,分别为外引物F3/B3、内引物FIP/BIP和环引物LF/LB。利用钙黄绿素/氯化锰作为检测指示剂,通过对反应条件优化,建立了可视化WSSV-LAMP检测方法。在检测中未发生扩增反应时,钙黄绿素被氯化锰螯合,呈淬灭状态。当样品中有WSSV靶基因存在时,大量DNA被合成,并产生同样大量的焦磷酸根离子,此时焦磷酸根离子竞争性与Mn2+结合,形成稳定的不溶性焦磷酸盐沉淀,钙黄绿素被释放而发出肉眼可见的黄绿色荧光。该扩增一次性反应约60min即可完成对待检样品的检测。经测定,本方法能特异性地检测出阳性样品中的WSSV目的基因,并能通过扩增产物所产生的黄绿色变化与阴性样品区别;本技术对目的基因的最低检测量为1fg。在临床检测试验中,WSSV-LAMP与世界动物卫生组织(OIE)推荐的WSSV-PCR检测方法均能从250份对虾样品中,同时检测到15份编号相同的阳性样品,符合率达100%。除此之外,WSSV-LAMP还能从另外3份PCR检测为阴性的样品中检测到目的基因。比较这两种方法的阳性检出率,WSSV-LAMP为7.2%(18/250),WSSV-PCR为6.0%(15/250),WSSV-LAMP对自然感染的临床样品阳性检出率要比WSSV-PCR高。说明WSSV-LAMP在病毒含量较低的临床样品检测中比OIE推荐的PCR方法具有更高的技术优势,能在对虾养殖生产上的临床诊断、育种及口岸检疫,甚至海洋生态监测中对WSSV进行现场检疫。     

羟基萘酚蓝在伪狂犬病病毒环介导等温扩增检测方法中的应用

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)传统诊断方法具有程序繁琐、周期长、成本高、特异性差等缺点,本实验建立了敏感、特异的PRV的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并在此基础上应用金属离子指示剂羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue,HNB)进行反应结果判定.实验选取保守性较高的gB基因(glycoprotein B,糖蛋白gB)筛选引物,确定反应体系后,可在45 min内完成检测.LAMP方法特异性与PCR方法一致,敏感性是PCR方法的100倍,最低能够检测10个拷贝的目的基因.在HNB的应用试验中,发现LAMP反应体系中,HNB浓度为150 μmol/L时,阴阳性的颜色对比明显且反应的敏感性最高,可用于LAMP扩增产物的判断.临床样本的检测结果表明,PCR方法和LAMP方法的检出率一致.因此,本研究中所建立的LAMP方法是一种高度特异敏感的,可替代PCR方法的检测技术.     

牛支原体的环介导等温扩增快速检测技术研究

牛支原体(Mycoplasma bovis是感染牛的一种重要的致病性病原体.本研究利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立了牛支原体的快速检测方法.该方法以牛支原体保守性基因uvrC为靶序列设计了5条特异引物,在58℃等温条件下,60 min即可完成反应.LAMP方法能检测出20 pg牛支原体DNA,较PCR方法高100倍,用牛鼻支原体(M.bovirhinis)、无乳支原体(M.agalactiae)、精氨酸支原体(M.ariginini)、牛副流感病毒(BPIV)、牛腺病毒(BADV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)作特异性检测,两种方法均有很高的特异性.本研究还将荧光显色剂钙黄绿素(calcein)和Mn2+用于LAMP反应结果的可视化检测.临床鼻拭子样品煮沸后,可直接进行等温扩增,省去了DNA提取步骤.在对167个临床鼻拭子样本的检测中,LAMP方法检测结果阳性率(26.95％)高于PCR方法检测出阳性率(19.16％),这证明本研究所建立的方法,与PCR法比较更适于临床样品的检测.研究结果表明,LAMP方法具有操作简便、快速、高效、敏感、特异、经济等特点,适于基层实验室监测的广泛使用.     

环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测海豚链球菌方法的建立

海豚链球菌(Streptococcus iniae)是一种革兰氏阳性球菌,呈β溶血,可感染多种淡水和海洋鱼类。本研究利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)进行核酸扩增,通过横向流动试纸条方法 (lateral flow dipstick,LFD)实现检测,建立了一种可应用于海豚链球菌快速检测的LAMP-LFD技术。该技术以海豚链球菌促旋酶B亚单位(gyrase subunit B,gyr B)基因为检测靶标,设计3对引物进行由生物素标记的LAMP扩增反应,产物经异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针杂交后,在LFD上完成检测。经优化的核酸扩增最适条件为65℃反应30 min,在此条件下,阳性扩增起始时间与模板浓度之间呈典型的线性相关性。从核酸扩增反应开始到LFD显色,整个检测时程只需40 min左右,比常规PCR技术缩短约2 h。LAMP-LFD能特异性地检出海豚链球菌,针对病原纯培养物的检测灵敏度为8.70×101cfu/m L,是LAMP检测的10倍、常规PCR检测的100倍。以灵敏度浓度(8.70×101cfu/m L)的海豚链球菌基因组DNA为模板进行的LAMP-LFD结果显示该方法具有良好的重复性。针对人工污染花鲈(Lateolabrax japonicus)肝组织的检测灵敏度为4.35×103cfu/m L,同样为常规PCR检测方法的100倍。利用本方法可成功从患病花鲈的组织样品中检测出海豚链球菌,检测结果与常规的细菌分离鉴定方法结果一致。因此,利用LAMP-LFD能特异、准确、高效地检测出海豚链球菌,而且操作简单、费用低、耗时短,有望成为海豚链球菌的常规检测方法。     

环介导等温扩增技术及其在水生动物病毒检测中的应用

水产养殖已成为国民经济重要组成部分,但经常受到水生动物病毒的困扰。相关病毒病原的检测已成为水生动物病原研究的热点之一。环介导等温扩增技术具有高特异性和灵敏度,并且扩增时间短,对仪器的要求较低,已广泛应用于水生动物病毒的检测中。本文从环介导等温扩增技术中引物的设计,扩增反应过程及反应产物的检测三个方面来阐述其基本原理,并综述了其在水生动物虹彩病毒、弹状病毒、呼肠孤病毒、疱疹病毒及对虾病毒检测中的应用,最后对其技术和应用上的发展前景进行了展望,以期为水生动物病毒检测相关研究提供参考。     

环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测转基因玉米LY038

为了施行对转基因作物的监管,许多国家和机构制定了转基因标识制度的相关条例,因此建立针对转基因产品的检测方法是十分必要的.本研究运用环介导等温扩增技术(LAMP)建立了对转基因玉米(Zea mays L.) LY038外源基因的快速检测技术,该方法依据cordapA基因的序列设计了4条特异性引物,结果表明,引物特异性良好,该检测体系在63℃恒定温度下,反应50 min,可检测到0.01％的样本,是常规PCR方法的5倍.该检测方法具有高度的特异性、灵敏性和稳定性,该方法不需要特殊仪器、快速简便,在基层和现场检测中有很好的应用前景.     

马铃薯卷叶病毒RT-LAMP检测方法的建立

为建立一种快速准确检测马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus,PLRV)的方法,本研究以PLRV CP(coat protein,CP)基因ORF3保守序列为靶标,建立了PLRV反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测体系,并对建立的RT-LAMP检测体系的特异性、灵敏度、实际应用效果进行评估。结果表明,建立的PLRV RT-LAMP检测方法,在62℃恒温下扩增50 min,扩增产物中加入双链嵌合荧光染色(SYBR Green Ⅰ),阳性样品颜色变为绿色,阴性样品颜色仍为褐色,可直接目测判断待检测样品是否感染PLRV。该方法只特异性检测PLRV,不与马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯M病毒(PVM)等其他5种马铃薯主要病毒发生交叉反应。此外,建立的PLRV RT-LAMP检测方法的灵敏度较反转录PCR(RT-PCR)方法高100倍。田间样品检测验证,该方法与标准RT-PCR方法符合率达100%。本研究建立的以SYBR Green Ι为颜色指示的PLRV可视化检测RT-LAMP方法,特异、灵敏、便捷,成本低,可满足科研、基层单位对该病毒快速诊断和检测的需要。     

H5亚型禽流感病毒HA基因的克隆、表达及其生物学活性的初步分析

参考GenBank上发表的H5亚型禽流感病毒（Avianinfluenza virus,AIV）血凝素（HA）基因序列设计引物,经RT-PCR扩增HA基因的HA1片段,再将其克隆到原核表达载体PET-28a中,用大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）原核表达,SDS-PAGE和Western blot对表达蛋白进行鉴定.Western blot结果表明,表达蛋白能与H5亚型AIV单特异性血清特异性反应.交叉反应试验表明,此蛋白具有良好的抗原性,可被H5亚型AIV抗体特异性识别且无交叉反应.用变性纯化后的蛋白建立了对AIV抗体检测的间接ELISA,并对236份鸡血清样本进行了实验室检测.检测结果与血凝抑制试验检测结果符合率达到100%.综合研究表明,表达蛋白具有良好抗原性.     

猪胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增检测方法的建立与应用

本文建立了敏感、特异的胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增检测方法。以1型胸膜肺炎放线杆菌ApxIV基因片段为靶序列设计了一组引物,并建立了LAMP反应体系,在63℃等温条件下反应45min,最低能检测到102个拷贝的目的基因,敏感性是PCR方法的10倍。通过对1～10型胸膜肺炎放线杆菌、多杀巴氏杆菌、链球菌、支原体等18种病原微生物的检测,证明该法具有很强的种特异性。另外,通过对8头实验感染猪和127份临床发病猪的鼻拭子的检测发现,该法对鼻拭子中胸膜肺炎放线杆菌的检出率为100%,优于PCR方法。     

环介导恒温扩增技术快速检测对虾白斑综合征病毒方法的建立

DNA环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种特异、灵敏、快速的新型基因检测技术,其检测结果可以通过琼脂糖凝胶电泳观察,也可以通过加入核酸染料SYBR GreenⅠ进行肉眼观察。本研究根据对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)的结构蛋白VP26基因序列,设计一套引物,成功建立了针对WSSV的LAMP检测方法。应用该方法,在65℃温育1h的条件下快速扩增病毒基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳得到特异性梯度条带;在反应体系中添加SYBR GreenⅠ染料后,可通过肉眼观察有无荧光直接判定结果。该研究建立的LAMP法能特异性检出WSSV,其检测下限比PCR法低一个数量级,相当于0.563pg/μL的质粒(pMD19-T-VP26)浓度。表明所建立的WSSV LAMP检测法特异性好、灵敏度高、操作简单方便,有望作为WSSV快速诊断的常规方法。     

两株H3N8亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性

H3N8亚型流感病毒宿主范围广泛,除了可以感染野鸟和家禽外,还可以感染多种哺乳动物,并且H3N8亚型流感病毒跨物种传播的现象也时有发生,对养殖业和人类生命健康都具有重要威胁.为了解H3N8亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的生物学特性,本研究对2013年贵州省分离的两株H3N8亚型AIV(A/duck/Guizhou/S 1092/2013(H3N8)(简称DK/GZ/S1092/2013)和A/duck/Guizhou/S1145/2013(H3N8)(简称DK/GZ/S1145/2013))进行了遗传演化分析、小鼠(Mus musculus)感染性实验和受体结合特异性实验.遗传演化分析结果表明,这两株病毒具有明显的遗传多样性,除了血凝素(hemagglutinin,HA)基因位于同一个进化分支外,其他7个基因片段均具有不同起源.感染性实验结果表明,这两株病毒不需要提前适应就可以在小鼠的肺脏和鼻甲内有效复制,对小鼠呈现低致病性,小鼠感染病毒后未出现明显临床症状,目.DK/GZ/S1092/2013仅引起小鼠的体重下降1.8％,DK/GZ/S 1145/2013仅引起小鼠的体重下降0.8％.受体结合特异性分析结果表明,这两株病毒同时具有结合禽源唾液酸(sialic acid,SA) α2,3-Gal受体和人源SA α2,6-Gal受体的能力,具有感染人类的潜在风险.本研究通过对两株H3N8亚型AIV的生物学特性进行系统分析,发现H3N8亚型AIV具有感染哺乳动物的潜在风险.研究结果对于H3N8亚型AIV的综合防控具有重要的指导意义.     

H5N1型禽流感病毒血凝素HA1蛋白在苏云金芽胞杆菌细胞表面的展示及其免疫原性

利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统研究在细胞表面展示H5N1型禽流感病毒HA1蛋白的可行性及其免疫原性，为研制既安全有效又能常温长期保藏和运输的禽流感口服基因工程疫苗奠定基础。用部分ha1基因（ha1p）代替S-层蛋白ctc基因中部且位于表面锚定序列slh下游的片段，构建了融合基因ctc-ha1p和 csa-ctc-ha1p；利用电脉冲转化法将含融合基因的重组质粒转入苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171中，获得了重组菌株BCCH（含ctc-ha1p，并导入一个载有协助细胞表面展示的csaAB操纵子的质粒）和CH（含csa-ctc-ha1p）。通过血凝和血凝抑制试验以及小鼠免疫学实验证实，2个重组菌株均成功地在细胞表面展示了重组HA1蛋白并具有一定的特异性和免疫原性，其中，CH的效果强于BCCH，说明csa-ctc-ha1p这种融合基因的构建方式更胜一筹。研究结果表明，苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统可用来研制禽流感口服疫苗。     

H5N1亚型AIVHA抗原表位的高效表达及其抗原活性分析

血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白是禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）的一个重要表面抗原性蛋白,在疾病诊断和防治上有重要意义。本研究为了探讨一种更为简便有效的HA重组蛋白表达途径,利用生物信息学软件,对H5N1亚型AIVHA基因编码的氨基酸序列进行分析,在分析其在大肠杆菌中的密码子偏好性、稀有密码子分布情况及有关蛋白的抗原性等重要特性后,构建了HA抗原表位重组表达质粒pET-32a（＋）-HA。经测试,该重组质粒在1mmol/LIPTG诱导剂作用下诱导过夜,能在大肠杆菌Rosetta-gami B（DE3）中高效表达,并得到48.1kD大小的目的重组表达蛋白。重组蛋白用6×His-tagged protein纯化试剂盒纯化后,与福氏佐剂等量混合制备成抗原,以200μg/鸡的剂量皮下注射2月龄SPF鸡3次,采血分离血清。Western-Blot试验结果表明,该重组表达蛋白能分别与所制备的高免鸡血清及H5N1亚型AIV阳性血清发生特异性反应,在硝酸纤维素膜上出现特异性杂交带。说明本试验研究的HA抗原重组表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,保留了HA蛋白的抗原活性,提示该重组蛋白在H5亚型AIV的防治技术研究中具有重要的实际应用价值。     

一株对小鼠具有高致病性的H5N1亚型禽流感病毒的拯救

禽流感病毒(Avianinfluenzavirus)正在逐渐获得突破种间屏障感染哺乳动物的能力,揭示其获得此种能力的分子机制已经成为禽流感病毒的研究热点。A/Chicken/Guangdong/04(H5N1)是一株高致病性禽流感病毒,同时对BALB/c小鼠也具有高致病力。实验通过反向遗传操作技术对该病毒进行拯救,获得了拯救毒R-A/Chicken/Guangdong/04(R-CG)。R-CG与其亲本毒A/Chicken/Guangdong/04(W-CG)在胚半数感染量(EID50)、细胞培养半数感染量(TCID50)、对SPF鸡和BALB/c小鼠致病力等生物学特性保持一致。即R-CG与W-CG对鸡都为高致病力,静脉接种指数分别为2.88和2.91;R-CG与W-CG一样,以106EID50鼻腔感染BALB/c小鼠后,均能引起小鼠死亡,在小鼠脑、肺、肾和脾脏中都能分离到病毒,说明拯救的病毒与亲本毒一样,都可在小鼠体内有效复制,对小鼠具有高致病性。本实验成功地拯救了A/Chicken/Guangdong/04,拯救病毒R-CG可作为背景毒株,为研究禽流感病毒突破种间屏障感染哺乳动物的分子机制奠定了实验基础。