华东葡萄抗白粉病转录因子基因的克隆及亚细胞定位分析

以抗白粉病华东葡萄（Vitis pseudoreticulata W.T.Wang）株系白河-35-1为材料,在经葡萄白粉病病原菌（Uncinula necator（Schw.）Burr.）诱导后获得的EST序列的基础上,本研究通过RACE技术克隆了一个具有转录域的转录因子全长1324bpcDNA序列,其阅读框为1053bp,编码350个氨基酸,命名为VpRFL1（GenBank登录号：FJ356672）。应用PCR技术,进一步获得了转录因子VpRFL1基因的DNA序列,其序列全长1599bp,VpRFL1基因包含3个外显子,2个内含子。生物信息学分析表明,华东葡萄白河-35-1VpRFL1基因编码的氨基酸序列在N端含有核定位信号,C端含有C4C4型RING锌指结构域。VpRFL1/PBI221-GFP在洋葱（Alliumcepa）表皮细胞中的瞬时表达分析表明,该转录因子主要定位于细胞核内。VpRFL1的序列特征与定位分析结果初步表明该转录因子基因在核内起作用,并可能参与了抗逆反应的相关途径。     

水稻1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶基因OsITL1的克隆、亚细胞定位及表达分析

磷酸肌醇代谢在生物感受胞外刺激及信号转导中起着重要的作用.1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶（5/6-激酶）是磷酸肌醇代谢过程中很重要的一种酶,它具有肌醇激酶和蛋白激酶的双重功能.我们曾对拟南芥中的5/6-激酶基因AtITL1在逆境胁迫中的功能进行了研究,初步证明该基因与渗透胁迫有关（Chen et al.,2003）,本研究采用电子克隆的方法得到了水稻的5/6-激酶基因OsITL1,并对其亚细胞定位及在逆境胁迫下的表达特点进行了分析.     

高羊茅FeTOC1基因的克隆、差异表达及亚细胞定位分析

拟南芥TOC1基因是中央振荡器的重要组成部分,其编码的蛋白质TOC1通过光周期途径调控拟南芥对光照的响应.为了揭示高羊茅FeTOC1基因的生物学功能,本研究通过同源克隆获得该基因全长cDNA序列,对其在不同光照水平下的表达模式进行分析,并对其编码的蛋白质进行亚细胞定位.结果显示,高羊茅FeTOC1基因的全长cDNA序列...     

棉花GhMYB146基因克隆及亚细胞定位分析

MYB转录因子是发育、代谢、生物和非生物胁迫应答调控网络中的关键因子。为了分析棉花Gh MYB146转录因子的亚细胞定位,通过RT-PCR和RACE方法从棉花纤维中克隆了1个棉花MYB转录因子Gh MYB146的c DNA序列,采用生物信息学方法分析了Gh MYB146的氨基酸序列,构建了Gh MYB146基因的亚细胞定位载体并进行了亚细胞定位分析。结果表明,克隆的R2R3-MYB基因Gh MYB146的c DNA全长1 027 bp,开放阅读框长879 bp,编码292个氨基酸,蛋白质预测分子量约为33.151 k D,等电点为7.9;推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域;Gh MYB146基因组包含3个外显子和2个内含子。进化树分析表明,Gh MYB146和Gh MYB5分为一个分支;亚细胞定位结果表明,Gh MYB146:GFP融合蛋白定位于细胞核中。本试验结果为进一步研究Gh MYB146基因的生物学功能奠定了基础。     

脂滴包被蛋白基因(PLIN)多态性与鸡胴体及脂肪性状的相关性

脂滴包被蛋白基因(perilipin,PLIN)对脂质代谢和脂肪沉积具有重要调控作用。为揭示PLIN基因多态性对鸡(Gallus gallus)胴体及脂肪性状的遗传效应,本研究以384只鲁禽B3系为研究材料,采用DNA测序和PCR-RFLP技术对PLIN进行多态性检测,在供试群体中检测到3个SNPs位点g.2272CT、g.2319CT和g.2467GA。基于这3个SNPs位点,采用PHASE2.0软件构建了7个单倍型,其中C-C-G为最主要单倍型,频率高达71.94%;C-C-A和C-T-A单倍型频率最低,不足1%。基于7个单倍型构建了11个双倍型,H1H1频率最高,为52.60%;关联分析结果表明,双倍型对活体重、屠体重和腿肌重影响极显著(P0.01),对腹脂重和腹脂率影响显著(P0.05),对胸肌肌内脂肪含量有一定影响(P=0.094 9)。最小二乘分析结果表明,H1H3组合的活体重、屠体重、腿肌重、腹脂重和腹脂率最高,H4H6组次之,H6H6组合最低;H4H6组合胸肌肌内脂肪含量最高,H1H3组合最低。表明双倍型H6H6为劣势组合,在实际生产中应该去除,H4H6可以作为提高鲁禽鸡胴体性能和肉质风味的分子标记,在选育过程中应加强选择。本研究结果为PLIN基因应用于鸡分子育种提供了理论基础。     

枳两个GRAS基因cDNA全长的克隆及其亚细胞定位分析

利用生物信息学方法以拟南芥SCL6和杨树GRAS cDNA 序列作为模板,对柑橘EST数据库进行同源检索筛选出柑橘SCL6和GRAS基因的cDNA序列,并以枳[Poncirus trifoliata （L.） Raf.]花cDNA为模板,根据以上cDNA序列设计5＇末端和3＇末端扩增的特异引物,利用5＇ RACE和3＇ RACE技术,分别获得该基因的5＇和3＇末端,序列拼接后获得枳的SCL6和GRAS cDNA全长.分别命名Pt-SCL6和Pt-GRAS,大小分别是2 668 bp 和1 911 bp,在GenBank的登录号分别是GQ505957和GU072592,其分别编码706个和636个氨基酸全长.生物信息学分析表明Pt-SCL6和Pt-GRAS的cDNA序列中分别有microRNA171 （miR171） 和miR1446的识别位点,其与其它植物的GRAS一样有着高度保守的序列即GRAS结构域.构建Pt-SCL6和Pt-GRAS亚细胞定位载体35S-GW-GFP-GQ505957/GU072592,基因枪转化洋葱表皮细胞,暗培养24 h后激光共聚焦显微镜下观察.亚细胞定位结果表明Pt-SCL6和Pt-GRAS均定位于细胞膜中.转录因子Pt-SCL6和Pt-GRAS表现出在细胞膜区域定位的现象.     

橡胶树hbYKt基因植物表达载体构建及亚细胞定位

SNAREs（soluble-N-ethyl-maleimide-sensitive factor attachment protein receptor,可溶性N-乙基马来亚酰胺敏感因子附着蛋白受体）参与囊泡运输,在植物中具有非常广泛和重要的生物学功能。我们从橡胶树胶乳消减cDNA文库中筛选获得橡胶树的SNARE基因,命名为hbYKt。为进一步研究该基因功能,构建了以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）为报告基因的融合植物表达栽体pCAMBIAl304h-bYKt,通过农杆菌介导法分别转化洋葱表皮细胞和烟草表皮细胞。荧光显微镜检测结果表明hbYKt定位在洋葱表皮细胞和烟草表皮细胞的细胞质膜中。     

番茄EBF2基因的克隆、亚细胞定位与遗传转化

为研究番茄EBF2基因的功能,利用RT-PCR技术从番茄果实cDNA中扩增了全长EBF2基因,将其与绿色荧光蛋白(GFP)构建成融合表达载体,在烟草原生质体中进行瞬时表达。结果表明,该基因定位于细胞核内。将该基因定向克隆到植物表达载体pCambia1301,构建成由组成型启动子CaMV35S启动的植物表达载体pCambia1301-EBF2,通过农杆菌介导方法转化MicroTom番茄。经PCR及GUS组织染色检测,外源基因已整合到番茄基因组中。     

杆状病毒AcMNPV orf59基因的克隆表达、抗体制备及亚细胞定位

用PCR方法从苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）基因组中扩增到orf59基因,插入原核表达载体pET-32a(+),构建pET-Ac59质粒,再将该质粒转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达了分子量约为30kDa的融合蛋白。用纯化的表达产物免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,应用该抗体检测了AcMNPV感染的昆虫宿主细胞（Sf9）中orf59基因的表达,结果显示：在感染后的细胞中有两条分子量分别约为38kDa和25kDa蛋白质带能与所制备的抗体发生特异性反应。间接免疫荧光分析发现：在病毒感染的晚期,Ac59蛋白同时存在于所感染宿主的细胞核和细胞质中。这些研究为下一步深入进行Ac59功能的研究奠定了一定的基础。     

花生AhMKK4基因的克隆、表达分析和亚细胞定位研究

为挖掘花生抗逆相关基因,本研究以花生品种花育20号为试验材料,根据cDNA文库中已知的促丝裂原活化蛋白激酶激酶(MKK)基因EST序列设计引物,通过RACE-PCR克隆得到AhMKK4基因。结果表明,AhMKK4基因序列全长1 434 bp,含有3'非编码区151 bp,5'非编码区317 bp,开放阅读框全长966 bp,编码一条含有322个氨基酸的蛋白序列。预测其分子量为36.74 kDa,属于MAPKK基因家族D组成员。亚细胞定位显示AhMKK4基因定位于细胞质和细胞核中。RT-qPCR分析发现,AhMKK4基因在根中表达量高于其他组织,说明该基因具有组织表达特异性;AhMKK4基因受JA和IAA诱导时表达量上调,受SA和ABA诱导时表达量下调,说明该基因可能参与到JA和IAA介导的信号转导途径;AhMKK4在盐胁迫下表达量上调,说明该基因可能参与花生对盐胁迫的适应性调控。本研究结果为花生抗逆育种研究提供了新的基因资源。     

miR-122靶向调控鸡BZW2基因的表达

miR-122(MicroRNA-122)是在肝脏中高表达的miRNA,在肝脏的生长发育和脂类代谢等过程发挥重要作用,BZW2 (basic leucine zipper and W2 domains 2)主要参与蛋白质合成代谢,本研究目的是确定BZW2是否为miR-122调控的靶基因.通过生物信息学预测miR-122的靶基因,并分析BZW2的3-UTR区域与miR-122种子区的配对情况,再用双荧光素酶报告系统和突变实验证明miR-122作用于BZW2的3'UTR.用荧光定量PCR检测转染miRNA-122mimic的鸡(Gallus gallus)肝癌细胞系(leghorn hepatocellar,LMH)细胞和转染LNA-antimiR-122的鸡原代肝细胞中BZW2的表达.鸡BZW2的3'-UTR区域与miR-122种子区互补配对,荧光素酶报告基因和突变实验分析表明,miR-122能够通过与BZW23'-UTR区结合抑制基因的表达;将miR-122在LMH细胞中过表达后,发现BZW2 mRNA表达水平显著下降;利用LNA-antimiR-122抑制鸡肝脏原代细胞中的miR-122后,BZW2 mRNA表达水平呈显著性上升.结果证明BZW2是miR-122的靶基因,其在mRNA水平上受到miR-122的负性调控,本研究为揭示miR-122在鸡肝脏中的广泛的功能提供了理论依据.     

结合不对称PCR技术构建鸡NDV-IBV-ILTV联合检测基因芯片

基因芯片(gene chip)是依据核酸杂交原理发展的一种生物新技术,在生命科学研究领域具有重要的应用价值.本研究将不对称PCR和基因芯片两种技术相结合,构建了同步检测鸡(Gallus gallus)传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的共检基因芯片.分别选取ILTV的胸苷激酶(thymidine kinase,TK)和糖蛋白B(glycoproteins B,gB)基因、NDV的融合蛋白(fusion,F)和血凝素-神经氨酸酶蛋白(haemagglutinin-neuraminidase,HN)基因以及IBV的膜蛋白(membrane,M)和核衣壳(nucleocapsid,N)基因设计引物,从重组质粒菌中扩增制备探针基因,用乙醇沉淀法纯化后点制于氨基修饰的载玻片上,制备基因芯片;靶基因用cy3标记引物,进行不对称PCR扩增,扩增的荧光标记单链产物与芯片杂交.不对称PCR结果显示,当限制性引物与非限制性引物浓度比例在1:10时ILTV-TK、NDV-HN和IBV-N的单链产物增加最多,当浓度比在1:20时,ILTV-gB、NDV-F和IBV-M的单链产物增加最多;相应的标记样品与3种病毒检测芯片杂交后,均出现较强的杂交信号,而阴性对照检测不到荧光信号,灵敏性实验表明,当DNA浓度为1.8x 104拷贝时杂交仍为阳性.本研究构建的诊断基因芯片对12份临床样品进行初步应用检测,与PCR检测技术检出率基本一致.本实验所建立的联合检测基因芯片能够快速、准确、高通量的诊断NDV-IBV-ILTV,可以应用于集约化养殖业中对多种鸡疫病病毒的检测.     

鸡DGAT2基因第7外显子多态性与生产性能的关联

二脂酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase,DGAT)是催化真核生物甘油三酯合成最后一步反应的关键酶和限速酶,包括DGAT1和DGAT2两种.DGAT2对调节脂肪代谢、脂类在组织中的沉积及生长发育发挥重要作用.为研究鸡(Gallus gallus)DGA T2基因遗传多态性及其与生产性能的相关性,本研究以固始鸡×安卡鸡杂交F2资源群体(n=860)为研究材料,利用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技术检测DGAT2基因的多态性,并分析多态性与生长性状、肉质性状、屠体性状、血液生化指标和肌纤维性状之间的关联性.结果显示,DGAT2基因第7外显子g.13955位置存在一个同义突变位点(C→T),PCR扩增产物被限制性酶Taq Ⅰ酶切消化后显示出CC、CT和TT三种不同基因型,基因型频率分别为0.49、0.48和0.03,等位基因A和B的频率分别为0.73和0.27.相关性分析显示,固始鸡×安卡鸡F2代个体初生重,2、4周龄体重、4、8周龄体尺指标及肌内脂肪含量在不同基因型之间差异显著(P＜0.05),CC基因型多数性状值显著高于TT基因型,对其他指标在统计学上无显著影响(P＞0.05).由以上结果可以推测,鸡DGAT2基因g.13955C＞T与生长发育有关,且C等位基因为优势基因,有望成为家禽品种选育的潜在DNA分子标记.     

京海黄鸡繁殖性状与29个多态位点的关联性

为了寻找影响鸡(Gallus gallus)繁殖性状的候选基因,本研究利用单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片分型技术,利用已报道的影响鸡繁殖性状的29个位点对396只京海黄鸡母鸡的29个位点直接进行SNP分型,并对11个繁殖性状进行关联分析。结果发现,29个SNP中,有12个SNP与至少1个繁殖性状关联显著(P0.05),其中有7个SNP同时与2个繁殖性状关联显著(P0.05)。所有繁殖性状中,与京海黄鸡开产体重关联显著的SNP有1个,与京海黄鸡462 d产蛋数关联显著的SNP有2个,与蛋重关联显著的SNP有6个,与开产体重关联显著的SNP有6个,与综合选择指数关联显著的SNP有2个,与后代健雏率关联显著的SNP有1个,没有发现与300 d产蛋数、300~462 d产蛋数和后代孵化率关联显著的SNP。同时,根据这些位点的群体遗传参数发现,12个SNP的平均多态信息含量偏低,说明京海黄鸡有持续选育提高的可能性和必要性。大部分有利基因型为纯合基因型,但有部分基因型为杂合基因型。对与12个SNP最近的功能基因犰狳(Priodontes maximus)重复基因(armadillo repeat gene deleted in velocardiofacial syndrome,ARVCF)、集落刺激因子3受体基因(colony stimulating factor 3receptor,CSF3R)和ODZ同源物2基因(odz,odd Oz/ten-m homolog 2,ODZ2)的功能探讨发现,这些基因可以通过不同的途径影响鸡的繁殖性状。本研究为鸡繁殖性状候选基因的进一步研究提供了基础资料。     

小麦TaFKBP62c-2B基因克隆、组织表达及亚细胞定位

FK506结合蛋白(FK506 binding protein,FKBP)具有肽基-脯氨酰顺反异构酶(peptidyl-proly cistrans isomerase,PPIase)活性,可以作为一种分子伴侣在蛋白折叠中发挥作用.本研究采用同源基因克隆获得小麦(Triticum aestivum)高温胁迫应答基因TaFKBP62c-2B,利用qRT-PCR和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)示踪技术明确了TaFKBP62c-2B的表达模式和亚细胞定位信息.序列分析结果表明,小麦TaFKBP62c-2B基因含有37 bp的5'UTR区、1 926 bp的完整CDS以及176 bp的3'UTR区,共编码642个氨基酸(GenBank登录号:KU350629).结构域分析发现,TaFKBP62c-2B是由3个FK506结合保守域(FKBP_C)和3个三十四肽重复序列(tetratricopeptide repeat,TPR)构成的多域FKBP.qRT-PCR结果显不,TaFKBP62c-2B强烈响应高温胁迫;组织表达分析表明,TaFKBP62c-2B主要在小麦的茎和小穗等植株地上组织中表达,在根部的表达量较低.亚细胞定位表明,TaFKBP62c-2B位于内质网上.本研究获得了小麦TaFKBP62c-2B基因全长、明确了其表达规律以及亚细胞定位信息,为进一步了解TaFKBP62c-2B的生物学功能提供了基础资料.     

鸡端粒酶RNA基因的克隆

本研究采用扩增条件优化的PCR扩增技术,以MDCC-MSB1细胞基因组DNA为模板扩增出鸡端粒酶RNA（chicken telomerase RNA,chTR）全长基因,克隆到pMD18-T载体中,经酶切鉴定和PCR鉴定后测定序列。序列分析表明所克隆的鸡端粒酶RNA基因全长465bp,其中模板区的11个核苷（5＇-CUAACC-CUAAU-3＇）合成端粒亚单位（TTAGGG）n。chTR基因的克隆为进一步研究chTR在马立克氏病发病过程中的作用以及马立克氏病的发病机制提供可能的序列基础。     

高羊茅春化基因FaVRN1亚细胞定位与差异表达分析

高羊茅在生长季出现生殖枝,抑制新枝形成,不利于草坪质量及其持久性生长。研究春化基因的分子特征,探索抑制生殖生长的分子育种新途径,对坪用型高羊茅品种改良具有重要意义。本研究在克隆高羊茅春化基因FaVRN1的基础上,构建高羊茅春化基因FaVRN1与绿色荧光蛋白基因GFP融合的植物表达载体p-FaVRN1-hGFP,利用基因枪转化法转入洋葱表皮细胞,荧光显微镜检测融合基因的瞬时表达,并运用实时荧光定量PCR分析春化基因FaVRN1在春化与非春化条件下的表达差异。研究结果表明,FaVRN1基因编码的蛋白产物位于细胞核,符合它作为转录因子特性;春化条件下,FaVRN1基因的表达随处理时间延长逐渐增加。非春化条件下,FaVRN1基因的表达随处理时间延长而降低。FaVRN1基因在春化条件下的表达水平远高于非春化条件,FaVRN1基因的表达受春化条件正调控。     

鸡脚重性状的全基因组关联分析

鸡(Gallus gallus)脚重性状为鸡产业中的重要经济性状.为了揭示鸡脚重性状的遗传基础,寻找可用于鸡脚改良的分子标记,本研究以核心群京海黄鸡为实验动物,测定其脚重,利用简化基因组测序技术在整个基因组范围内检测与脚重相关的SNPs.共检测到16个与脚重相关的SNPs位点,其中13个集中分布在4号染色体上72.8～77.9 Mb区域;2个SNP位点rs475641139和rs475548810达到5％ Bonferroni全基因组显著水平(P＜5.5E-07),其余位点达到全基因组潜在显著水平(P＜1.1E-05).筛选每个SNP周围1 Mb区域内的基因,共找到9个可能的候选基因,并使用基因本体论(Gene Ontology,GO)数据库对9个候选基因的细胞组分、分子功能和参与的生物学进程进行了分析.结果表明二氢蝶啶还原酶(dihydropteridine deductase,QDPR)基因、LIM域结合蛋白2(LIM domain-binding protein 2,LDB2)基因、类184B家族(family with sequence similarity 184 memberB,FAM184B)基因、复合信号免疫球蛋白J结合蛋白(recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa J region,RBPJ)基因、纤维母细胞生长因子结合蛋白2(fibroblast growth factor-binding protein 2,FGFBP2)基因、富亮氨酸重复蛋白5(F-box and leucine-rich repeat protein 5,FBXL5)基因、胆囊收缩素受体A(cholecystokinin receptor type A,CCK1R)基因、肌动蛋白互作蛋白1 (WD repeat containing protein 1,WDR1)基因和类桶状蛋白4(tubby like protein 4,TULP4)9个基因和4号染色体72.8～77.9 Mb区域可能为影响鸡脚重性状的重要候选基因和潜在功能区域.本研究为鸡脚重性状的标记辅助选择提供了理论依据.     

鸡核受体辅激活蛋白基因(NCOA1)SNPs分析及mRNA的表达

核受体辅激活蛋白基因(NCOA1)是类固醇激素受体超家族中的一员,在生殖细胞的生长和分化过程中起着重要的调节作用。本研究利用PCR-SSCP技术对NCOA1基因外显子的多态性进行了分析,在第3和12外显子上分别发现了SNPs位点,并采用实时荧光定量PCR对多态性位点处mRNA表达水平进行了研究,发现NCOA1基因随着生长发育其表达量呈波动性增加,14周龄前表达量很少,随着性成熟NCOA1基因表达量快速增加,28周龄时其表达量达到峰值,之后表达量下降。产蛋性能较好的母系鸡NCOA1基因的相对表达量比产蛋性能较差的父系鸡较早地开始增加,并且在14周龄后表达量显著高于父系鸡(P<0.05)。同位点对产蛋性能有显著影响的优势基因型AA和CC个体的表达量在16周后也显著高于同位点的其他基因型个体(P<0.05)。研究提示NCOA1基因mRNA表达水平影响鸡的性成熟过程和产蛋性能。