不同转化方法获得的转基因棉花外源基因拷贝数分析

转基因植物中外源基因拷贝数是影响其自身表达水平与遗传稳定性的重要因素.本研究旨在比较农杆菌介导法、基因枪轰击法和花粉管通道法等3种常用方法转化同一植物表达载体的转基因棉花(Gossypium hirsutum)中外源基因拷贝数的差异.本文主要采用实时定量PCR技术及相应的PfaffI分析法检测转基因棉花单株拷贝数,并与Southern杂交做了相互验证.实时定量PCR研究结果显示,农杆菌介导法、基因枪轰击和花粉管通道注射法获得的T0代转化体中,外源基因拷贝数为1～2的单株占群体总数的百分比分别为26.2%、60%和42.8%.外源基因拷贝数为3～5的单株比例分别为47.5%、40%和57.1%.另外,农杆菌介导获得的转基因群体中有高达27.3%的单株整合有5拷贝以上的外源基因,而基因枪轰击和花粉管通道注射法获得的转基因群体中没有发现5拷贝以上的转基因单株.研究结果表明,基因枪轰击和花粉管通道注射法均能获得较高比例低拷贝(1～3拷贝)的转化体.本研究结果对棉花转基因育种中转化方法的选择有一定的理论指导意义.     

实时荧光PCR检测转基因大豆外源基因的拷贝数

快捷、准确地检测转基因植物中外源基因的拷贝数,是转基因生物育种的重要研究内容,具有较大的应用前景。本研究以7个抗虫BT(Bacillus thuringiensis)和抗草甘膦EPSPS-G10转基因大豆事件为材料,以SYBR Green I为荧光染料,利用实时荧光定量PCR方法,根据PCR反应获得的Ct值与起始模板数的对数值存在线性反比关系这一原理,建立了相关性系数在0.99以上的模板定量标线。通过目的基因与内参基因——大豆肌动蛋白编码基因ACTIN的起始模板量比较,估算出各株系的目的基因拷贝数。数据显示,株系1、2、3和4的2个基因均为单拷贝,株系6的2个基因均有2个拷贝,株系5和7的2个基因的拷贝数为3。利用Southern印迹方法对材料1~4的拷贝数进行验证,结果表明,两者的检测结果基本一致,证明实时荧光PCR检测法是大豆外源基因拷贝数检测中快速有效的方法。实时荧光PCR高效快速检测基因拷贝数,对于大规模转基因株系的外源基因拷贝数检测应用具有重大意义。     

利用微滴数字PCR分析转基因生物外源基因拷贝数

微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)是一种基于泊松分布原理的核酸分子绝对定量技术,在核酸分子的绝对计数/定量领域具有极大的应用潜力。本研究基于ddPCR平台,以转基因水稻(Oryza sativa)T1c-19和转人乳铁蛋白基因基因山羊(Capra hircus)134为例,建立了转基因生物(genetically modified organisms,GMOs)外源基因拷贝数分析方法,并比较了其与传统的实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和Southern blot方法的准确性。实验数据表明,T1c-19的杀虫晶体蛋白基因(insecticidal crystal protein,Cry1C*)在qRT-PCR和ddPCR测定结果比较一致,约为2拷贝,但已报道的Southern blot分析结果为1拷贝;ddPCR对bar基因的分析结果高于qRT-PCR,分别为2.09拷贝和1.51拷贝。转人乳铁蛋白基因(human lactoferrin,HLF)山羊134在qRT-PCR和ddPCR的分析结果基本一致,均测得含有1拷贝的HLF基因。研究结果表明,微滴数字PCR方法是一种经济、快速和准确的外源基因拷贝数分析新方法,灵敏度和准确性高,将会在拷贝数分析中广泛应用。     

毛囊特异表达载体pUHS-FGF18的构建及转基因小鼠的制备

成纤维生长因子18(fibroblast growth factor 18,Fgf18)是一种分泌型的信号分子,参与小鼠(Mus musculus)和绒山羊(Capra hircus)毛发生长及毛周期的调控.本研究克隆了小鼠Fgf18基因CDS区的片段,并将其连接于超高硫角蛋白(ultra-high sulfur keratin,UHS)启动子的下游.Sac Ⅰ、BglⅡ、SphⅠ和EcoT14 Ⅰ的酶切鉴定结果表明,成功构建了Fgf18基因毛囊特异表达载体pUHS-Fgf18.原核注射线性化pUHS-FGF18,共获得3只转基因小鼠.RT-PCR检测结果表明,Fgf18基因在转基因小鼠皮肤中的表达明显高于对照小鼠(P＜0.05).转基因小鼠NO.205皮肤中Fgf18的表达量明显高于对照小鼠(P＜0.05),而肝脏、肾脏、心脏、睾丸、骨骼肌、脾、脑、肺、胃和小肠等组织则与对照小鼠无显著性差异(P＞0.05).Westem blot的结果表明,转基因小鼠皮肤的Fgf18蛋白水平显著高于对照组(P＜0.05).同时本研究利用RT-PCR的方法检测了转基因小鼠中Fgf18基因的拷贝数,其拷贝数在8～210.本研究成功建立了毛囊特异表达Fgf18基因的转基因小鼠模型,不仅可为进一步研究Fgf18基因在毛周期及毛发生长中的功能及其作用机理提供必要的工具和手段,也可为生产Fgf18基因修饰的转基因绒山羊提供一定的理论基础.     

转基因抗虫棉花重组DNA在土壤中分布的实时定量PCR分析

根据转基因抗虫棉花35S启动子与Cry1A（c）基因以及35S启动子与nptⅡ基因之间的构建特异性序列分别设计引物和探针,建立荧光定量PCR检测方法,并对采集于3个生长时期（播种后40、50d和60d）的不同根区（根表、根际和非根际）土壤中35S-Cry1A和35S-nptⅡ片段进行定量分析。结果表明,所建立的荧光定量PCR方法最低能够检测到10个拷贝数的外源重组DNA片段,定量标准曲线相关系数均达到0.998以上,具有很好的重复性。实时定量PCR分析表明,同一生长时期不同根区土壤中35S-Cry1A和35S-nptⅡ片段拷贝数变化情况均为根表土〉根际土〉非根际土,即转基因抗虫棉花重组DNA片段主要分布于根表土壤中,其次为根际土壤和非根际土壤。在60d生长期内,土壤中35S-Cry1A和35S-nptⅡ片段的拷贝数随生长时期的推进均呈现上升趋势,其分布范围逐渐扩大。土壤中35S-nptⅡ片段拷贝数均高于同一生长时期相应根区中35S-Cry1A片段的拷贝数。转基因抗虫棉花对环境可能存在潜在影响。     

小麦转基因株系中外源脂氧合酶抑制基因(Loxi)拷贝数分析

转基因植物中外源基因拷贝数是影响其遗传稳定性及自身表达水平的重要因素。本研究旨在对转外源种子脂氧合酶基因的RNAi序列(RNAi sequence of lipoxygenase gene,Loxi)的小麦(Triticum aestivum)转基因株系中外源基因拷贝数及其种子脂氧合酶活性进行测定分析,以期获得种子脂氧合酶活性显著降低而且外源Loxi能稳定遗传的转基因小麦新种质。采用TaqMan实时定量PCR技术,以小麦内源控制籽粒硬度的主效单拷贝基因Pinb(puroindoline b)为内参基因,对6个转基因小麦TF5代株系外源Loxi拷贝数进行检测;同时以亚油酸为底物对这6个转基因株系种子脂氧合酶活性进行测定。结果显示,内参基因和外源基因扩增的标准曲线相关系数都接近于1,而且都具有合适的扩增效率,其中内参基因Pinb的扩增效率为107.7%;外源Loxi基因的扩增效率为104.5%;6个不同转基因株系中外源Loxi拷贝数不同,最小的为1,最大的为8;亲本品种陕优225和西农889种子脂氧合酶活性分别为(860±28.20)和(1 132±59.80)U;与其亲本材料相比,不同转基因株系种子脂氧合酶活性降低程度也不同(约为其亲本的21%~95%),有5个转基因株系与其亲本相比,酶活显著降低;其中亲本为西农889的3个转基因株系,外源Loxi拷贝数分别为2、6和8,与其对应的种子脂氧合酶活性与其亲本种子酶活性之比分别为32.76%、26.39%和21.05%;亲本为陕优225的3个转基因株系,外源Loxi拷贝数分别为1、3和6,其对应的种子脂氧合酶活性与其亲本种子酶活性之比分别为95.47%、51.06%和37.73%;外源Loxi拷贝数与种子LOX活性呈负相关。说明转基因株系中脂氧合酶基因的RNAi可有效抑制其种子LOX活性。本研究成功获得种子低脂氧合酶活性的转基因小麦材料,并对其外源Loxi拷贝数进行了准确测定;鉴定得到的种子脂氧合酶LOX活性显著降低的转基因小麦株系可为小麦育种提供新的亲本或种质材料。     

抗菌肽Shiva A基因在转基因柑橘无性繁殖后代中的遗传与表达分析

为进一步明确外源基因在转基因柑橘无性繁殖后代中的遗传稳定性及目标性状表现,本研究以转双价抗菌肽基因(ShivaA-cecropinB)纽荷尔脐橙(Citrus Sinensis Osbeck)无性繁殖后代植株为材料,通过PCR扩增,Southern杂交和实时定量PCR检测,以及温室抗病性评价分析等,对抗菌肽ShivaA基因在转基因柑橘后代株系中的遗传稳定性进行了研究.结果表明,外源抗菌肽Shiva A基因在转基因及其无性后代中能够稳定整合与表达.Southern杂交分析表明,ShivaA基因在无性繁殖后代基因组中为1个拷贝,而在T0代中为2个拷贝,由此推测T0代植株为混合嵌合体.定量PCR分析表明,ShivaA基因在To代中的表达水平低于其无性繁殖后代.本研究中外源基因的表达与拷贝数的多少成负相关.研究结果为开展转基因柑橘安全性评价提供了有用的实验材料,积累了有效的实验数据.     

Expression Pattern of Ａ Recombinant Phloem-specific Promoter from Pumpkin in Transgenic Potato Plants

以本实验室构建的重组南瓜(Cucurbita moschata)韧皮部特异启动子dENP构建了植物表达载体pBdENP。利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA44O4介导转化马铃薯(Solanum tuberosum)品种Favorita，经过抗生素筛选，共获得转pBdENP和对照pBI121的抗卡那霉素马铃薯再生植株106株。通过PCR初步筛查，筛选出65株为转基因阳性植株。通过Southern blot对部分植株进一步分析,确证外源gus基因已经插入到转基因马铃薯植株的基因组中，插入拷贝数在1个或2个以上。对这些转基因马铃薯植株进行GUS染色结果表明, dENP和CaMV35S启动子一样均能驱动gus基因的表达，前者仅在马铃薯的韧皮部内特异表达，而CaMV35S启动子驱动的gus基因为组成型性表达。GUS酶活力测定结果进一步表明dENP和CaMV35S启动子驱动gus基因表达水平没有明显区别。以上结果证明dENP启动子驱动的外源基因在马铃薯中也具有韧皮部特异而高效表达的特征，从而可用于马铃薯抗病、抗蚜虫转基因研究。     

PHAs合酶phaC2基因转化烟草叶绿体的研究

中长链羟基脂肪酸聚酯 (medium-chain-length-PHAs, mcl-PHAs) 属于微生物聚酯。Ⅱ型PHA合酶是mcl-PHAs生物合成途径中的关键酶。将编码Ⅱ型PHA合酶的基因phaC2与水稻(Oryza sativa )叶绿体psbA基因的启动子和终止子构建表达盒(RpsbA-pro-phaC2-RpsbA-ter)，连同壮观霉素抗性基因aadA表达盒(prrn-aadA-TpsbA-ter)一起克隆进烟草叶绿体基因组同源片段rbcL和accD中，构建了烟草叶绿体转化表达载体pTC2。基因枪法转化烟草(Nicotiana tobacum L.)叶片，获得具有壮观霉素抗性的转基因烟草。对T0代和T1代转基因植株的PCR和Southern blot鉴定结果表明, 外源基因确已整合进烟草叶绿体基因组中，T1代转基因植株已达同质化。RT-PCR分析结果证实phaC2基因已在转录水平上表达。转基因植株的正反交试验证明外源基因在转基因后代中遵循母性遗传规律，不存在转基因的花粉漂移现象。通过叶绿体遗传转化, 实现中长链羟基脂肪酸聚酯合成关键酶基因phaC2在烟草叶绿体基因组中的稳定转化。     

植物表达载体构建和转基因烟草抗除草剂及耐盐性的分析*

利用基因重组,将来自于拟南芥（Arabidopsis thaliana)的发生单个碱基突变的als基因插入含有AtNHXI1基因的质粒pCAMBIA1300中,由CaMV35S启动子分别启动AtNHX1和als的表达,得到了兼有除草剂抗性基因和耐盐相关基因的植物表达载体。用烟草叶盘转化法获得了转基因植株。Southern杂交检测表明,外源基因已经整合到烟草(Nicotiana tobacum)基因组中。抗性测定发现,转基因植株除草剂抗性至少提高了1000倍,而耐盐性提高了约1．0％NaCl浓度,即带有同样启动子的不同外源基因赋予转基因植株的抗性程度有明显差异。     

外源铁蛋白基因对水稻重要性状表达的影响

以原始亲本"秀水11"为轮回亲本,Fer转基因高代系("Fer34")为非轮回亲本,采用连续回交和自交,结合GUS组织染色检测,获得了性状稳定、且带有外源Fer基因的"Fer34-XS11",它与原"秀水11"组成近等基因系。对该近等基因系的重要农艺性状、品质性状、抗病性状等进行考察。结果表明,外源Fer基因对水稻导入系无不良影响,转基因系基本保持了原亲本的生物学特性。     

多重PCR筛查检测进口转基因玉米

为获得进口转基因玉米筛查检测策略,并根据策略建立多重PCR方法,对15个进口转基因玉米分子特征进行分析。结果表明,将P-Ca MV 35S、T-NOS等2个基因组合作为检测策略可全部检出15个进口转基因玉米至少1次;将P-Ca MV 35S、P-ract1、T-NOS、bar、pat、PMI等6个基因组合作为检测策略,除MON810检出1次外,其他每个转化体可检出至少2次。同时,利用获得的筛查检测策略建立多重PCR体系,对2个基因组合的策略优化,结果表明适宜退火温度为58℃,适宜引物终浓度(μmol·L-1)配比为0.2∶0.2;对6个基因组合的策略优化,结果表明适宜退火温度为60℃,引物终浓度配比为0.2∶0.1∶0.1∶0.1∶0.1∶0.05。采用已知样品对多重PCR体系进行验证,图谱显示与转化体分子特征完全一致。该研究结果将为进口转基因玉米筛查检测提供参考。     

中华绒螯蟹MIH基因的原核表达及其外源重组蛋白对内源性基因表达的影响

蜕皮抑制激素(molt inhibiting hormone,MIH)对甲壳动物的蜕壳生长起着至关重要的调控作用.本研究通过优化MIH基因的原核表达条件,获得其外源重组蛋白,研究了外源重组蛋白注射到中华绒螯蟹(Eriocheir sienesis)体内后,对眼柄中内源性MIH基因表达的影响.结果发现,构建的重组表达质粒(pET-28a-MIH)在27℃条件下用1.0 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导6h,目的蛋白表达量最高,此为该基因的原核表达优化条件.进而将MIH重组蛋白注射到活体中华绒螯蟹,发现注射4h后在眼柄中的内源MIH表达水平显著高于8、24h和空白对照组,表明外源性MIH重组蛋白只能在短时期内对内源性MIH表达有促进作用,从而会在一定程度上抑制中华绒螯蟹的蜕壳.研究结果为中华绒螯蟹的蜕壳机制研究和后续的抗体制备提供了基础资料.     

Analysis of Some Divalent Metal Contents in Tobacco Expressing the Exogenous Soybean Ferritin Gene

Abstract

T2 tobacco lines overexpressing soybean ferritin in the plastids (+TPs) or apoplasm (AFs) under the regulation of CaMV 35S promoter were grown on MS nutrient solution. After 1 month growth, statuses of six major divalent‐metals (Ca, Cu, Fe, Mg, Mn, and Zn) were measured in leaves and roots. Both +TPs and AFs showed enhanced growth (max. 1.7×) in leaves than the control line. The Fe contents in leaves of +TPs and AFs were significantly larger (1.9–2.8×) than that of the control line. The other metal contents in leaves of +TPs and AFs were almost the same as or less than those of the control line. In contrast to the result of leaves, the growth enhancement in roots was not clear in +TPs, but in AFs. Also, some of the non‐ferrous metal contents in roots of +TPs and AFs were dramatically increased compared with those of the control line (Mn, 1.9–10.4×; Zn, 1.6–2.3×), whereas the differences in content of Fe, Cu, Ca, and Mg were insignificant. These results demonstrated that the ferritin overexpression in apoplasm was as effective for inducing Fe accumulation as that in plastid. Under the normal metal‐balanced condition, even if the activation of Fe uptake related enzymes leads to the accumulation of non‐specific accumulation of divalent metal ions in roots, an Fe loading/unloading system and/or an internal translocator in xylem and phloem might specifically deliver Fe to the upper part of plants.     

利用近等基因系研究豌豆铁蛋白基因对水稻重要生物学特性的影响

为研究外源豌豆铁蛋白基因(Pea-Fer)导入水稻后对受体重要生物学特性的影响,本实验以原始受体亲本粳稻(Oryza sativa ssp.japanica)品种秀水11为轮回亲本,外源豌豆(Pisum sativum)铁蛋白转基因纯系Fer34为非轮回亲本,采取连续回交,结合gus标记基因辅助选择技术,在BC6F3获得含Pea-Fer的Fer34-XS11,它与秀水11构成一对近等基因系。结果显示,(1)Pea-Fer导入显著提高了水稻籽粒中的铁元素含量,但对镁、钙、锰和锌等元素的积累作用影响不大;(2)Pea-Fer导入对种子发芽特性和苗期植株生长速率无显著影响;(3)Pea-Fer导入没有改变成株叶片光合色素的含量和组成,但一定程度上提高了植株的净光合速率;(4)Pea-Fer导入对水稻的成熟期农艺性状及经济性状均无不良影响。外源豌豆铁蛋白基因的导入除使水稻籽粒的铁含量有明显增加外,研究结果表明对水稻其它重要生物学性状并无明显负作用,这为开展富铁水稻新品种培育提供了依据。     

利用抗性基因替换的方法将两个拷贝外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组同一位点

本研究提供了一种新的整合多拷贝外源基因表达单元到枯草芽孢杆菌染色体同一位点的方法。以β-淀粉酶表达单元作为应用实例,本方法包括以下步骤：首先,构建含有一个拷贝β-淀粉酶表达单元的整合质粒pMLK83-CTBA,通过同源双交换获得单拷贝β-淀粉酶表达单元整合到枯草芽孢杆菌1A751染色体α-淀粉酶基因位点的菌株1A751[CTBA]Neo＋;然后,利用抗性基因替换质粒pVK71,将新霉素抗性基因替换为状观霉素抗性基因,得到1A751[CTBA]Neo-Spe＋;最后,整合质粒pMLK83-CTBA再以同源单交换方式整合到1A751[CTBA]Neo-Spe＋染色体,通过新霉素抗性和状观霉素抗性筛选出两个拷贝β-淀粉酶基因整合的重组菌1A751[CTBA2]Neo＋Spe＋。结果显示,利用此方法增加β-淀粉酶基因的拷贝数,能够显著和稳定地提高β-淀粉酶的表达量。     

外源铜在土壤中的老化研究进展

水溶性Cu添加到土壤后,其可浸提性、生物有效性或毒害随时间逐渐降低,这个过程称为老化过程.田间污染土壤中的Cu与人工新添加的Cu在生物有效性上存在着明显的差异,因此,在生态风险评价和环境质量标准制定中,考虑Cu的老化过程显得十分必要.而且,它对污染土壤的管理和修复也有重要的指导意义.本文详细综述了外源Cu在土壤中的老化机理及影响因素,指出老化过程主要受扩散作用、聚合/沉淀作用和包裹作用共同控制,而且在长期老化阶段,微孔扩散成主导作用机理;pH、温度、有机质和土壤类型是老化的主要影响因子,其中pH影响聚合/沉淀作用和扩散作用,温度主要影响扩散作用,而有机质对上述各个机理都有影响.     

外源油菜素内酯对番茄铜胁迫的缓解效应

采用营养液水培的方法,以改良毛粉802F1 番茄为材料,研究外源2,4表油菜素内酯（2,4EBR,简称EBR）对铜胁迫下番茄抗氧化酶系统及生长发育的影响。结果表明:与铜胁迫处理相比,外源EBR处理能显著激活铜胁迫下抗氧化酶系统［过氧化物酶（POD）、超氧化物岐化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）］和根系活力,使丙二醛含量明显降低,叶绿素含量和生物量显著升高;铜胁迫显著提高了番茄铜含量（尤其是根系）,而外施EBR能够显著降低铜胁迫下番茄叶片和根系铜的含量,提高带有相同电荷的竞争性离子Fe、Zn、Mn含量,利于养分平衡,维持番茄正常的生长代谢。