镉污染土壤的植物修复及其EDTA调控研究I. 镉对富集植物印度芥菜的毒性

本文通过温室盆栽试验研究了在10~190 mg/kg共10个浓度梯度的Cd处理下,印度芥菜生长对Cd的响应、Cd在根与地上部的积累以及在Cd胁迫和毒害条件下对Ca和Zn吸收的影响。结果表明,Cd对印度芥菜生长的毒害浓度在各个生育期各有不同:幼苗期与营养生长前期在70~110 mg/kg左右;营养生长后期在110 mg/kg以上;成熟期在150 mg/kg左右。植物吸收的镉随土壤镉处理浓度的增加而增加,本试验中印度芥菜根和叶积累镉最高浓度分别为300 和160 mg/kg。在Cd胁迫下,印度芥菜吸收的Ca和Zn增加;在Cd毒害条件下,印度芥菜吸收的Ca和Zn下降。认为高浓度的Cd对印度芥菜生长有抑制,但印度芥菜对镉也表现出很强的耐性,这种耐性可能与植物体内Cd和Ca、Zn之间的平衡有关。     

镉污染土壤的植物修复及其EDTA调控研究II. EDTA对镉的形态及其生物毒性的影响

本文通过温室盆栽试验研究了10~200 mg/kg共20个浓度梯度的Cd处理下,EDTA加入土壤后对Cd的形态及其生物毒性的影响。在收获前一周加入EDTA,收获后测定植物根和地上部的生物量,以及H2O、NH4NO3和EDTA 3种提取剂提取的Cd浓度。结果表明,EDTA加入土壤一周后,土壤水溶态Cd增加了400倍以上,交换态Cd增加了40倍以上,印度芥菜根和地上部的生长都受到抑制。可能的原因是EDTA增加了土壤中镉的移动性,提高了Cd对植物的毒性。     

绒山羊成纤维细胞生长因子5基因(FGF5)毛囊特异性表达载体的构建及转染胎儿成纤维细胞

绒山羊的绒毛品质、产量与皮肤毛囊的生长发育密切相关。本研究旨在构建绒山羊(Capra hircus)成纤维细胞生长因子5基因(fibroblast growth factor 5,FGF5)的毛囊特异性表达载体,并证明其表达的有效性。分别以绒山羊基因组和c DNA为模板,利用PCR方法克隆角蛋白关联蛋白6-1(keratin associated protein 6-1,KAP6-1)基因的启动子和FGF5基因的编码区序列(coding sequence,CDS),并将这两个元件连接到去除CMV启动子的真核表达载体p EGFP-N1上,FGF5与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因表达框之间以猪捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV)2A(P2A)相连,构建毛囊特异性表达载体p EGFP-N1-KF。表达载体转染绒山羊胎儿成纤维细胞后,对细胞表达产物进行q RT-PCR和Western blot检测。酶切鉴定结果表明,载体p EGFP-N1-KF构建成功;q RT-PCR结果表明,FGF5正常表达;Western blot结果显示,P2A能够有效剪切FGF5和EGFP融合蛋白。表明成功得到了绒山羊FGF5基因的毛囊特异性表达载体并在绒山羊胎儿成纤维细胞中能正常表达。本实验为进一步研究绒山羊FGF5基因在毛囊发育和周期调控中的作用提供了技术支持。     

奶山羊ESCO2基因克隆及其功能的初步研究

乙酰基转移酶2 (establishment of sister chromatid cohesion N-acetyltransferase 2,ESCO2)主要作用为调控姐妹染色单体的凝聚,在细胞DNA双链断裂损伤修复中发挥着重要的作用.本研究以关中奶山羊(Capra hircus)作为实验材料,利用PCR、qRT-PCR、生物信息学、免疫荧光染色等方法,分析其基因序列以及表达规律,克隆ESCO2基因,同时构建真核表达载体pESCO2-IRES2-AcGFP并转染奶山羊雄性生殖干细胞(mGSCs-I-SB细胞).结果表明,奶山羊ESCO2基因(GenBank登录号:KP341998.1)全长为1 834bp,编码612个氨基酸.与其他物种相比,均具有较高的同源性,与牛(Bos taurus)的同源性高达97.82％.ESCO2基因在奶山羊的多个器官中广泛表达,尤其在心脏、肺部表达较高,肝、脾、睾丸次之.ESCO2基因从山羊出生后开始持续高表达,且表达量随山羊年龄增加而升高,一岁时达到最高,随之开始下降.转染pESCO2-IRES2-AcGFP表达载体的mGSCs-I-SB细胞的减数分裂相关基因表达量明显提高,证明ESCO2基因在奶山羊减数分裂和精子发生过程中发挥了重要的作用.本研究结果为进一步研究奶山羊精原细胞减数分裂的精密调控提供了分子基础.     

奶山羊ELOVL6基因启动子的克隆及活性区域分析

超长链脂肪酸延伸酶6(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)主要催化C12～C16饱和或单不饱和脂肪酸的延伸,是长链脂肪酸延长反应的限速酶.本研究根据云南黑山羊(Capra hircus)的基因组序列(Gene ID:NW_005100691.1)设计引物,以血液DNA为模板,利用PCR技术扩增得到西农萨能奶山羊(C.hircus)ELOVL6基因启动子的全长序列,通过缺失分析,构建了10个包含ELOVL6启动子不同缺失片段的荧光素酶报告基因载体,与海肾荧光素酶对照报告基因载体(pRL-TK)共同转染西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性.结果表明,克隆得到ELOVL6基因启动子全长序列2 370 bp(包含转录起始位点上游2 168 bp),其与牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)和鼠(Mus musculus)的基因组序列同源性分别为94％、81％和80％,LO VL6启动子上无典型的真核生物启动转录元件TATA框.缺失突变研究发现,ELOVL6基因启动子前端存在负调控元件,启动子核心区域位于转录起始位点上游109～40 bp,该序列包含过氧化酶体增殖物激活受体(peroxisom prolifeator-activated receptor,PPAR)、肝X受体(liver X receptor,LXR)、胆固醇调节元件结合蛋白-1 (sterol-regulatory element binding protein-1,SREBP-1)、特异性蛋白1(specificity protein 1,Sp1)及核因子Y(nuclear factor Y, NF-Y)等转录因子的结合位点,本研究为ELOVL6基因启动子的功能研究提供理论依据.     

转基因阿尔巴斯白绒山羊外源DsRed基因拷贝数与外源基因表达的关系

转基因动物的外源基因通过使用体细胞克隆与胚胎移植的方法将表达载体转入细胞后获得,大多以随机整合的形式存在于受体动物的基因组中,而转基因动物中外源基因的整合拷贝数是影响外源基因表达水平及遗传稳定性的重要因素之一,作为转基因动物遗传稳定性的鉴定指标,获得存活的转基因动物后便有必要对其外源基因拷贝数进行检测.为了研究转基因阿尔巴斯白绒山羊(Capra hircus)基因组内外源海葵红色荧光蛋白(red fluorescence protein from Discosoma sp.,DsRed)基因的拷贝数与其表达量之间是否存在一定的联系,本研究采用较鉴定外源基因拷贝数的传统方法DNA印迹杂交(Southern blot)更为高效率、高灵敏度、高准确性的绝对定量qRT-PCR法检测了6只转基因白绒山羊外源DsRed基因表达框中3个不同片段的拷贝数.结果表明,外源基因3个片段的拷贝数分别为巨细胞病毒(Cytomealovirus,CMV)启动子:2.80±0.38～13.68±0.16;DsRed基因:1.34±0.04～11.84±0.02;CMV启动子与DsRed连接处:1.58±0.04～19.22±0.38.通过qRT-PCR中相对定量的方法检测了6只转基因白绒山羊外源DsRed基因mRNA表达量,将其与外源基因中3个不同片段的拷贝数数据分别使用SPSS软件进行相关性分析后,相关性系数P值的结果为:CMV启动子为P=0.763;DsRed基因为P=0.665;CMV启动子与DsRed连接处为P=0.803,3组P值均大于0.05,无显著性相关.上述结果表明,在所检测的6只转基因阿尔巴斯白绒山羊中外源CMV启动子启动的DsRed基因的表达量与其在转基因白绒山羊基因组内的拷贝数在0.05的水平没有显著相关性.另外验证了绝对定量qRT-PCR法在大型转基因家畜的外源基因拷贝数的研究中的可靠性:其重复性良好,误差可控,可以成为检测转基因动物外源基因拷贝数的首选方法.     

MicroRNA(miR)-27b在山羊生长过程中的组织表达谱分析

本研究旨在分析microRNA(miR)-27b在安徽白山羊(Capra hircus)和波尔山羊生长发育过程中的表达变化,以了解其在山羊肌肉发育中的重要作用.选用安徽白山羊和波尔山羊不同发育时期(初生,6月龄和12月龄3个时期)背最长肌为材料,利用Real-time quantitative PCR (qRT-PCR)方法检测miR-27b的表达变化.同时,分析了miR-27b在6月龄山羊各组织中(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、腿肌和胸肌)的表达.并用MEGA3.1分析miR-27b在不同物种中的保守性.结果显示,miR-27b在安徽白山羊和波尔山羊骨骼肌发育过程中差异表达,呈现不同的表达模式.安徽白山羊12月龄背最长肌miR-27b表达最高,初生时最低.在山羊不同组织中,骨骼肌和心脏中miR-27b表达量较高,肝脏和肾脏中miR-27表达处于中度水平,而在另外4种组织中表达量较低.实验结果表明,miR-27b可能参与山羊肌细胞增殖和分化,从而影响山羊骨骼肌生长发育,与山羊肌肉的生长类型有关.同时序列分析显示,miR-27b在10个物种中具有较高的保守性.山羊miR-27b的表达具有的组织和时序差异性实验结果为进一步研究miR-27b的功能提供基础资料.     

西农萨能奶山羊脂联素受体1基因(AdipoR1)cDNA克隆、表达及功能分析

脂联素(adiponectin)具有改善胰岛素敏感性,调节脂肪酸代谢和参与细胞增殖和分化的功能。本研究参考Gen Bank中已收录的牛(Bos taurus)、小鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)等物种脂联素受体1基因(adiponectin receptor 1,Adipo R1)序列的同源比对结果,设计和合成PCR扩增引物,采用反转录PCR和RACE技术,分离并克隆了西农萨能奶山羊(Capra hircus)Adipo R1的c DNA序列。结果显示,Adipo R1全长2 032 bp(Gen Bank登录号:HQ846828),包括开放阅读框(open reading frame,ORF)1 128 bp,3’非翻译区(untranslated regions,UTR)719 bp和5’UTR 185 bp,该基因编码375个氨基酸。通过氨基酸序列比对发现,山羊与牛、猪(Sus scrofa)、小鼠和人的Adipo R1相似性较高,均在95%以上。蛋白质结构分析表明,其蛋白质的分子量为42.44 k D,等电点为7.19,含7个跨膜结构域,并且整个序列中不含信号肽。组织表达分析显示,该基因在肺中的表达量最高,小肠次之,在心脏中表达量最低,而其余8个组织中Adipo R1m RNA水平变化则比较平缓;奶山羊乳腺组织中Adipo R1表达量分析表明,Adipo R1的表达量在干奶期和泌乳盛期乳腺组织差异显著(P<0.05)。用不同浓度胰岛素(insulin)和催乳素(prolactin)处理奶山羊乳腺上皮细胞,结果发现,用胰岛素处理乳腺上皮细胞后,Adipo R1的表达量下调,在胰岛素浓度为50 nmo/L时效果最明显(P<0.01);用催乳素处理乳腺上皮细胞后,Adipo R1的表达量上升,在浓度为100 mg/m L时作用最明显(P<0.05),表明该基因在奶山羊乳腺上皮细胞中具有一定的调控作用。本研究为进一步揭示Adipo R1基因在奶山羊乳腺组织中的功能提供基础资料。     

摘除卵巢对母山羊肾周脂肪中脂肪酸组成及相关基因mRNA表达量的影响

公羊去势(摘除睾丸)作为一项十分成熟的生产技术,在畜牧生产上得到了非常广泛的应用,但是有关母山羊(Capra hircus)去势的研究还不多。本研究旨在探讨去势对母山羊血清中血糖、甘油三酯、总胆固醇水平,肾周脂肪组织中脂肪酸的组成以及对乙酰Co A羧化酶(acetly-Co A carboxylase,ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)和激素敏感酯酶(hormone sensitive lipase,HSL)基因表达的影响。将体重相近的5月龄母山羊摘除卵巢后测定其血糖、甘油三酯、胆固醇水平;采用Agilent-6890N气相色谱仪测定其肾周脂肪组织中脂肪酸的组成;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)相对定量方法检测FAS、ACC、LPL和HSL m RNA的相对表达量。结果表明,摘除卵巢后,母山羊血清中血糖、甘油三酯和总胆固醇水平较对照组均无显著性差异(P0.05),而且在整个实验过程中保持稳定;肾周脂肪组织中总饱和脂肪酸和4种饱和脂肪酸(SFA)(癸酸(C10∶0)、十五碳酸(C15∶0)、棕榈酸(C16∶0)和木质素酸(C24∶0))的比例(P0.05或P0.01)显著降低;肾周脂肪中总单不饱和脂肪酸(MUFA)和总多不饱和脂肪酸(PUFA)的比例与对照组差异不显著(P0.05),但是表现出了一种上升的趋势,油酸(C18∶1)比例显著上升(P0.05);脂肪酸代谢相关基因中LPL m RNA表达量显著提高(P0.05),ACC和FAS基因的表达量极显著提高(P0.01),HSL基因的表达量显著降低(P0.05)。摘除卵巢不会打破母山羊血清中血糖、甘油三酯、总胆固醇的平衡,可能通过影响肾周脂肪组织中脂肪酸代谢相关基因(FAS,ACC,LPL和SHL)m RNA的表达,降低肾周脂肪中饱和脂肪酸的比例,有利于改善羊肉的风味。本研究结果为揭示摘除母山羊卵巢改善肾周脂肪中脂肪酸的构成提供基础资料。     

调控山羊乳腺脂肪酸代谢miRNAs筛选及相关pri-miRNAs克隆验证

microRNA(miRNA)是调控脂类代谢的重要分子。本研究采用数据库预测和自由能分析法,筛选与山羊(Capra hirus)乳腺脂肪酸代谢相关的miRNA,并对预测得到的miRNA进行克隆验证。预测结果表明,通过MicroCosm、TargertScan和PicTar3个在线数据库预测与山羊脂肪酸代谢相关的30个基因相对应的miRNA,预测得到50条miRNA,其中3个数据库预测一致的miRNA为13条,2个数据库预测一致的为37条。结果显示,脂肪酸合酶基因(FASN)对应4个不同的miRNA,嗜乳脂蛋白基因(BTN1A1)对应2个,而磷酸甘油酰基转移酶6基因(AGPAT6)没有预测到miRNA靶位点;FASN与BTN1A1的3’UTR上miR-103的结合位点分别有3个和2个。通过MFOLD软件对预测所得的50条miRNA靶位点两侧序列的自由能(ΔG>-20kcal/mol)进行分析,9种miRNA与调控脂肪酸代谢基因相关度较高,分别为miR-103/BTN1A1、miR-15/FASN、miR-23/LPL(脂蛋白酯酶)、miR-27/PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活受体)、miR-29/GPR41(短链脂肪酸受体)、miR-146/BTN1A1、miR-195/FASN、miR-200/SCD(硬脂酰辅酶A去饱和酶)和miR-497/GPR41,其中miR-103/27/195分别位于BTN1A1、PPARγ和FASN的靶位点与已知物种间同源性较高,增加了这些miRNA/mRNA结合的可能性。此外,靶位点单侧和双侧ΔG小于阈值的miRNA/mRNA分别为14对和9对,其中miR-27/mRNA预测的靶基因为4个,依次为FASN、ACOX1(乙酰辅酶氧化酶基因1)、LPL和PPARγ,miR-103和miR-15的靶基因同为FASN、BTN1A1和ACOX1。以西农萨能奶山羊(Capra hirus)基因组DNA为模板,可扩增出与5条miRNA(miR-103-1/23a/27a/146b/200a)分别相对应的初级miRNA(pri-miRNA);通过序列分析和二级结构分析表明,5条pri-miRNA均包含完整的pre-miRNA序列,同时具有典型的茎环结构,能够产生相应的miRNA。与牛的同源性分析表明,除pre-miR-27a同源性为98%外(山羊pre-miR-27a3’端第11个碱基为G,而牛为A),其余4条pre-miRNA同源性均为100%。因此,本研究筛选的9种miRNA可能调控山羊乳腺脂肪酸代谢,克隆的5条pri-miRNA为其功能研究提供基础。