马铃薯腐烂茎线虫类毒液过敏原蛋白基因(Dd-vap-1)的克隆与表达定位分析

植物寄生线虫食道腺分泌蛋白在寄生致病过程中起到至关重要的作用.用RT-PCR结合RACE的方法从马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)中克隆了一个类毒液过敏原蛋白新基因Dd-vap-1.Dd-vap-1 cDNA全长1346bp,开放阅读框的长度为l 209 bp,推导编码一个含有402个氨基酸的蛋白序列(GenBank登录号JQ341057).推导蛋白Dd-VAP-1预测分子量为45.3 kD,等电点为6.68,序列比对分析表明,Dd-VAP-1为富含半胱氨酸分泌蛋白家族成员.原位杂交结果显示,Dd-vap-1在马铃薯腐烂茎线虫的亚腹食道腺细胞特异表达,推测该基因在马铃薯腐烂茎线虫侵染甘薯的早期阶段起重要的作用.     

马铃薯腐烂茎线虫类FMRF酰胺多肽基因(Dd-flp-1)的克隆与表达定位分析

植物寄生性线虫类FMRF酰胺多肽(FMRFamide-like neuropeptides,FLPs)在线虫的取食、分泌、迁移入侵和繁殖过程中发挥着重要的作用。本研究根据EST序列结合RACE方法,获得了一个马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)类FMRF酰胺多肽基因的cDNA全长。该基因cDNA全长序列为891bp,包括一个681bp的完整开放阅读框,编码一个包含227个氨基酸的蛋白,预测的分子量为25.36kD。序列分析表明,该蛋白N端有一个由43个氨基酸残基组成的信号肽,C端含117个氨基酸的FMRF酰胺肽的特征区,其中包含有5个NFLRFG的FLPs肽,属于典型的FLP-1型蛋白,该基因命名为Dd-flp-1(GenBank登录号为GU198750)。系统发育分析表明,Dd-FLP-1与自由生活线虫、动物寄生线虫和其他迁移性植物寄生线虫的FLPs属于同一支,推测线虫FLP的进化与其生活习性密切相关。原位杂交结果表明,Dd-flp-1在马铃薯腐烂茎线虫的咽神经环、后膀胱神经节多个细胞特异表达。推测DD-FLP-1主要与马铃薯腐烂茎线虫的取食、运动和排泄功能相关。本研究结果将为植...     

水稻干尖线虫海藻糖酶Ab-tre-1基因克隆与逆境条件下的表达分析

海藻糖酶参与生物体内能量代谢,在抵御逆境胁迫过程中发挥关键作用。水稻干尖线虫是水稻上重要的寄生线虫,能够在多种逆境中存活,严重危害水稻生长。为探究水稻干尖线虫海藻糖酶基因的功能,利用RACE-PCR技术获得了该线虫海藻糖酶基因全长,将其命名为Ab-tre-1,并利用实时荧光定量PCR技术分析在线虫卵、不同龄期和若干逆境条件下该基因的表达情况。结果表明,该基因DNA序列长2 083bp,包含9个内含子,开放阅读框1 743 bp,编码580个氨基酸,含有2个典型的海藻糖酶标签基序。进化树结果表明,水稻干尖线虫海藻糖酶与自由生活线虫和动物寄生线虫位于不同进化分支。Ab-tre-1在线虫卵中的表达最高,二龄幼虫和成虫次之,三、四龄幼虫表达水平较低。此外,当水稻干尖线虫暴露于干燥、活性氧、高温和药剂胁迫环境中,Ab-tre-1表达水平均显著提高,表明该基因可能与水稻干尖线虫的抗逆过程有关。本研究结果为阐明水稻干尖线虫海藻糖酶基因抗逆表达提供了理论依据。     

甘薯茎线虫β-1,4内切葡聚糖酶基因(Dd-eng-1b)cDNA全长的克隆与序列分析

β-1,4内切葡聚糖酶是植物寄生线虫食道腺分泌的一类细胞壁降解酶,在植物线虫的侵染过程中具有重要的作用.以马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)为材料,用RT-PCR和RACE方法,获得了β-1,4-内切葡聚糖酶基因的cDNA全长,并将该基因命名为Dd-eng-1b(GenBank登录号为FJ430142).此cDNA全长序列为1 640 bp,包括1个1 443 bp的完整ORF,编码1含481个氨基酸的蛋白,其理论分子量为50.89 kD,等电点pI为6.94.序列比对分析表明,含有糖基水解酶的保守结构域,属于纤维素酶第五家族成员,N端具有19个氨基酸残基组成的信号肽,C端含有细菌式样的纤维素结合域(CBD Ⅱ).cDNA与基因组DNA重叠分析表明,此基因包含4个内含子,长度分别为36、76、187和344bp,切割点符合5'-GT……AG-3'的规律.系统进化树分析表明,该基因与细菌Bacillus subtilis和Erwina carotovora分泌的纤维素酶属于同一支,推测该基因可能来源于细菌的水平基因转移.     

甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor)β-1,4内切葡聚糖酶基因(Dd-eng-1b)cDNA全长的克隆与序列分析

β-1,4内切葡聚糖酶是植物寄生线虫口针分泌的一类细胞壁降解酶,在植物线虫的侵染过程中具有重要的作用。本文以甘薯茎线虫为材料,用RT-PCR和RACE方法,获得了β-1,4-内切葡聚糖酶基因的cDNA全长,并将该基因命名为Dd-eng-1b (GenBank登录号为FJ430142)。此cDNA全长序列为1640bp,包括一个1443bp的完整ORF,编码一含481个氨基酸的蛋白,其理论分子量与等电点分别为50.89KD,pI为6.94。序列比对分析表明含有糖基水解酶的保守结构域,属于纤维素酶第五家族成员,N端具有19个氨基酸残基组成的信号肽,C端含有细菌式样的纤维素结合域(CBDⅡ)。cDNA与基因组DNA重叠分析表明,此基因包含4个内含子,长度分别为36bp、76bp、187bp和344bp,切割点符合5‘-GT...AG-3’的规律。系统进化树分析表明,该基因与细菌 Bacillus.subtilis和Erwina carotovora 分泌的纤维素酶属于同一支。     

植物寄生线虫Hsp70研究进展

热激蛋白70（heatshockprotein70,Hsp70）是所有原核生物和真核生物在发育过程中为了适应不同环境而合成并起关键作用的蛋白质家族。多种植物寄生线虫编码的Hsp70基因序列己被克隆和检测,但其在应激反应中线虫与寄主植物的互作机制仍不是很清楚。本文对Hsp70家族的分类、Hsp70结构及其生物学功能进行了综述,从Hsp70基因的克隆、表达和系统进化介绍了植物寄生线虫Hsp70基因的研究进展,并就今后植物寄生线虫Hsp70的相关应用基础研究进行了展望。     

黄秋葵对南方根结线虫抗性的转录组分析

为了解黄秋葵抗南方根结线虫相关基因组学,利用Illumina Hi-seq TM2500高通量测序技术研究受南方根结线虫侵染后黄秋葵种质12C2转录组基因的差异表达。结果表明,接种南方根结线虫18 h后,从接种和未接种的黄秋葵种质12C2根尖中共获得71.49 Gb有效数据,Q30碱基百分比均达到94.0%以上。共获得2 318个差异表达基因(DEGs),包括1 156个上调基因,1 162个下调基因,其中功能注释基因2 202个。根据unigene库序列进行GO、KOG和KEGG注释,细胞壁代谢相关基因——内切葡聚糖酶基因家族、聚半乳糖醛酸酶基因家族、葡聚糖内-1,3-β葡糖苷酶基因家族和果胶裂解酶基因家族下调表达,植物激素代谢相关基因——生长素响应蛋白基因、生长素流入运输载体基因下调表达,茉莉酸合成酶基因上调表达,调控相关基因表达的WRKY和MYB转录因子基因家族上调表达,参与植物细胞的膜联蛋白基因家族上调表达,植物细胞周期蛋白基因家族下调表达。本研究结果为开展黄秋葵抗南方根结线虫基因组学和分子生物学研究奠定了基础。     

松材线虫及其近缘种热激蛋白90基因(hsp90)克隆与序列分析

热激蛋白90家族(heat shock protein 90(HSP)family)是一种进化保守的蛋白质,在分子伴侣功能、细胞循环调控、抗原传递方面发挥着重要作用。本研究用RT-PCR和RACE技术,克隆得到了松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)和豆伞滑刃线虫(Bursaphelenchus doui)热激蛋白90基因的cDNA全长序列,分别命名为Bx-hsp90、Bm-hsp90和Bd-hsp90,(GenBank登录号分别为:GU013561、HMO34943和HM347331),其cDNA全长分别为2255、2193和2232bp,开放阅读框均为2127bp,编码708个氨基酸,5'端非编码区的长度分别为33、13和13bp,3'端非编码区的长度分别为95、53和92bp。其DNA全长分别为2440、2388和2407bp,包含3个内含子。三者氨基酸序列的一致性为98.78%。进化分析表明,松材线虫、拟松材线虫、豆伞滑刃线虫与秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的亲缘关系较近,推测三...     

棉花转录因子基因(GhMYB11)的克隆与表达分析

MYB基因家族在植物应对外界生物和非生物胁迫的过程中有重要的调控作用.本研究利用二倍体雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)基因组数据库,从陆地棉(G.hirsutum)品种鲁棉研32号中克隆到一个新的MYB转录因子GhMYB111(GenBank登录号:HQ234875.1),Cdna全长1 001 bp,开放阅读框828bp.通过与模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和主要作物小麦(Triticum aestivum L.)、玉米(Zea mays L.)、水稻(Oryza sativa L.) MYB蛋白的氨基酸序列比对发现,GhMYB 11蛋白与拟南芥中脱落酸(abscisic acid,ABA)合成和信号传导的重要基因AtMYB13/14编码的蛋白高度相似(E值分别为7e-83和1e-90),含两个高度保守的MYB结构域R2R3及一个转录激活结构域.实时定量PCR分析发现,GhMYB 11基因在黄萎病菌(Verticillium dahliae)侵染、干旱、盐和氧化胁迫处理后的棉花幼苗叶片中表达显著上调.GhMYB11基因可能在棉花生物和非生物胁迫反应中起重要调控作用,是陆地棉品种抗逆性遗传改良的重要候选基因.本研究为利用基因工程手段提高棉花抗逆性提供了基础材料     

叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-3701基因的克隆及高温胁迫下的表达分析

为探讨热激蛋白Hsp70基因在高温胁迫下的响应机制及其分子机理,分析Hsp70基因与叶用莴苣耐热性的关系,本研究通过同源克隆及RACE技术,克隆了叶用莴苣热激蛋白Ls Hsp70-3701基因的c DNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在叶用莴苣热敏品种P-S11和耐热品种G-S59中高温胁迫下的表达差异。该基因c DNA全长为2 191 bp,开放阅读框为1 950 bp,编码649个氨基酸,具有Hsp70家族特有的标签序列,与拟南芥、番茄、小麦等物种的Hsp70同源性达到90%以上。qRT-PCR分析显示,高温胁迫下该基因在2个品种中的表达均上调,在耐热品种中总体表达水平显著高于热敏品种,且在42℃高温下热敏品种P-S11中基因表达随着胁迫时间的增加受到抑制,而耐热品种G-S59中则能长时间保持较高的表达水平。结果表明,Ls Hsp70-3701基因可能与叶用莴苣耐热性相关。本研究为有效解决叶用莴苣高温抽薹问题提供了数据支持。     

基因芯片技术在植物基因克隆中的应用研究进展

基因芯片是以预先设计的方式将大量的生物讯息密码（寡核苷酸、cDNA、基因组DNA等）固定在玻片、硅片等固相载体上组成的密集分子阵列。基因芯片技术本质是生物信号的平行分析,它利用核酸分子杂交原理,通过荧光标记技术检测杂交亲和与否,再经过计算机分析处理可迅速获得所需信息。由于其具有高通量、微型化、连续化、自动化、快速和准确等特点,已引起国际国内广泛的关注和重视,在许多领域得到了广泛的应用。本文简述了基因芯片的概念,技术特点及主要分类,着重对其在基因表达水平检测,基因突变和多态性的分析,基因组DNA分析,后基因组学研究以及转基因农作物检测等方面进行阐述,并说明其存在的问题及展望。     

植物法呢基焦磷酸合酶基因(FPPS)研究进展

植物法呢基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase,FPPS)是甲羟戊酸代谢途径分支点的关键酶,参与叶绿素、类胡萝卜素、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素、长萜醇、类萜、辅酶Q、甾醇和植物毒素等类异戊二烯物质的合成,而类异戊二烯是维持植物生长发育等所必需的重要有机物质.本文综述了植物法呢基焦磷酸合酶基因克隆、基因表达、酶动力学研究等方面的重要进展,旨在为其在植物进化分类、遗传改良中的应用提供参考.     

分子标记技术及其在水稻基因定位上的应用

分子标记作为一种新兴的遗传标记手段,因其特有的优势而得到广泛的应用,带动了许多领域的快速发展。本文主要对分子标记的一般特点,基于全基因序列、简单重复序列、已知的特定序列、反转录转座子、单核苷酸的分子标记的类型及各类型代表性技术的基本原理和各自的优缺点进行详尽的综述,并进一步介绍了近年来分子标记在水稻基因定位上的相关应用,如水稻高产、优质、抗逆和抗病等重要农艺性状基因的分离克隆。最后还对分子标记技术在遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等方面的应用前景予以展望,以期该技术能发挥更大的作用。     

Analysis of the occurrence and activity of diazotrophic communities in organic and conventional horticultural soils

Nitrogen (N)-fixing microorganisms are an important soil component as they help replenish the pool of available N. Organic management can influence the N-fixing community; however, diazotroph community structure and activity in horticultural systems and the impacts of specific cultivation methods (i.e., greenhouse and open field) are unclear. Using the nifH gene, a marker gene for the microbial community involved in N fixation, we investigated the occurrence (DNA) and activity (RNA) of the diazotrophic community in organically and conventionally managed soils in a horticultural system over the course of 1 year. Ordination analysis of DGGE profiles revealed organic management affected the community structure in the greenhouse but not the open field; fertilization intensity may explain this divergent response, as indicated by the relevance of total C content to community structure. Quantitative PCR revealed that organic management increased the abundance and activity of diazotrophs. The soluble organic N concentration was higher in organically managed soils and during warmer months, and correlated with diazotroph abundance. Most identified sequences were from known diazotrophs, predominantly β-, γ- and α-proteobacteria. Twenty-four bands resembled Pseudomonas stutzeri and eight resembled Azoarcus sp. Our results show that the cultivation method controls the extent of the effects of season and organic management on diazotrophs, and that greenhouse cultivation can boost the effects of organic management on this community. Organic management intensified the positive effect of seasonal temperature on diazotroph abundance and activity, which may increase biological nitrogen fixation rates. In tandem, soil DNA and RNA analyses provide a comprehensive picture of the community.     

刚地弓形虫亲环蛋白基因TgCyP真核表达质粒的构建及其在Hela细胞内的表达

亲环蛋白（cyclophilin,CyP）是一类广泛存在于原核和真核生物体内的胞溶性蛋白,是刚地弓形虫（Toxoplasmngondii）速殖子的主要成分,能够诱导产生IL-12和IFN-γ,在控制弓形虫急性感染过程中起重要作用。本研究根据GenBank发表的TgCyP基因序列,设计并合成一对包含BamHI和EcoRI酶切位点的引物,以cDNA为模板,应用PCR技术扩增TgCyP基因。PCR产物连接到pMD18-T克隆载体。用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切克隆载体,将TgCyP目的基因克隆到载体pVAXI,构建真核表达质粒pVAXl-TgCyP。将真核表达质粒转染Hela细胞,利用问接免疫荧光检测其在Hela细胞内的表达情况。结果表明扩增的TgCyP基因与GenBank上相应基因序列（U04633．1）的一致性达100％,构建的真核表达质粒pVAX1-TgCyP能在转染的Hela细胞中表达,其表达产物与刚地弓形虫阳性血清具有免疫反应性。本研究表明Tg-CyP有望作为弓形虫疫苗的候选抗原,将为进一步研究该质粒的动物免疫试验奠定基础。     

正常生理及ISCOM疫苗免疫下小鼠乳腺Fc受体基因表达变化

本研究对小鼠不同生理阶段以及免疫条件下,乳腺内FcRn基因mRNA表达量的变化进行了分析。选择100只健康昆明小白鼠分为4组,在其分娩后4d分别进行如下制剂处理：灭菌生理盐水、脂肪酶蛋白（Lipase）＋灭菌生理盐水、空免疫刺激复合物（ISCOM）、Lipase-ISCOM。分娩后8d和12d用间接ELISA法测定乳中和血清中的特异性IgG效价,用RealTimePCR检测小鼠乳腺中FcRn基因的相对表达量,而正常生理状态乳腺内FcRn基因mRNA表达量的变化分别是在分娩后1d、4d、8d和12d进行检测。结果表明：正常状态下,乳腺B2M和FCGRT基因mRNA分别在0和1d表达最高,随后表达量下降并保持在一个稳定水平。免疫条件下,乳腺B2M和FCGRT基因mRNA显著上升。由此可知,免疫刺激可以引起小鼠乳FcRn基因表达上调。     

A problem of the rich: Prioritizing local plant genetic resources for ex situ conservation in Israel

A priority list of 323 plant species was created through a consultative process for ex situ conservation in the recently inaugurated Israel Plant Gene Bank (IGB). The IGB is set up to preserve plant genetic resources and the endangered genetic variability of the Israeli flora. Upon its inauguration, we consulted with the country’s leading plant breeders and botanists in an attempt to create a list of the most important plant species to be included in the initial collections. The list includes crop wild relatives (CWRs), selected according to their contribution to humans: edible plants (grains, vegetables, oil); forage plants; species with potential industrial and biotechnological applications (e.g. spices, medicinal plants, aromatic plants, fibers, dyes), and species with horticultural and forestry potential. We further ranked the species on the basis of assessed values for each of seven characteristics: distribution range in the country; abundance; rarity of the growing habitats; endemism; red number index—representing imminent threat of extinction; availability of samples in Israeli collections, and genetic relationship to cultivated crops. The sum of the assessed values for these seven characteristics was used to group the species on the list into four main prioritized-collection schemes. Statistical analysis indicated that all attributes had similar influence on the collecting prioritization scheme. In general, rare species with low abundance in their growing habitats were ranked in the highest priority group, while highly distributed species were sorted together into a lower priority group. The prioritization scheme will be used to optimize the collection in the IGB with the aim of establishing its collecting activities.     

猪肺泡巨噬细胞感染PRRSV进程中差异表达基因及基因功能富集分析

猪呼吸和繁殖综合症病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）感染猪后会引起妊娠母猪严重繁殖障碍和仔猪呼吸困难及高死亡率,给养猪产业造成了巨大经济损失,因此挖掘PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞进程中差异表达的基因及机理有重要意义。本研究对来自GEO数据库的PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞sage表达谱数据GSE10346进行后续挖掘。先用sage软件处理,经sagemap注释得到上调已知基因49个,下调已知基因41个。利用AgBase网站上的GORetriever工具和GOSlim Viewer工具进行细胞组分（cellular component）、分子功能（molecular function）及参与的生物过程（biological process）分类后发现有4个基因与病毒的复制相关：其中IL8已有报道认为与抗PRRSV相关;TNF-α能够抑制PRRSV复制;PPIA可能与GP5蛋白胞外区中和决定簇与抗体发生作用的24位脯氨酸有关;ICAM-1在嗜中性粒细胞的产生中起关键作用,与病毒吸附相关。这4个基因与PRRSV的致病机制相关,可望用于抗PRRSV研究。进一步利用David在线工具进行基因功能富集分析后,发现几个免疫通路,如趋化因子通路,Toll-like受体信号通路和NOD-like受体信号通路具有检验显著性,这些免疫通路在PRRSV感染过程中起着一定作用,有望成为抗PRRSV的靶通路。