小鼠干扰素应答基因(Ifrg15)的克隆、原核表达及其融合蛋白的亲和纯化

为研究一个可能的干扰素应答基因(interferon responsive gene 15,Ifrg15)所编码蛋白质的生物学功能,对昆明小鼠(Mus musculus)基因组DNA进行PCR扩增获得Ifrg15(393 bp),并将其克隆到pGEM-T载体,经测序鉴定后用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切下Ifrgl5基因片段并和双酶切后的表达载体pET-41(c)进行连接,然后转化入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞.对重组克隆用IPTG诱导融合蛋白的表达,并进行分离纯化.结果表明,本实验在E.coli BL21(DE3)菌株中成功地高效表达、并在变性亲和层析条件下成功纯化了GST&6xHis-Ifrg15融合蛋白.     

山羊c-Myc原癌基因克隆、原核表达和GST-Myc融合蛋白纯化

本研究的目的是通过分子克隆、原核表达和蛋白纯化技术获得山羊GST-Sox2融合蛋白.用RT-PCR方法从山羊(Capra hircus)肠组织克隆了c-Myc基因,通过TA克隆,构建了pMD18-T-Myc质粒.DNA测序证明,山羊c-Myc全长cDNA约1320 bp,该序列包含一个完整的开放阅读框,编码439个氨基酸,经分析该序列与绵羊(Ovis aries)的c-Myc序列同源性为99.2%.将该cDNA片段亚克隆至pGEX-KG载体,构建了重组质粒pGEX-KG-Myc.经酶切鉴定和测序,将重组质粒导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,由IPTG诱导表达,以谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和纯化GST-Myc融合蛋白.SDS-PAGE分析表明,纯化的GST-Myc融合蛋白约75 kD,与预期值相符,且呈现清晰的单一条带.Western blot检测证实,该融合蛋白能够被GST抗体所识别.本实验克隆了山羊c-Myc基因,获得了高纯度的GST-Myc融合蛋白,为其多克隆或单克隆抗体的制备提供了基础资料,为山羊iPS细胞(induced pluripotent stem cells)检测创造了条件.     

GDA2基因的克隆、原核表达与融合蛋白的纯化

摘要：GDA2（G2 pea dark accumulated gene）是与G2豌豆（Pisum sativum L.）短日照条件下不衰老现象紧密相关的基因之一。实验用cDNA差示分析法（representational difference analysis, RDA）得到一个短日照下特异表达的G2豌豆cDNA，并命名为 GDA2。核酸序列分析表明，该cDNA全长1 120 bp，最大的开放阅读框为642 bp，编码一个由213个氨基酸构成的分子量约为24 kD的蛋白质，与GDA1的同源性为36%。在GDA2的cDNA两端分别引入Bgl Ⅱ与XhoⅠ的酶切位点，用PCR方法将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，经过酶切筛选和测序鉴定，得到所需的表达载体pGEX-GDA2。将pGEX-GDA2导入E.coli BL21菌株，经IPTG诱导，得到分子量约51 kD的 GST-GDA2融合蛋白，并利用Glutathione Sepharose 4B亲和柱对该融合蛋白加以纯化。GDA2-GST融合蛋白的表达和纯化工作，为深入研究GDA2蛋白的结构与功能以及该基因同衰老的关系打下良好的基础。     

解淀粉芽孢杆菌YN-1抑菌蛋白TasA基因的克隆及原核表达

本文以解淀粉芽孢杆菌YN-1菌株为研究对象,利用PCR方法从基因组DNA中扩增出编码TasA抑菌基因的全长DNA,并构建pGEX-4T2/TasA原核表达载体,获得TasA-GST融合表达的抑菌蛋白。测序结果表明,解淀粉芽孢杆菌YN-1TasA基因核苷酸序列全长为786bp(GenBank登录号:EU131674),编码261个氨基酸残基;同源性分析表明,它与解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens FZB42(YP_001421886)序列的同源性最高,达98%,预测蛋白分子量为31kD。SDS-PAGE分析表明,TasA基因能在大肠杆菌BL21中表达,Western印迹分析pGEX-4T2/TasA原核表达载体,检测到约57kD的TasA-GST融合外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小相符。表达产物细胞裂解液上清经Ni柱层析,表明浓度为500mmol/L咪唑洗脱缓冲液时获得较高浓度和纯度的纯化蛋白。进一步抑菌活性分析表明表达产物对黄瓜灰霉病病原菌检测平板上显示出较好的抑菌活性。本研究结果将为今后深入研究TasA抑菌蛋白基因以及抗病转基因工程提供了参考。     

秦川牛天然免疫力相关巨噬细胞蛋白1基因(Nramp1)N端序列的原核表达及纯化

为了研究牛天然免疫力相关巨噬细胞蛋白1(Nramp1)的功能,探求转基因抗胞内感染菌牛新材料创制的功能基因,本实验应用RT-PCR方法从秦川牛(Bos taurus)外周血中扩增出Nramp1编码基因N端序列,并将其克隆到pMD18-T simple载体,酶切后连接于pGEX-4T-1表达载体,命名为pGEX-N2。将重组质粒pGEX-N2转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测GST-Nramp1-N融合蛋白表达,并筛选最佳诱导条件,用谷胱甘肽Sepharose4B介质分离纯化该融合蛋白。结果表明,牛Nramp1N端编码序列长186bp,与GenBank中的相应的牛基因序列(U12862.1)对比存在一个碱基差异,致使其编码的第49位氨基酸为丙氨酸。构建的牛Nramp1N端表达重组质粒pGEX-N2,于35℃、0.1mmol/LIPTG、诱导10h,在大肠杆菌中高效表达,表达产物的分子量为33kD。结果为进一步研究牛Nramp1在机体抵抗胞内菌感染中的作用并为利用该基因进行转基因抗病牛的培育提供了实验依据和实验材料。     

烟夜蛾泛素延伸蛋白基因的克隆与表达

应用RT-PCR技术，从烟夜蛾(Helicoverpa assulta)幼虫脂肪体组织总RNA中反转录扩增泛素延伸蛋白基因的cDNA片段，扩增得到的片段全长390bp，编码一个长为129个氨基酸残基的蛋白质，预测分子量14.8kDa。同源性分析表明，此cDNA序列为ubiquitin-53aa extension protein(ubi-53，UBE)基因，在泛素蛋白后融合了一个核糖体L40蛋白(ribosomal L40 protein)。使用Clustal W软件，对cDNA编码的氨基酸序列进行了同源性分析，分析表明：烟夜蛾的泛素延伸蛋白氨基酸序列与其他真核生物泛素延伸蛋白氨基酸序列高度同源（90%－98%），与棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)泛素的同源性为69%。将烟夜蛾的UBE基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG进行诱导表达，电泳检测到一条约40kDa大小的外源蛋白，用鼠抗GST抗体进行Western blot检测表明原核表达蛋白是目的蛋白。     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因的克隆与表达

蜘蛛丝具有极高的强度和韧度,工业和医学应用价值很高,但由于蜘蛛的不可驯养性使其应用受到限制。因此,本文尝试利用基因工程的方法获得蛛丝蛋白的表达。我们利用巢式PCR技术从大腹圆蛛Araneus ventricosus基因组中克隆了长度为837bp的拖牵丝蛋白基因（ASP）,并分别将其构建至原核表达载体pGEX-6p-1和真核表达载体pGFP-N2上,分别命名为pASG和pASN。pASG在大肠杆菌中16℃下24h诱导表达后,经蛋白质印迹证明成功地表达了GST-ASP融合蛋白;pASN转染昆虫sf9细胞48h后观察到了绿色荧光蛋白GFP的表达,表明ASP基因在大肠杆菌和真核细胞中分别得到了正确表达。本研究为利用基因工程的方法开发蛛丝蛋白的生产途径提供了有益的尝试。     

高粱抗病基因SbSGT1的克隆及原核表达

为探究高粱抗病基因SbSGT1的功能,以高粱BTx623为材料,利用RNA反转录得cDNA,以cDNA为模板扩增出全长SbSGT1基因,并对其进行生物信息学分析。进一步构建pET-28a-SbSGT1重组质粒进行原核表达,并分别对表达菌株、诱导温度以及异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导浓度进行了优化。结果表明,SbSGT1全长1 095 bp,编码364个氨基酸,蛋白理论分子大小约为40.45 kDa,蛋白质等电点为5.0。进化树分析表明,SbSGT1与玉米和水稻的亲缘性较高;蛋白质序列分析表明,SbSGT1蛋白为亲水性蛋白,定位在细胞质中;二级结构预测发现其α螺旋和无规则卷曲占比最高,分别达到43.41%和45.88%。原核表达结果表明,SbSGT1最佳表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3),最佳诱导温度和IPTG浓度分别为25℃和0.8 mmol·L^-1。本研究为进一步探究SbSGT1基因在高粱抗病机理中所发挥的生物学功能奠定了基础。     

鹰嘴豆α-淀粉酶抑制剂基因CL-AI的原核表达、纯化及生物学特性

为研究鹰嘴豆种子中新贮藏蛋白类型α-淀粉酶抑制剂CL-AI的抑制活性、生物活性以及三级结构,本研究利用前期克隆的α-淀粉酶抑制剂基因CL-AI及其2个亚基CL-AI-α、CL-AI-β分别构建原核表达载体p E-SUMO3,经诱导表达获得了CL-AI、CL-AI-α的可溶性融合蛋白和CL-AI-β包涵体融合蛋白,其中CL-AI-β通过构建含不同标签的表达载体,最终实现了可溶性表达。人唾液淀粉酶(HSA)抑制活性试验结果表明,CL-AI,CL-AI-α,CL-AI-β3个蛋白对HAS都有一定的抑制作用。发芽试验表明,CL-AI蛋白对小麦、玉米、水稻种子发芽过程中的发芽势、根长和芽长影响显著,与加入无菌水的处理相比,种子的简化活力指数显著下降。本研究结果为CL-AI蛋白的后续研究与应用奠定了基础。     

禽流感病毒B类等位基因NS1蛋白的原核表达、纯化及热稳定性分析

A型流感病毒的非结构蛋白基因(non-structural protein,NS)在进化上可以分为等位基因A和B,两者之间同源性低于70％;NS1是流感病毒对抗宿主免疫系统的主要毒力因子之一.本研究在序列比对分析的基础上,表达、纯化了本实验室保存的4株B类等位基因禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV) (A/duck/Hunan/S1256/12(H3N8),A/environment/Hunan/S4484/11(H12N7),A/duck/Guangdong/07/00(H5N1)和A/duck/Shanghai/08/01 (H5N1))的NS1蛋白,并对其进行稳定性分析.首先从感染的鸡胚尿囊液中提取病毒总RNA,利用特异引物Uni12反转录获得cDNA,以其为模板PCR扩增得到NS1全长片段,利用BamH Ⅰ和NotⅠ双酶切将其定向插入pGEX6P-1载体,大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中诱导表达.该蛋白在纯化过程中稳定性差,沉淀析出.为此,进一步构建NS1蛋白截短突变体(1M-202A,R38A/K41A),并在BL21菌株中诱导表达,经过GE health Glutathione sepharose 4B亲和层析、Source Q阳离子交换柱层析和Hitrap Superdex75分子筛凝胶层析逐步纯化,然后进行SDS-PAGE凝胶纯度分析,并测定OD320,进行蛋白热稳定性分析.结果表明,经进化分析,4株病毒均属于禽流感病毒B类等位基因群,4株病毒NS1蛋白经过全长野生型、全长突变体及截短突变体的逐步优化表达,截短突变体NS1蛋白表达质量相对较高,最终经过逐步纯化获得纯度达到90％以上的蛋白样品,且4株病毒中A/duck/Hunan/S 1256/12(H3N8)NS1蛋白的稳定性最好.研究结果为进一步研究其分子结构与功能提供了基础资料.     

中华绒螯蟹MIH基因的原核表达及其外源重组蛋白对内源性基因表达的影响

蜕皮抑制激素(molt inhibiting hormone,MIH)对甲壳动物的蜕壳生长起着至关重要的调控作用.本研究通过优化MIH基因的原核表达条件,获得其外源重组蛋白,研究了外源重组蛋白注射到中华绒螯蟹(Eriocheir sienesis)体内后,对眼柄中内源性MIH基因表达的影响.结果发现,构建的重组表达质粒(pET-28a-MIH)在27℃条件下用1.0 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导6h,目的蛋白表达量最高,此为该基因的原核表达优化条件.进而将MIH重组蛋白注射到活体中华绒螯蟹,发现注射4h后在眼柄中的内源MIH表达水平显著高于8、24h和空白对照组,表明外源性MIH重组蛋白只能在短时期内对内源性MIH表达有促进作用,从而会在一定程度上抑制中华绒螯蟹的蜕壳.研究结果为中华绒螯蟹的蜕壳机制研究和后续的抗体制备提供了基础资料.     

银杏果仁抗菌蛋白的分离纯化及其基因克隆和原核表达初步研究

通过40%及80%(NH4)2>SO4>分级盐析,CM Sephorose F.F.离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析;从银杏(Ginkgo biloba)种仁中分离纯化到一种表观分子量约为12 KD的抗菌蛋白.经过MALDI-TOF-MSPMF鉴定表明,该蛋白与一种新型抗菌蛋白Gnk2(ginkbilobin-2)具较高匹配率(P<0.05);根据ESI-MS/MS内肽氨基酸测序结果设计简并引物,扩增该蛋白基因一段,经比对发现与Gnk2基因序列相似性也达99%.按照Gnk2基因序列设计同源引物,利用RT-PCR克隆该抗菌蛋白全长基因,提交GeneBank(Accession No.FJ865399),并以此构建原核表达载体pGEX-GK2-1转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),SDS-PAGE和Western blot分析表明,融合蛋白在大肠杆菌中能够高效表达.     

小鼠抗病毒基因viperin的原核表达及其抗原性探索

Viperin是一种由Ⅰ型和Ⅱ型干扰素诱导的宿主蛋白,在进化上高度保守。本研究以小鼠脑组织为原材料,通过RT-PCR扩增得到包括完整open reading frame（ORF）的1 155 bp的viperin基因序列,成功亚克隆并构建了原核表达载体pET-32a-vip,将其转化到大肠杆菌Rosetta中进行原核表达。结果表明：原核表达的重组蛋白viperin主要以包涵体的形式表达,用镍离子亲和层析法获得纯度较高的viperin蛋白,为探讨原核表达的viperin抗原特性,将纯化的viperin蛋白免疫4周龄昆明小鼠,制备得到抗viperin多克隆抗体。经Western blot和IFA检测,该抗体能与真核细胞自然表达的viperin反应,特异性良好且效价高,表明原核表达的viperin具有良好的抗原性。获得的多克隆抗体为进一步研究viperin的抗病毒生物学功能奠定了良好的基础。     

猪甲状腺激素应答基因SPOT14(THRSP)的原核表达及其融合蛋白的亲和纯化

甲状腺激素应答基因（thyroidhormone responsive SPOT14,THRSP）是受甲状腺激素诱导表达的核内基因,参与脂肪合成代谢途径限速酶的转录调控,对动物脂肪生成具有重要的调控作用。为进一步研究猪SPOT14基因所编码蛋白质的生物学功能,本实验将猪SPOT14（GenBank登录号:JF₉51726）的ORF片段与表达载体pET-28α（+）进行重组,获得的重组子pET-28α（+）-S14,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL2l（DE3）感受态细胞,重组菌经IPTG诱导,通过SDS-PAGE分析显示,目的蛋白分子量约为20.91kD,且主要以包涵体形式存在,最佳诱导条件是37℃1mmol/LIPTG诱导5h。将获得的包涵体用6xHisNi-NTA纯化柱纯化后,采用Western blot进一步检测到了21kD目的蛋白的表达。重组质粒pET-28α（+）-S14在大肠杆菌BL21（DE3）中成功地得到了表达,不仅为SPOT14基因生物学功能的研究,而且为进一步研究S14蛋白功能,了解脂肪代谢调控机制提供了基础资料。     

茶树黄酮醇合成酶基因的克隆与原核表达

本研究采用EST测序技术和RT—PCR技术,获得了一个茶树茶多酚代谢中的重要基因——黄酮醇合成酶（FLS）基因,在GenBank登录（GenBank accession No．EF205150）,其序列全长1317bp,其中开放阅读框长996bp,编码331个氨基酸,3]端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为37．5kD,理论等电点为5．80。序列分析表明它与葡萄FLS基因序列的亲缘关系比较近。将该基因重组到表达载体pET-32a（＋）中进行原核表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明茶树黄酮醇合成酶基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约61kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。用Ni-NTA亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,得到了纯度在90%以上的纯化蛋白,为进一步研究PET-FLS融合蛋白的活性及功能奠定了基础。     

水牛MyD88 cDNA的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞总RNA中扩增出髓样分化因子88（mydoid differentiation factor88,MyD88）cDNA序列,PCR产物分离纯化后,与pMD20-T载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序,并进行生物信息学分析;构建pET28a-MyD88表达载体,并将其转化至E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、镍柱亲和层析纯化和Western blotting分析。结果显示,克隆到的水牛MyD88cDNA全长为1189bp,含有1个891bp的开放阅读框,编码296个氨基酸,理论等电点为5.65。经IPTG诱导表达后,得到一个带His·Tag的约39kD的重组融合蛋白。用抗His单克隆抗体进行Western blotting,得到1条约39kD特异性抗体结合带,表明水牛MyD88原核表达载体成功构建并表达。本研究为进一步开展水牛MyD88的结构功能分析奠定了基础。     

苏云金芽胞杆菌WB5中营养期杀虫蛋白3Aa基因(vip3Aa)的克隆、表达与纯化

营养期杀虫蛋白(vegetative insectcidal protein,Vip)是由苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在营养生长指数中期至稳定期期间分泌产生的一类新型杀虫因子,分为Vip1、Vip2和Vip3三种,以Vip3的研究最为深入。Vip3A对鳞翅目(Lepidoptera)害虫具有广谱杀虫活性,具有重要研究意义。本研究以Bt WB5菌株总DNA为模板,采用PCR方法扩增vip3Aa(Gen Bank登录号:AAM22456)全长,将该片段纯化回收后与p MD18-T连接并转入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,进行酶切验证和序列测定。将vip3Aa基因片段与经同样酶切的表达载体p Czn1连接,构建重组表达载体p Czn1-vip3Aa,转入大肠杆菌Arctic ExpressTM(DE3),异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明,在沉淀和上清中均有约88 k D VIP3Aa蛋白质表达产物;采用Ni亲和树脂对上清中的VIP3Aa融合表达蛋白进行了纯化,获得了纯化蛋白。本研究成功亚克隆了vip3Aa基因,并表达纯化了VIP3Aa蛋白,为后续研究VIP3Aa蛋白在昆虫中肠的作用受体提供了基础资料。