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CRISPR/Cas9系统在水稻基因编辑中的应用研究进展 总被引:1,自引:0,他引:1
CRISPR/Cas9系统是新一代的基因定点编辑技术,已成功应用于多种物种,例如,人、鼠、果蝇等。简单介绍该技术在水稻中的研究进展。涉及该系统的启动子、转化方法、突变效率等内容。 相似文献
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猪(Sus scrofa)内皮细胞的去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1)是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因之一.本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除的五指山小型猪基础上,利用规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)结合体细胞核移植技术制备ASGR1基因敲除猪,针对猪ASGR1基因设计并构建了靶向表达载体单链导向RNAl (single guide RNA1,sgRNA1),将sgRNA1与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)质粒共同电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞,流式细胞仪富集筛选带绿色荧光的细胞后培养单细胞克隆.实验结果表明,PCR测序检测培养获得的41个单细胞克隆,37个克隆发生基因突变,ASGR1基因突变效率为90%,其中双等位基因敲除的细胞克隆30个,效率高达73%.选择4个ASGR1基因敲除类型不同的细胞为核供体进行核移植,将早期重构胚移植到4头受体猪,2头妊娠至终期,产仔猪6头,Western blot显示ASGR1基因敲除仔猪的肝脏中没有ASGR1的表达.对sgRNA1的13个潜在脱靶位点,分别设计引物进行PCR扩增和测序,结果显示没有脱靶现象.总之,本研究利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,有望解决异种肝移植后出现的血小板减少症,为临床过渡肝的应用研究提供了良好的研究材料. 相似文献
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NAC转录因子参与植物生长发育、果实色素积累、细胞壁形态形成和植株衰老等过程。为系统研究SNAC4(SlNAC48,基因ID:101247735)和SNAC9(SlNAC19,基因ID:101248665)在番茄成熟衰老进程中的精准功能,本试验设计SNAC4/9敲除靶点,通过重叠聚合酶链式反应(overlapping PCR)法构建单引导RNA(sgRNA)表达盒,采用金门分子克隆(golden gate)方法将单个或多个sgRNA表达盒组装至pYLCRISPR/Cas9载体。PCR和测序结果表明,SNAC4/9敲除载体构建成功,通过农杆菌转化法将编码Cas9蛋白和sgRNA的基因导入Micro-Tom番茄细胞,对阳性苗进行靶点和脱靶位点检测,结果表明番茄成功突变且未脱靶,通过鉴定T1代突变体进一步证明,CRISPR/Cas9基因编辑番茄的靶点在代际之间可以稳定遗传。与野生型相比,SNAC4/9敲除果实色素积累减少,成熟延迟,表明SNAC4/9在番茄果实成熟中发挥重要作用。本研究为进一步探究SNAC4/9调控番茄果实色素代谢和胞壁代谢机制提供了遗传材料和试验基础。 相似文献
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MAP65-3是植物胞质分裂的重要调节因子。为探究水稻OsMAP65-3基因的功能,本研究采用CRISPR/Cas9技术对水稻中OsMAP65-3基因(OsMAP65-3.1和OsMAP65-3.2)进行编辑。针对每个基因各设计了2个不同的靶位点,并将OsMAP65-3.1与OsMAP65-3.2的靶位点放在同一个载体上,构建了CSMAP65-3A和CSMAP65-3B 2个双基因编辑载体。通过农杆菌介导的遗传转化分别获得17和21个植株,PCR鉴定阳性植株分别为16和20株。对T0代植株靶位点附近序列进行测序分析,结果表明OsMAP65-3s基因均被成功编辑,OsMAP65-3.1 2个位点编辑效率为17.50%和9.38%,OsMAP65-3.2 编辑效率为15.62%和45.00%;T0代已获得osmap65-3.2、osmap65-3.2/OsMAP65-3.1(+/-)和OsMAP65-3.2(+/-)/OsMAP65-3.1(+/-)材料。本研究为进一步创制OsMAP65-3s突变体,开展基因功能研究和水稻胞质分裂分子机制解析奠定了理论基础。 相似文献
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长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度>200 nt、生物来源广泛、二级及三级结构高度保守的RNA分子.lncRNA生物学功能丰富,广泛参与生物体各类重要生理过程,在转录、转录后表观遗传水平上对靶基因的表达进行调控,其精细的分子调控机制已在染色体剂量补偿、基因组印记、靶目标模仿、功能性蛋白质转运等生物学过程中被广泛揭示.随着lncRNA生物学作用机制不断被揭示,研究者发现,高度保守的lncRNA二级、三级结构对其生物学功能的发挥至关重要.目前研究者主要采用计算机手段和数学方法对lncRNA高级功能结构域进行预测,从结构上阐明其生物学调控机制.关于lncRNA相关研究方法也在近年来得到了飞速的发展,比较成熟的技术例如RNA纯化的染色质分离(chromatin isolation by RNA purification,ChIRP)和RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA-binding protein immunoprecipitation,RIP)已逐渐成为该领域内研究lncRNA与染色质、lncRNA与蛋白质之间相互作用的热门技术.本文主要就lncRNA来源、分类标准、生物学功能、高级结构预测及相关研究方法进行了综述,旨在为更好地理解和研究lncRNA在生物体内的作用提供参考. 相似文献
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为了尝试利用分子育种技术高效选育实用性籼稻优质香型不育系,本实验对参试的13份水稻籼型(Oryzasativa ssp.indica)保持系进行了稻米香味性状测定,并采用香味基因(fgr)的功能分子标记1F/1R进行PCR分子检测,发现宜香B有浓烈香味,PCR扩增出Ⅰ型带(fgr/fgr),其余材料均为Ⅱ型带(Fgr/Fgr)。利用该分子标记,对Ⅱ-32B/宜香B配组的F1~3进行了1F/1R标记多态性鉴定,结果表明,分子标记具有共显性特性,表现为单基因控制模式。经过F2代分子标记辅助选择,F3代入选株系的香味特异性标记1F/1R纯合率高达96.0%。在F3选留的Ⅰ型纯合系基础上,结合株型、粒型、透明度、垩白度、糊化温度、直链淀粉等指标的田间和室内选择,选株与Ⅱ-32A成对交,并以后每世代保持约50~60对成对交规模,连续5代选株成对交,最终获得了一批性状稳定的优质香型不育系(保持系),暂定名为浙农香A(B)系列。实验还选取4份代表性不育系(保持系)作了较为全面的特性鉴定,结果表明,该4份不育系(保持系)的1F/1R均为Ⅰ型标记,香味明显,且株型良好、粒型细长、高透明度、低垩白、中等糊化温度、中等AC含量,是... 相似文献
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利用shRNA真核表达载体干涉雌性鸡胚性腺中芳香化酶基因(CYP19A1)的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
本研究通过把构建的短发夹结构RNA(shRNA)真核表达载体导入鸡胚,检测鸡胚性腺分化期质粒载体在鸡胚体内代谢情况及雌性鸡胚性腺中芳香化酶基因(CYP19A1)mRNA表达效率,进而探讨利用该方法在鸡胚体内进行特定基因干涉的可行性.实验针对CYP19A1基因构建了4条特异性表达载体,一条非特异性表达载体.每个实验组选取45个新鲜种蛋作为实验材料进行胚盘下腔注射,并设立空白对照组.鸡胚发育12d时,检测各处理组鸡胚肝脏组织中质粒存在情况,并取其左侧性腺组织进行目标基因的荧光定量分析.研究结果表明,导入组在12日胚龄时所有鸡胚基因组中均可检测到绿色荧光蛋白基因(EGFP);荧光定量结果显示,导入特异性表达载体cyp-580、cyp-1083和cyp-1295后,对应雌性鸡胚性腺CYP19A1 mRNA表达效率显著低于空白对照组,干涉效率分别为:73%、52%和85%;特异性表达载体cyp-1403组CYP19A1mRNA表达效率与空白对照组相比有所降低但无显著性差异.本实验为诱导鸡胚性反转提供了新方法并建立了鸡胚发育期特定基因体内干涉新平台. 相似文献
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控制肉鸡脂肪过多沉积是肉鸡生产中亟待解决的问题。脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)是人体分泌最为丰富的肾上腺类固醇激素,可经由类固醇激素受体介导发挥生理功能,降低机体生脂能力。本研究以鸡胚原代肝细胞为研究对象,选用含DHEA终浓度为0(对照)、0.01、0.1、1.0、10和100μmol/L的培养液孵育肝细胞20min后收集细胞,放射免疫测定法(RIA)检测胞内cAMP水平。结果发现,0.1~100μmol/L DHEA孵育肝细胞均可显著提高胞内cAMP水平(P<0.05),其中0.1μmol/L DHEA效果最为显著(P<0.01)。0.1μmol/L DHEA孵育肝细胞20min或1h后收集细胞,RIA法分别检测胞内腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)活性,(γ-32P)ATP掺入法测定cAMP依赖性蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)活性,Western blot法测定cAMP反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)磷酸化水平。结果显示,0.1μmol/L DHEA孵育肝细胞20min可显著降低胞内PDE活性(P<0.05),提高PKA活性(P<0.05),但对AC活性无显著性影响(P>0.05)。0.1μmol/L DHEA处理肝细胞1h可显著提高CREB蛋白磷酸化水平(P<0.05),且这种效应可被PKA抑制剂阻断(P>0.05)。本研究结果提示,DHEA调控肉鸡肝脏脂肪代谢,降低脂肪沉积的机制可能与激活胞内cAMP/PKA信号系统,活化转录因子CREB有关。 相似文献
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不同施肥模式对菜-稻轮作农田土壤磷素径流损失与表观平衡的影响 总被引:3,自引:0,他引:3
采用田间小区定位试验(2015—2016年)研究了自然降雨条件下农户习惯性施肥(T1)、减量施肥(T2)及优化施肥(T3)不同施肥模式对太湖流域菜—稻轮作农田土壤磷素径流流失特征和磷素表观平衡的影响。结果表明:菜—轮作农田地表径流排水主要分布于强降雨(梅雨季、台风季)集中的水稻生长季,与降雨量呈显著线性正相关关系。磷素径流流失也集中在水稻季,各处理条件下,其流失量占周年流失总量的比例达74.75%~81.46%。农户习惯性施肥模式(T1)处理条件下,蔬菜季径流总磷平均浓度(0.55mg/L)显著高于水稻季(0.29mg/L),但磷素径流流失量(0.49kg/hm^2)却显著低于水稻季(2.13kg/hm^2)。减量施肥(T2)和优化施肥(T3)模式处理可显著降低蔬菜季、水稻季径流磷素浓度和菜—稻周年磷素径流流失量。较T1处理,T2和T3处理显著降低菜—稻周年TP径流流失量分别达22.48%和45.66%。菜—稻轮作农田土壤磷素盈余量呈现显著的施肥模式差异和季节差异,周年盈余量高达260.90kg/hm^2,且主要集中在蔬菜生长季(70.63%)。较T1处理,T2、T3处理显著降低周年磷素盈余量达38.47%~64.87%(P<0.05)。同时,虽然蔬菜产量在T2、T3处理下均显著下降,但较T2处理,T3处理对蔬菜、水稻及周年产量均无显著影响。可见,菜—稻轮作种植模式下,蔬菜季施用适量生物炭,稻季不施磷具有磷素减排、维持作物稳产和磷素表观平衡的协同效应。 相似文献