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通过设计大量引物,探索在植物甲基化引物设计中长、短引物的设计方法及其相应的PCR条件,同时比较不同Taq酶对甲基化率影响。结果表明:17~30 bp短引物适合使用Touch-down程序PCR,但特异性差、成功率低;31~50 bp长引物使用55℃退火60℃延伸的PCR条件成功率最高,其中反向引物的长度及Tm小于正向引物较佳;高保真酶因其3′→5′外切酶活性不宜用于甲基化研究,而Epi TaqTMHS在PCR结果中表现最佳。 相似文献
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【研究目的】探针标记技术是分子生物学和基因工程研究中常用实验技术,需要发展高效、快速、低成本、安全、简捷的DNA探针标记方法;【方法】利用普通的Taq酶进行PCR探针标记,电泳和Southern杂交检测探针标记结果;【结果】电泳检测发现标记产物在电泳时相对非标记的对照表现明显滞后,表明探针标记成功;电泳条带清晰明亮,表明探针标记效率高;Southern杂交条带清晰,说明该方法标记的探针可用于Southern等分子杂交实验;【结论】利用普通的Taq酶进行PCR探针标记,是一种低成本、高效、快速的DNA探针标记方法。 相似文献
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PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点,已被广泛地应用于水产、微生物检测等许多领域。该文从PCR技术的原理及应用方面进行了综述,并对其发展做出了展望。 相似文献
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猪瘟病毒实时定量PCR检测方法的建立及初步应用 总被引:1,自引:0,他引:1
为建立一种快速检测猪瘟病毒的基因检测方法,根据GenBank中猪瘟病毒(CSFV)基因组NS2基因序列设计并合成引物和Taq Man探针,通过各项条件优化并以10倍稀释度的质粒为标准品进行实时定量PCR扩增制作标准曲线,建立检测CSFV的实时定量PCR方法。该方法的检测灵敏度可达每微升10个拷贝,比常规PCR方法的灵敏度高出1个数量级;对标准品质粒检测的线性范围是1.0×109~1.0×101μL-1。对1.0×107、1.0×105、1.0×103μL-13种稀释度的标准品质粒进行重复试验,批内变异系数分别是0.30%、0.85%、0.43%,批间变异系数分别是0.81%、1.36%、0.63%,具有良好的重复性。应用该方法对45份临床样品进行检测,检出26份阳性样品,而常规PCR只检测出19份阳性样品,说明该实时定量PCR方法的敏感性高于常规PCR。可见,该方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,可用于检测病料中的猪瘟病毒。 相似文献
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实时荧光定量PCR技术的实验研究 总被引:1,自引:1,他引:1
实时荧光定量PCR技术是在普通PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术,已广泛应用于不同研究领域。论述了荧光定量PCR技术的基本原理、主要类型和定量实验方法,探讨了实验条件的控制、影响因素和优化实验结果的方法。 相似文献
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酸酐能与聚合酶上的赖氨酸结合形成聚合物,试验通过选用合适的酸酐,修饰Taq DNA聚合酶。在常温下,酶活性被封闭,升温过程中不表现酶活,从而减少非特异性扩增和引物二聚体的形成;而在较高的温度下一段时间后,一般为94℃、15 min,酸酐脱落,聚合酶得以恢复正常的扩增活性,从而实现PCR反应的热启动。由此建立的热启动PCR体系灵敏度高,可以检测到10个拷贝的DNA分子,较普通PCR体系提高了2个数量级。此方法较其他方法操作简单成本低廉,且所得的热启动Taq DNA聚合酶稳定性好,便于保存,其灵敏性与特异性也更高。这种通过化学修饰形成的复合物达到热启动PCR目的的方法的建立,具有着重要的意义,是提高PCR灵敏度和特异性的重要方法之一。 相似文献
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比较了加入自我延伸过程的融合PCR程序与传统PCR在扩增融合基因的扩增效果,自我延伸程序(94 ℃×1min,52℃×1 min,72℃×1 min)扩增2次,分别用不同的延伸时间:1 min、2 min、3 min、5 min,发现用2 min、3 min、5 min延伸时间扩增出的融合基因条带比传统PCR显著亮一些,而用延伸时间为1 min时,两种程序扩增出融合基因条带的亮度相近,说明自我延伸程序中的延伸时间是影响融合基因扩增量的关键因素.加入自我延伸过程的融合PCR扩增程序为:94 ℃×5 min,(94℃×1 min,52℃×1 min,72℃×5 min)×2次循环,(94℃×1 min,52℃×1 min,72℃×1 min)×30次,4℃ store. 相似文献
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西瓜细菌性果斑病菌Taq Man探针实时荧光PCR检测鉴定方法的建立 总被引:5,自引:0,他引:5
根据西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)与相关细菌16SrDNA序列差异,设计出对西瓜细菌性果斑病菌具有稳定点突变特异性探针Aac—probe,利用该探针对23种供试菌株进行了实时荧光PCR检测实验。结果表明,只有西瓜细菌性果斑病菌能检测到荧光增强信号,其它细菌无荧光增强信号。该方法特异性强,灵敏度高,重复性好,可有效地应用于西瓜细菌性果斑病菌的检测。 相似文献
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实时荧光定量PCR技术是在传统PCR技术上发展而来的,不仅能判断某一基因的有无,而且还能对其进行定量分析。由于该技术与常规PCR相比,能够进行实时监测、且自动化程度高而被广大研究者青睐。本文对实时荧光定量PCR的原理、数据分析、定量方法、分类以及应用进行了系统而详细地综述。 相似文献
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为了建立小蓬竹(Drepanostachyum luodianense) RAPD PCR反应的最优体系,以小蓬竹基因组DNA为模板,对影响其RAPD扩增的dNTPs浓度、模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶量、引物浓度、Mg2+浓度等重要参数进行了单因子和正交试验。试验得出小蓬竹RAPD最优反应体系为: 20 μL反应体系,10×PCR buffer为1/10体积,dNTPs为100 μmol·L-1,模板DNA量为30 ng,Taq DNA聚合酶为10 U,引物浓度为02 μmol·L-1,Mg2+浓度为15 mmol·L-1。优化后的RAPD PCR反应程序为: 94℃预变性5 min,然后进入35个循环,即94℃变性1 min,35℃退火30 s,72℃延伸90 s,循环完毕后于72℃延伸7 min,最后在4℃保持。 相似文献
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用于染色体步行的PCR技术 总被引:2,自引:0,他引:2
对用于染色体步行的PCR技术进行了综述,将已报道的11种用于兆色体步行的PCR技术分为4类,指出了各种技术方法的优点及成功运用的例子,并对这些技术的局限性和今后发展的趋势进行了探讨。 相似文献
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从复杂的生物有机体基因组中分离出目的基因是基因工程的第一步。众所周知,生物有机体,尤其是具有复杂基因组结构的真核生物,其DNA含量十分庞大,基因间断地分布在这些漫长的碱基序列中间,从中搜寻并分离出带有目的基因的DNA片段无疑是一项十分艰巨繁重的工作。一、?.. 相似文献
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以基因外重复的回文因子(repetitiveextragenicpalindromic,REP)和肠菌基因间重复一致序列(enterobacterialrepetitiveintergenicconsensus,ERIC)的碱基顺序设计出的引物为引物,用PCR(polymerasechainreaction)技术分别扩增了8株快生型大豆根瘤菌(Sinorhizobium)的DNA,得出了具有菌株特 相似文献