不结球白菜L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶基因的克隆及光诱导表达

采用RT-PCR、巢式PCR、3'RACE和5'RACE技术,获得了不结球白菜L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶(GLDH)基因cDNA 2 034 bp全长序列.以苏州青为材料,进行光及黑暗对照处理,观察GLDH活性和L-抗坏血酸含量的日变化规律.结果表明:随着光照时数的增加,不结球白菜L-抗坏血酸水平和GLDH活性升高,而在持续黑暗条件下植株的L-抗坏血酸含量和GLDH活性没有发现这种日变化,表明GLDH活性可能受光诱导调控.     

镉在不结球白菜中的积累及外源脱落酸对镉积累的影响

采用溶液培养的方法,研究了镉(Cd)和脱落酸(ABA)对不结球白菜幼苗生长以及Cd积累的影响。结果表明,10μmol·L-1Cd处理显著抑制不结球白菜幼苗的干物质积累,降低不结球白菜叶片的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、PSⅡ最大光化学效率、PSⅡ光合电子传递量子效率、电子传递速率和光化学猝灭系数,增加不结球白菜叶片的非光化学猝灭系数。5μmol·L-1ABA处理对不结球白菜地上部干物质的积累及净光合速率没有显著影响,但降低了不结球白菜的根系干重、叶片的蒸腾速率和气孔导度。而在100μmol·L-1Cd胁迫下,外源ABA处理明显增加不结球白菜根系Cd含量,降低Cd向地上部的转运能力,降低不结球白菜地上部Cd含量。试验结果还显示:不结球白菜地上部Cd含量占总Cd含量的百分比与叶片蒸腾速率呈显著正相关。     

硝态氮对不结球白菜产量与主要营养品质及硝酸盐含量的影响

以对硝酸盐诱导较敏感的不结球白菜品种苏州青为材料,采用无土栽培法,研究营养液中不同浓度硝态氮(0、4、8、12、16、20 mmol·L-1)对植株产量、主要营养品质及硝酸盐含量的影响,为不结球白菜生产及施肥提供理论依据.结果表明:地上部产量随NO3--N的增加而增加,但是20 mmol·L-1时植株的生长量反而有所下降;可溶性糖含量与维生素C含量变化趋势相同,除0 mmol·L-1处理外,二者与供氮水平呈负相关;可溶性蛋白含量在16 mmol·L-1处理中达到最大,20 mmol·L-1处理中略有下降.处理后不同器官的硝酸盐浓度也有所不同,叶柄中的硝酸盐含量明显高于叶片和根系;硝酸还原酶活性在叶片中最高,且与硝酸盐含量无明显相关性.综合各项测定指标,硝态氮浓度为12 mmol·L-1时,不结球白菜产量高,硝酸盐含量低且可溶性糖、可溶性蛋白、维生素C含量也都处于较高水平.     

不同叶龄菠菜叶片抗坏血酸含量与其代谢相关酶活性的比较

以欧丽特菠菜叶片为试材,研究了菠菜叶片发育过程中3个时期叶片(幼叶、成熟叶、衰老叶)的抗坏血酸代谢变化及抗坏血酸含量与其相关酶活性的关系。结果表明:抗坏血酸(AsA)和氧化型抗坏血酸(DHA)含量的变化趋势与L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶(GalLDH)以及脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性的变化趋势基本一致,而与抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性变化呈此消彼长。同时单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)、谷胱甘肽还原酶(GR)和还原型谷胱甘肽(GSH)有助于AsA的再生。说明通过增加GalLDH和再生酶活性能提高菠菜叶片AsA的含量,并延缓其衰老。     

不结球白菜L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶基因(GLDH)cDNA片段克隆与RNAi表达载体构建

根据植物中hpRNA(hairpin RNA)原理,选择GLDH基因cDNA序列同源性较低区域设计1对携带双酶切位点的特异引物,以不结球白菜‘苏州青’叶片为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术克隆了GLDH基因片段。构建中间克隆载体,经过3次亚克隆将测序正确的GLDH基因片段分别以正向和反向两种形式插入到间隔基因YYT的两端,经鉴定已插入到植物表达载体中,成功地构建了干扰GLDH基因表达的RNAi植物双元表达载体pRNAi-GLDH,并将表达载体转化到农杆菌菌株LBA4404中,为深入研究GLDH基因功能提供有效的工具。     

黑穗醋栗果实生长发育过程中抗坏血酸含量 及相关酶活性的变化

【目的】 研究不同品种不同生长时期黑穗醋栗果实内抗坏血酸（AsA）含量及其合成代谢过程中相关酶活性的变化,以明确果实生长发育过程中AsA含量与代谢合成相关酶之间的关系,为全面揭示黑穗醋栗果实AsA积累规律提供理论依据。【方法】 以3个不同黑穗醋栗品种（‘亚德’‘布劳德’和‘黑丰’）为试材,测定果实在幼果期、膨大期、半转色期、转色期和成熟期时还原型抗坏血酸（AsA）、氧化型抗坏血酸（DHA）、还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量以及AsA合成与代谢相关酶活性。【结果】 不同品种黑穗醋栗果实大小、AsA含量以及AsA相关代谢物水平存在明显的多样性。其中‘亚德’单果重最大,为1.97 g。果实生长发育过程中,总抗坏血酸（T-AsA）和AsA含量在3个品种中变化趋势一致,均在幼果期含量最高,其中‘亚德’幼果期果实中AsA含量最高,为83.17 μmol·g ^-1 FW,随着果实的生长迅速下降,在成熟期降至21.28 μmol·g ^-1 FW;3个品种果实中GSH和T-GSH含量随着果实发育呈升高趋势,但不同品种升高时期或增加幅度不同;GSSG含量在不同品种间存在较大差异,成熟果中‘黑丰’含量最低,为0.008 μmol·g ^-1 FW,仅为‘亚德’的10.2%。AsA-GSH循环再生代谢中,脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）和单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性在果实膨大期达到最高,成熟期降至最低,其中‘布劳德’果实中DHAR和MDHAR活性略高于‘亚德’和‘黑丰’;谷胱甘肽还原酶（GR）活性在幼果期最高,‘亚德’幼果期果实中GR活性最高（0.06 μmol·min ^-1·g ^-1 FW）,之后随着果实的生长发育不断下降,抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性变化与之相似;L-半乳糖途径的关键酶L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶（GalLDH）活性随着果实生长发育的变化趋势与AsA含量变化相一致,且‘亚德’果实中GalLDH活性在幼果期和成熟期均高于其他两个品种。通过相关性分析发现,GalLDH与T-AsA、AsA、DHA、DHAR和MDHAR呈现极显著正相关关系,相关系数可达0.91以上,即果实中GalLDH活性越高,果实中AsA含量也越高;DHAR和MDHAR与T-AsA、AsA间也存在极显著正相关关系,而APX与T-GSH、GSH间相关性较强。【结论】 黑穗醋栗幼果期果实中AsA含量最高,且品种间差异显著;GalLDH、MDHAR和DHAR可能是黑穗醋栗果实中AsA合成代谢的关键酶,黑穗醋栗果实中AsA含量积累主要取决于GalLDH活性,说明合成途径起着更关键的作用,而AsA-GSH循环再生途径相关酶对AsA合成也有一定的贡献,黑穗醋栗高AsA含量的积累是由合成途径与循环途径共同作用的结果。     

不结球白菜抗坏血酸相关基因BcMDHAR2功能验证

[目的]本文旨在验证单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)多基因家族中MDHAR2基因的功能,以探索其对不结球白菜抗坏血酸(AsA)含量的影响。[方法]以不结球白菜‘苏州青’cDNA为模板,扩增BcMDHAR2基因的ORF全长,利用生物信息学分析其氨基酸序列;通过亚细胞定位研究BcMDHAR2在细胞中的表达位置,采用实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)检测非生物胁迫和激素处理下BcMDHAR2基因的表达量;通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)验证该基因对抗坏血酸含量的影响。[结果]BcMDHAR2基因包含1个1 308 bp的开放式阅读框(ORF),编码435个氨基酸。进化树分析表明,BcMDHAR2蛋白与芜菁的进化关系最近。亚细胞定位显示,BcMDHAR2定位于细胞核和细胞质、细胞膜上。RT-qPCR表明,低温、盐胁迫、重金属离子以及外源激素处理下,在一定时间内BcMDHAR2表达量上调,随后下调。该基因对光周期有一定的响应,随着光照时间变长,表达量上调,黑暗后,BcMDHAR2表达量下调。BcMDHAR2基因沉默后植株中AsA含量降低,AsA循环中相关基因的表达量发生了一定变化,而植株中SOD活性升高。[结论]BcMDHAR2表达量随外界条件变化而变化,响应不同的激素诱导和胁迫,在不结球白菜中该基因正调控AsA含量。     

氮素形态对菠菜体内抗坏血酸含量及其代谢的影响

    采用基质培养试验,研究营养液不同铵硝配比(0∶100,25∶75,50∶50,75∶25,100∶0)对菠菜叶片抗坏血酸含量及其代谢相关酶活性的影响.结果表明,菠菜植株鲜重和干重以铵硝比为25∶75处理最高,铵硝比超过50∶50时则显著下降.菠菜叶片抗坏血酸(AsA)、总抗坏血酸(AsA+DHA)含量随着铵硝比的提高逐渐增加.菠菜叶片L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶(GalLDH)活性在铵硝比小于50%时没有显著变化,进一步提高铵硝比则显著降低;铵硝比不影响抗坏血酸氧化酶(AAO)的活性.脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)和单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)的活性均随着供铵比例提高而逐渐提高,且与AsA含量的变化趋势相似.表明提高营养液中铵硝比增加菠菜叶片AsA含量,与其提高MDHAR、DHAR活性和加快AsA的再生循环有关,而与其对GalLDH和AAO酶活性的影响没有明显的相关.     

不结球白菜抗坏血酸合成基因BcGME的同源克隆及胁迫下的表达分析

[目的]本文旨在探究逆境下BcGME基因与抗坏血酸(As A)含量的关系,为培育高品质的不结球白菜品种奠定理论基础。[方法]以不结球白菜‘苏州青’为材料,同源克隆了BcGME基因的全长,应用生物信息学分析了其氨基酸序列,通过实时荧光定量PCR技术测定了BcGME基因在过氧化氢胁迫和水淹胁迫下的表达水平,利用高效液相色谱(HPLC)测定了相应的抗坏血酸含量。[结果]BcGME基因包含一个长度为1 137 bp的开放式阅读框(ORF),编码379个氨基酸。推测其蛋白理论相对分子质量为42.97×103,理论等电点p I值为5.84,分子式为C1907H2949N519O570S22,属于不稳定蛋白。总平均疏水指数为-0.440,属于亲水蛋白。亚细胞定位预测该蛋白分布在细胞质中。BcGME氨基酸序列与十字花科大部分植物的相似性为90%以上,不结球白菜BcGME与十字花科的大白菜、甘蓝型油菜、拟南芥相应蛋白的进化距离较近。过氧化氢胁迫下,As A含量在6 h达到峰值,同时BcGME基因的表达量也达到最高;水淹胁迫下,1 d时As A含量最高为12.99μg·g~(-1),随后As A含量急速下降,1 d时的BcGME基因表达量是0 d的1.5倍。[结论]过氧化氢胁迫和水淹胁迫下,不结球白菜植株中BcGME基因的表达量变化趋势与As A含量变化趋势一致,说明GME可能是不结球白菜抗坏血酸合成途径中的关键调控基因。     

低温对结球白菜抗氧化系统的影响

为了研究零上低温冷诱导和自然低温胁迫对结球白菜活性氧清除系统的影响,本试验以黔白5号、津青50和金黔小将等3个具有不同抽薹特性的结球白菜品种为材料,分别测定低温处理后叶片SOD、POD和CAT活性以及抗坏血酸和丙二醛含量。结果表明,低温下耐抽薹品种黔白5号叶片抗坏血酸含量以及SOD、POD、CAT活性值均高于其他2个品种,膜脂过氧化产物MDA含量则最低,表明其在低温胁迫下具有较强的活性氧清除能力,表现出更好的低温逆境适应性。     

2个不结球白菜品种硝酸盐累积差异的生理机制

采用0.5、2.0、5.0 mmol.L-1NO3-3个浓度和3.75 mmol.L-1NO3-与1.25 mmol.L-1NH4+混合浓度,对2个不结球白菜品种上海青(低硝酸盐累积品种)和亮白叶1号(高硝酸盐累积品种)进行水培试验,研究了供氮水平对硝酸还原酶活性(NRA)、硝酸盐含量和光合速率的影响。结果表明:不结球白菜硝酸盐含量存在品种和器官差异(P<0.05)。亮白叶1号硝酸盐含量高于上海青,不同器官硝酸盐含量从高到低依次是:叶柄、叶片、根系,硝酸盐含量随外界供NO3-浓度的增加而增加,部分供NH4+降低了硝酸盐含量;上海青NRA高于亮白叶1号(P<0.05),不同器官NRA从高到低依次是:叶片、根系、叶柄,叶片和根系的NRA随外界NO3-浓度的增加而升高,部分供NH4+降低了不结球白菜NRA;在全NO3-处理下上海青叶片光合速率显著高于亮白叶1号(P<0.05),提高NO3-浓度可在一定程度上促进光合速率,部分供NH4+使光合速率有所降低。总之,上海青比亮白叶1号具有更高的NRA和光合速率,使其具有更强的NO3-还原同化能力,从而减少了NO3-在体内的积累。     

苹果果实GalDH和GalLDH基因的表达与AsA的关系

 【目的】进一步探明苹果果实是否具有抗坏血酸（AsA）合成的能力。【方法】从‘嘎拉’苹果果实中克隆AsA合成关键酶L-半乳糖脱氢酶（L-galactose dehydrogenase, GalDH）全长cDNA序列,检测它与另一合成酶L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶（L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase, GalLDH）在苹果不同组织中的表达及酶活性与AsA含量的关系。【结果】克隆获得的苹果GalDH cDNA含有975 bp的完整开放阅读框,编码一条分子量为34.97kD、含324个氨基酸残基的蛋白质,登录号为GQ131419。在叶片和苹果果实不同组织中,均能检测到GalDH和GalLDH基因mRNA表达和活性,叶片高于果实,幼果高于成熟果,果皮高于果肉。同时,苹果果皮中的AsA含量受光的调控,二者在阳面果皮的表达和活性明显高于阴面果皮,而阳、阴面果肉间无明显差异。不同组织中的AsA含量与GalDH和GalLDH活性均呈显著正相关性。【结论】进一步证明了苹果果实自身具有经L-半乳糖途径合成AsA的能力,且合成可能是苹果果实AsA形成的主要决定因子。     

氨基酸和尿素替代硝态氮对水培不结球白菜和生菜硝酸盐含量的影响

 研究了甘氨酸、异亮氨酸和脯氨酸的不同组合及尿素替代 2 0 %硝态氮对水培不结球白菜和生菜硝酸盐含量和品质的影响。结果表明 ,在采收前 12d替代处理 ,与对照相比 ,以甘氨酸对不结球白菜和生菜硝酸盐含量降低效果最好 ,甘氨酸、异亮氨酸和脯氨酸三者混合氨基酸其次 ,尿素次之 ;同时氨基酸处理也提高了两种蔬菜叶片可溶性糖和蛋白质含量 ,并显著增加了叶片全氮量。氨基酸替代硝态氮后 ,增强了不结球白菜叶片硝酸还原酶活性 ,但削弱生菜叶片硝酸还原酶活性。氨基酸和尿素都降低了不结球白菜和生菜体内硝酸盐含量 ,而且对不结球白菜 ,氨基酸与尿素效果相近 ,但对生菜氨基酸比尿素更有效。氨基酸部分替代硝态氮不但可以显著降低两种蔬菜体内硝酸盐含量 ,而且可以改善品质     

不结球白菜霜霉病菌株生物学特性及致病力

为了研究不结球白菜霜霉病菌菌株生物学特征及致病力,以10份不结球白菜霜霉病病变叶为材料,收集、提取、培养并保存霜霉病菌菌株,测定菌株生物学特性,并调查其病情指数,为不结球白菜霜霉病深入研究和防治提供理论依据。结果表明,6~25℃范围内孢子囊均有萌发,18℃萌发率达到最大值; 在相对湿度98%~100%范围内均可萌发,在相对湿度100%条件下萌发率达到最大值,在48 h萌发率达到最大。南京地区霜霉病菌孢子囊相对较大,而天津地区霜霉病菌孢子囊相对较小。不结球白菜品种‘042-S2-1’病情指数为4.80,为高抗;品种‘084-S2-6’病情指数为68.15,为感病。而Cc-nj2的侵染能力最强,Cc-nj3的侵染能力最弱。综合分析,不结球白菜品种‘042-S2-1’和‘027-S2-1’为抗病材料,‘084-S2-6’为感病材料。本研究探讨不结球白菜霜霉病菌菌株生物学特性及致病力,以期进一步为霜霉病的防治研究提供理论基础。     

外源氨基酸对不结球白菜和生菜品质的影响

收获前叶面喷施氨基酸对不结球白菜和生菜的生长及品质的研究结果表明,不结球白菜的生长基本不受氨基酸的影响;而生菜对氨基酸反应敏感,混合氨基酸(甘氨酸、异亮氨酸、脯氨酸)明显促进生菜的生长.叶面喷施氨基酸明显增加2种蔬菜叶片及叶柄硝酸盐含量;外源氨基酸降低2种蔬菜叶片硝酸还原酶活性,提高叶片全氮含量.不结球白菜叶片可溶性蛋白质含量各处理之间差异不大,叶片游离氨基酸含量增加,达65.82%～84.81%,可溶性糖含量明显减少;生菜叶片可溶性蛋白质和氨基酸含量显著减少,可溶性糖含量明显提高.     

外源氨基酸对不结球白菜和生菜品质的影响

收获前叶面喷施氨基酸对不结球白菜和生菜的生长及品质的研究结果表明,不结球白菜的生长基本不受氨基酸的影响;而生菜对氨基酸反应敏感,混合氨基酸(甘氨酸、异亮氨酸、脯氨酸)明显促进生菜的生长。叶面喷施氨基酸明显增加2种蔬菜叶片及叶柄硝酸盐含量;外源氨基酸降低2种蔬菜叶片硝酸还原酶活性,提高叶片全氮含量。不结球白菜叶片可溶性蛋白质含量各处理之间差异不大,叶片游离氨基酸含量增加,达65．82％-84．8l％,可溶性糖含量明显减少;生菜叶片可溶性蛋白质和氨基酸含量显著减少,可溶性糖含量明显提高。     

土壤水分对不结球白菜膳食纤维含量及理化特性的影响

以不结球白菜为材料,研究了不同水分条件对其膳食纤维含量及理化特性的影响.结果表明:在水分过少(干旱)或过多(水涝)条件下,不结球白菜膳食纤维含量均低于对照;可溶性蛋白含量呈现先升后降的趋势;脯氨酸含量随处理时间延长而增加,且与胁迫程度呈正相关;保护酶SOD、CAT活性基本呈现先升后降的变化趋势,但变化规律有所不同;POD活性基本呈现上升趋势.     

苹果叶片离体衰老过程中抗坏血酸代谢的变化

以苹果(M a lus d om estica Borkh)品种嘎拉(G a la)秋梢成熟叶片为试材,在水培养条件下,研究了离体苹果叶片衰老过程(0,6,12,18,30,48和72 h)中抗坏血酸-谷胱甘肽(A SA-G SH)循环及A SA合成关键酶L-半乳糖-γ-内酯脱氢酶(G a lLDH)的变化。结果表明,在整个衰老过程中,伴随H2O2含量、质膜相对透性和M DA含量升高,离体苹果叶片中单脱氢抗坏血酸还原酶(M DHAR)活性下降,抗坏血酸过氧化物酶(APX)和脱氢抗坏血酸还原酶(DAHR)活性分别在18和30 h达到最高值,而后开始下降。G a lLDH对苹果叶片离体衰老反应迅速,在6 h活性达到最高,而后开始迅速下降。A SA/DHA,总A SA和总G SH含量随离体培养时间的延续均先上升而后下降,而G SH/G SSG比值在叶片离体衰老过程中一直下降。说明在苹果叶片离体衰老过程中,抗氧化剂A SA代谢主要是通过提高DHAR活性来维持其高水平,抵制衰老。     

秋季不结球白菜硝酸盐积累的基因型差异

研究40个不同基因型不结球白菜品种叶片、叶柄内硝酸盐含量,发现不同基因型不结球白菜之间和同一基因型不结球白菜的不同部位之间的硝酸盐含量均有明显差异。31、40号品种为低硝酸盐含量基因型不结球白菜,而12、19号品种为高硝酸盐含量基因型不结球白菜。同一基因型品种一般叶柄中硝酸盐含量显著高于叶片中硝酸盐含量,同时叶色较淡的品种硝酸盐含量相对较低,研究结果可作为低硝酸盐品种选育的表观指标。     

不结球白菜SRAP标记体系的建立与作图亲本筛选

SRAP标记是遗传作图和分子辅助育种的重要技术之一,为了建立具有通用性的不结球白菜SRAP标记体系,选用国家种质资源重点实验室的不结球白菜作为试材,利用正交设计方法对、模板DNA、引物、Taq酶和缓冲液6个因素进行了优化,获得了不结球白菜SRAP标记反应体系的最佳组合:10 μL反应体积中包含40 ng的DNA模板、75 ng引物、0.2 mmol·L-1的的、0.15 U的Taq酶和1倍体积的缓冲液.筛选不结球白菜的作图杂交亲本是构建遗传连锁图谱的基础,以12份不结球白菜亲本为试材,利用70对SRAP引物组合共扩增出了382条多态性带,平均每个引物组合扩增出5.46条,由聚类分析图确定了杂交亲本为相似系数最小的2个组合,Q06-2和Q06--4或Q06-2和Q06-6,同时验证了SRAP标记体系的通用性.