家蚕多梳蛋白家族基因BmPsc的全长序列克隆及表达分析

多梳蛋白(polycomb group,PcG)基因Bmi-1(B cell-specific MLV integration site-1)与人类造血干细胞以及多种肿瘤干细胞的维护相关,Bmi-1蛋白具有典型的N端Ring结构,通过结合核小体并抑制其重塑以实现抑制关键基因转录,具有沉默目的基因的功能。Bmi-1在昆虫中的同源基因为Psc(posterior sex combs)。采用RACE技术获得家蚕Psc基因(BmPsc)全长4 084 bp的序列。该基因位于家蚕第4号染色体上,是一个单外显子基因,ORF为3 291 bp,编码1 096个氨基酸,蛋白质分子质量121 kD,等电点(pI)为9.83;同源序列比对发现BmPsc与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的Psc基因序列有58%的相似度,与果蝇(Drosophila melanogaster)的Psc基因序列仅有34%的相似度;氨基酸序列分析显示BmPsc具有保守的N端Ring结构。利用qRT-PCR检测家蚕5龄第3天幼虫各组织以及5龄各时期幼虫血液中BmPsc基因的表达水平,发现BmPsc在各组织均有表达,在精巢以及卵巢中的表达明显较高,其次是翅原基(含造血器官),在循环血液中也有较高表达;在5龄各时期幼虫血液中的表达呈一定规律性,于蜕皮后的5龄第2天以及进入变态前的5龄第6天出现表达峰值,而在5龄中期(第4～5天)为表达低谷。研究结果为进一步阐释该基因在细胞水平以及个体水平对干细胞分化的抑制作用奠定了基础。     

家蚕RYBP基因的结构与表达模式分析及转基因干涉系统的建立

多梳蛋白(polycomb group,PcG)是一类对生物有机体生长发育很重要的转录抑制因子,参与有机体的发育调控。Ring和YY1结合蛋白(Ring and YY1 binding protein,RYBP)是在小鼠(Mus musculus)和果蝇(Drosophila melanogaster)中推断的PcG蛋白成员。基于生物信息学分析方法,设计引物克隆了家蚕的RYBP基因(BmRYBP);序列结构分析显示该基因有一个420 bp的完整ORF,由3个外显子和2个内含子组成,编码139个氨基酸,预测其蛋白质分子质量为15.4 kD,等电点为10.36,N端的20～44 aa有一个与蛋白间相互作用有关的锌指结构域(ZnF-RBZ);半定量RT-PCR分析显示,该基因在家蚕5龄3 d幼虫生殖腺中高水平转录;基于GAL4/UAS双元系统,构建了具有BmRYBP序列反向重复结构的转基因干涉表达载体,通过显微注射家蚕早期胚胎,获得了UAS系统的转基因家蚕后代,为研究BmRYBP在家蚕生长发育过程中行使的功能奠定了基础。     

家蚕淀粉酶基因(Bmamy2)的分子克隆及表达特征和序列分析

淀粉酶在生物体内的碳水化合物代谢中起重要作用。根据预测的基因序列设计引物,克隆了一个家蚕淀粉酶基因(Bmamy2),获得完整的编码区序列(全长1 752 bp,编码583个aa)。用推导的氨基酸序列与其它物种的淀粉酶基因作相似性比较和系统发育分析,发现所克隆的Bmamy2基因是一个起源很早的拷贝,在细菌、果蝇、非洲蟾蜍、人和鸡等多种生物中存在与之同源的基因。该基因编码蛋白的功能结构域预测有2个起催化作用的关键氨基酸发生突变,推测该基因可能失去了催化水解碳水化合物的功能。RT-PCR和基因芯片检测结果表明,该基因在家蚕5龄第3天幼虫的中肠和脂肪体中表达,且在中肠中的表达丰度较高。     

家蚕钙网蛋白的基因结构与初步表达谱研究

钙网蛋白(calreticulin,CRT)是内质网/肌浆网主要的Ca2+结合蛋白,在细胞功能的调节方面发挥重要作用。利用双向电泳技术及质谱技术研究家蚕脂肪体蛋白组的变化,通过分析检索蛋白质组数据,获得了钙结合蛋白的氨基酸序列。通过电子克隆、cDNA3′末端快速扩增(3′rapid amplification of cDNA ends,3′RACE)方法克隆了家蚕钙网蛋白基因cDNA全长序列,命名为BmCRT(GenBank登录号:FJ360528)。BmCRT基因cDNA全长1 705 bp,开放阅读框序列(ORF)长1 197 bp,编码398个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BmCRT与其它物种的CRT都具有保守的N-结构域、脯氨酸富集结构域和C-端结构域。BmCRT基因组结构分析表明:该基因由7个外显子和6个内含子组成。分析BmCRTmRNA在不同发育时期的表达变化显示,该基因在家蚕幼虫眠期的mRNA表达量比食桑期高,而在4龄和5龄食桑期mRNA表达量没有随着生长变化而变化。     

家蚕葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶家族基因BmGMCβ2的克隆及序列与表达分析

葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶(glucose-methanol-choline oxidoreductases,GMC)家族是昆虫体内一大类以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的氧化还原酶类,家蚕基因组中含有43个GMC家族基因。以家蚕5龄幼虫cDNA为模板克隆到一个家蚕GMC家族基因,命名为BmGMCβ2(GenBank登录号:JQ965926)。该基因cDNA全长1 875 bp,编码624个氨基酸,预测蛋白质分子质量为69.3 kD,pI为6.21,定位于家蚕16号染色体的nscaf3058上,编码蛋白质含GMC家族共有的ADP-bindingβ-α-β折叠结构域。系统发育分析表明该基因是家蚕GMC家族β亚家族基因成员。RT-PCR检测家蚕不同发育时期和5龄第3天幼虫不同组织中BmGMCβ2基因mRNA转录水平,以5龄盛食期最高,并且主要在表皮、脂肪体和气管中转录表达;Westernblotting分析BmGMCβ2蛋白主要在5龄第3天幼虫的脂肪体中表达。将BmGMCβ2克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,转化E.coli BL21表达菌株,IPTG诱导表达BmGMCβ2融合蛋白,通过His-亲和层析得到纯化的融合蛋白并制备多克隆抗体,为后续研究该蛋白在家蚕生长发育过程中的功能奠定了基础。     

家蚕c-Myc基因的全长cDNA克隆及促细胞增殖功能初探

c-Myc是Myc原癌基因家族的重要成员,广泛参与细胞增殖、分化、凋亡等正常生命活动的调节,其异常活化可引发多种肿瘤的发生与发展。基于生物信息学分析和RACE技术,自家蚕5龄幼虫卵巢中克隆了与果蝇d Myc同源的原癌基因Bmc Myc。Bmc Myc基因的c DNA全长1 984 bp,由1 026 bp的完整ORF序列、421 bp的5'-UTR和537 bp的3'-UTR组成,编码蛋白质含341个氨基酸残基,其C末端含有一个Myc家族共有的b HLH保守结构域。Bmc Myc在家蚕各发育时期及5龄第3天幼虫的主要组织中均有表达,不同发育时期以幼虫期和蛹早期的表达水平相对较高。Bmc Myc基因的产物定位于细胞核内,是一种核蛋白因子。在Bm E细胞中表达Bmc Myc出现明显的细胞增殖现象,其下游靶标基因CDK4和ODC的表达亦因之上调,初步证实Bmc Myc基因具有促进细胞增殖的生物学功能。上述结果为进一步阐释Bmc Myc的功能并探索利用其创制蚕丝增产遗传素材提供了理论参考。     

家蚕27、28号染色体基因的生物信息学分析

利用家蚕基因组精细图分析第27、28号染色体上的基因结构及其编码蛋白的功能结构域,可为在家蚕资源库中鉴定这两条染色体上的突变基因以及发现新的形态标记提供重要线索。基因预测及结构分析显示:家蚕第27和28号染色体是基因数目最少的两条染色体,预测基因数目分别是241个和288个,平均每个基因分别具有7.7和5.3个外显子;蛋白质全长编码区序列(CDS)长度主要分布于400-800 bp之间;CDS的GC含量分别是49.72%和46.54%。蛋白质功能结构域分析发现,家蚕第27、28号染色体上基因所编码的蛋白分别具有76和92种结构域,其中最多的3种结构域分别为Sugar_tr、MFS_1、zf-C2H2和UDPGT、DUF、Serpin。将家蚕第27、28号染色体上的预测基因与果蝇突变基因进行同源检索的结果显示,家蚕第27、28号染色体上分别有16和15个基因具有明显的可能突变表型。     

家蚕Mod基因的序列分析及表达与亚细胞定位研究

已知多数含BTB/POZ结构域的锌指蛋白对生物体的发育、分化及染色体重组等具有重要的调节作用。从已构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条编码MOD(mdg4)蛋白的基因序列(GenBank登录号:DN237077)。该基因序列的ORF长1 080 bp,编码359个氨基酸残基,蛋白含有BTB保守结构域和FLYWCH保守结构域,与黑腹果蝇、冈比亚按蚊、赤拟谷盗和埃及伊蚊的MOD多序列比对,其同源性不超过40%。表达、纯化带有His标签的家蚕MOD蛋白(BmMOD),并用纯化的融合蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体。实时荧光定量PCR显示BmMod基因mRNA转录水平在家蚕蛾期及5龄幼虫的卵巢最高,推测BmMod基因在家蚕生殖腺发育过程中产生一定作用。利用纯化的BmMOD蛋白多克隆抗体进行Western blotting分析也表明该蛋白在家蚕蛾期及5龄幼虫卵巢中的表达量最高,验证了BmMod在家蚕生殖腺发育中的功能。亚细胞定位结果显示BmMOD蛋白几乎完全定位于家蚕卵巢上皮细胞(BmN)的细胞核中。     

家蚕转录因子AP-4基因cDNA的分子克隆与生物信息学分析

AP-4(activator protein 4)是一种转录因子,在生物的生长发育中有重要作用。根据家蚕表达序列标签(EST)并利用cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆了家蚕AP-4(Bombyx mori activator protein4)基因,结合生物信息学方法对所获的序列进行开放阅读框、序列同源性分析,预测了AP-4蛋白的理化性质。获得的家蚕AP-4基因cDNA的全长为1621bp,其开放阅读框为996bp,编码331个氨基酸,基因由3个外显子和2个内含子组成。同源性比对表明该基因推导的氨基酸序列与棉铃虫AP-4和谷蛀虫AP-4推测的蛋白同源性分别为76%和54%,第45-99位氨基酸序列是一个典型的保守结构域。实时定量RT-PCR显示该基因在所检测家蚕的各发育时期中,除幼虫1龄和蛹期第4天无表达外,其它时期均有表达,其中幼虫3龄和4龄期的表达量较高。     

家蚕vasa基因的结构及表达型研究

vasa是决定生殖系发育的重要调控蛋白因子之一,具有广泛的保守性。利用家蚕基因组和EST库的数据资源,分析了家蚕vasa基因的结构,并与已有报道的18个物种的VASA蛋白质的结构域序列进行了比对分析,同时对家蚕vasa基因在家蚕胚胎发育11个时期的表达型及幼虫期8个不同组织的表达特异性进行了验证。结果表明,家蚕vasa基因包含有13个外显子,比果蝇vasa基因的外显子数量(7个)增加了6个,在第3内含子有1个转座子插入;家蚕vasa基因在未受精卵和胚胎发育的各个时期均有表达,但只在幼虫生殖腺中有表达。将家蚕vasa基因的一条cDNA片段用地高辛标记作为探针,对家蚕幼虫的生殖腺及胚胎进行全胚原位杂交,结果进一步表明家蚕vasa基因在幼虫期只在精原细胞、精囊、卵巢管等生殖系相关的细胞和组织中表达,在发育5d胚胎的生殖腺部位也有明显表达。     

转录抑制因子RYBP的研究进展

Pc G蛋白(polycomb group proteins)是多细胞有机体中一类重要的表观遗传抑制因子,其功能是维持细胞分化和个体生长发育过程中基因的正确表达。转录抑制因子RYBP(Ring1 and YY1 binding protein)是Pc G蛋白家族成员,可以与Ring1A、YY1和M33等其他Pc G蛋白家族成员相互作用,通过形成蛋白质复合体的形式行使功能。本文简述RYBP基因在小鼠(Mus musculus)和果蝇(Drosophila melanogaster)等模式生物中的表达特征,综述RYBP在基因转录调控、干细胞分化、细胞凋亡和恶性肿瘤发生中的作用及其转录抑制机制,以期较为详细了解RYBP的研究进展,为鳞翅目昆虫家蚕(Bombyx mori)RYBP的研究提供借鉴。     

家蚕Atlastin基因(BmATL)的鉴定及表达模式

Atlastin基因是人类遗传性痉挛性截瘫(hereditary spastic paraplegia,HSP)疾病的致病基因之一。Atlastin蛋白具有典型的GTP结合(GBP)结构域和2个相邻的跨膜结构,被定位在高尔基体和内质网膜上,具有运输小囊泡的功能。用人类和果蝇的Atlastin基因序列对家蚕基因组数据库进行同源搜索,鉴定得到4个同源基因,命名为BmATL1-BmATL4。生物信息学分析显示这4个基因编码的蛋白质都有GBP结构域,其中:BmATL1和BmATL2的分子质量约60 kD,有2个相邻的跨膜结构;BmATL3和BmATL4的分子质量约85 kD,没有跨膜结构。表达谱分析表明BmATL1和BmATL2在家蚕5龄第3天幼虫各组织都有低量表达,BmATL3和BmATL4在血细胞中特异高量表达。综合分析提示:BmATL1与人类和果蝇Atlastin的分子质量、结构域和表达谱特征相似。     

家蚕伴性赤蚁基因(sch)连锁的RAPD标记及相关分析

家蚕伴性赤蚁基因(sch)温敏性的发现为雄蚕品种选育研究开辟了新的途径。为获得sch基因的DNA序列,采用RAPD技术,对sch的近等位基因系进行随机扩增,得到一条能稳定扩增、与sch基因连锁的特异片段,并对该序列进行了克隆、测序与分析。结果表明,该序列是家蚕固醇载体蛋白-x(sterol carrier protein x,SCPx)基因的一部分,根据测序结果命名为OPD02-759。设计特异引物进行PCR扩增和测序,获得了sch蚕SCPx基因的酮酯酰CoA硫解酶结构域(3-ketoacyl-CoA thiolase)的完整序列。序列长1107 bp,编码369 aa,分子量为39.3 kD,与正常家蚕该结构域有15个核苷酸的差异,翻译后有5个氨基酸的差异,且其中2个发生在保守区域,此突变正好是RAPD扩增时出现特异带的随机引物结合位点。     

家蚕Met1基因的表达与组织定位分析

选择家蚕基因组中与果蝇Dm Met(Methoprene tolerant protein)同源的基因Bm Met1进行研究。预测Dm Met和Bm Met1的结构域均是一个b HLH-PAS(basic helix-loop-helix Per-ARNT-SIM)型转录因子,具有典型的DNA结合结构域。在原核系统表达获得了Bm Met1蛋白并制备了抗体。qRT-PCR和Western blotting检测结果显示,无论是Bm Met1基因mRNA的转录还是Bm Met1蛋白的表达,在家蚕5龄中后期和吐丝期的翅原基组织中都呈现较高水平,而在蛹期呈现较低的水平。通过免疫组织化学方法分析Bm Met1的组织定位,结果显示该蛋白质在5龄第6天和吐丝期家蚕胸节表皮、脂肪体及翅原基等组织中都有较高水平的表达,在蛹期上述部位和组织的表达水平较低。分别将蜕皮激素(20E)和保幼激素类似物(Methoprene)按照2μg/头的剂量注射到5龄第3天幼虫第2~3胸节间,qRT-PCR检测幼虫翅原基组织中的Bm Met1受到Methoprene的诱导上调表达,且在处理2 h后表达水平最高。上述结果暗示Bm Met1可能参与了保幼激素对家蚕翅原基生长分化的调控。     

家蚕类胰凝乳蛋白酶基因的发掘与表达特征分析

类胰凝乳蛋白酶(CTLP)是鳞翅目昆虫幼虫中肠中的主要蛋白酶。基于构建的家蚕中肠等组织差异表达基因的SSH文库,发掘和克隆了一条新的家蚕类胰凝乳蛋白酶基因Ctlp(GenBank登录号:JQ081296)。该基因定位于18号染色体nscaf2901,靠近端粒,有5个外显子和4个内含子,全长cDNA序列976 bp,ORF为840 bp,编码279个氨基酸残基,信号肽序列1～18 aa(分值0.985),1～20 aa和50～100 aa区域为2个由内到外的跨膜螺旋,推测蛋白质相对分子质量为29 780.10,pI为8.75,蛋白质功能域(保守区)和分子进化分析显示其为丝氨酸蛋白酶家族的类胰凝乳蛋白酶。家蚕Ctlp基因具有在5龄幼虫中肠特异性高表达和伴随进食量增加而上调表达的特征,同时也具有性别差异性和熟蚕期特异性上调表达的现象,暗示CTLP可能具有促进消化以外的功能。构建pET32a-ctlp重组表达载体,SDS-PAGE分析和Western blot鉴定结果显示,重组蛋白在原核表达系统中的表达量较低。     

家蚕幼虫性腺表达序列标签分析(英文)

分别以5龄幼虫的精巢和卵巢构建了2个家蚕cDNA文库.利用表达序列标签方法分析参与家蚕性腺发育的基因,通过测序获得 16 737条ESTs(精巢 8 407条,卵巢 8 330条),拼接这些ESTs共得到 2 107个重叠群(contig)和 3 532个单拷贝(singlet).将这些转录物与GenBank非冗余蛋白质库比较,结果显示约34.3%的基因与数据库中蛋白质具有相似性.功能注释表明蛋白质合成相关基因、精巢特异基因等在文库中大量存在.基因本体(gene ontology)功能分类显示精巢与卵巢基因表达谱差异较大.研究结果为理解家蚕性腺发育提供了信息.     

家蚕C-型凝集素11基因BmCTL11的克隆及表达分析

昆虫的C-型凝集素参与先天免疫系统中细胞间的相互作用,家蚕C-型凝集素11(C-type lectins,CTL11)基因BmCTL11是经家蚕微孢子虫(Nb)感染诱导后在蚕体内持续高量表达的基因。用生物信息学方法分析BmCTL11基因编码有307个氨基酸的多肽,预测分子质量34.51 kD,等电点4.69,含2个串联的典型C-型凝集素糖识别结构域,与烟草天蛾的IML-1蛋白进化距离最近。RT-PCR检测BmCTL11基因在家蚕幼虫时期的转录水平较高,并在多个组织有转录。将灭活的家蚕病原细菌、真菌、微孢子虫、病毒等注射家蚕5龄幼虫后的24 h内,qRT-PCR检测BmCTL11基因在幼虫脂肪体和中肠组织内的转录水平均发生上调,说明该基因能够被多种病原微生物诱导。以家蚕5龄第3天幼虫脂肪体c DNA为模板克隆了BmCTL11基因,连接到p ET-32a载体,诱导表达后将纯化的融合蛋白免疫昆明鼠制备出效价为1∶102 400的BmCTL11多克隆抗体。Western blot分析结果显示,BmCTL11蛋白可能以二聚体形式主要分布于家蚕脂肪体、血浆、中肠、表皮等组织中,推测BmCTL11在家蚕识别病原微生物并介导引发进一步的先天免疫反应过程中有重要的作用。     

家蚕C型凝集素16基因(BmCTL 16)的电子克隆及序列特征和表达谱

C型凝集素是在动物先天免疫中发挥重要作用的模式识别受体。从家蚕杂交一代超亲表达的基因中筛选出一个C型凝集素16基因(Bm CTL 16),通过电子克隆、序列拼接获得了总长度为1 105 bp的序列,其5'端和3'端分别为63 bp、385 bp,预测ORF为657 bp,在3'端终止密码子下游314 bp位置为加尾信号胞质多聚腺苷化特异因子(CPSF)结合位点。预测Bm CTL16编码218个氨基酸,组成蛋白质的氨基酸有20种,数量最多的是亮氨酸(有19个),蛋白质理论等电点(p I)6.65,分子质量25.124 4 k D。Scan Prosite结构域预测Bm CTL 16存在与其它鳞翅目昆虫CTL一样保守的糖蛋白识别位点CRD。系统进化分析表明Bm CTL 16与烟芽夜蛾、小菜蛾、刺舌蝇、埃及伊蚊的同源CTL序列相似度均高达99%。对电子拼接序列进行RT-PCR验证,扩增片段的测序结果与电子克隆的Bm CTL 16序列完全一致。qRT-PCR分析Bm CTL 16在5龄第1~2天幼虫中肠组织中的表达量较高,之后呈现下降趋势,推测可能是家蚕5龄初期旺盛的生命活动提高了蚕体免疫功能。     

柳蚕丝素重链基因(Fib-H)cDNA 5′端片段的克隆与表达分析

柳蚕(Actias selene Hübner)是鳞翅目大蚕蛾科的一种珍稀野生绢丝昆虫。利用RT-PCR方法克隆了柳蚕丝素重链基因(Fib-H)cDNA 5′端的一个片段,该片段序列长819 bp,编码273个氨基酸,含有4个保守多聚丙氨酸结构域。序列比对分析表明,该片段序列与樟蚕(Saturnia japonica)、天蚕(Antheraea yamamai)、柞蚕(Antheraea pernyi)、印度柞蚕(Antheraea mylit-ta)和家蚕(Bombyxmori)的Fib-H基因cDNA 5′端同源序列的相似性分别为72.5%、65.8%、65.1%、65.1%、47.1%。半定量PCR分析显示柳蚕Fib-H基因cDNA 5′端片段序列在5龄幼虫第1-12天的表达量呈现逐渐上升的趋势。