苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒囊膜蛋白GP64与寄主细胞互作蛋白的初步鉴定

鉴定杆状病毒与宿主昆虫细胞间的互作蛋白,对于进一步研究病毒受体的特性与功能,理解病毒与宿主细胞的相互作用关系具有重要意义。为了阐明苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Ac MNPV)出芽型病毒粒子(BV)囊膜蛋白GP64是否与宿主细胞表面蛋白存在互作,利用蛋白酶K消化处理Tn细胞系的细胞膜蛋白,结果表明BV不能感染经300μg/m L蛋白酶K消化处理的Tn细胞,免疫荧光检测BV病毒粒子不能吸附于Tn细胞膜上。利用病毒覆盖蛋白印迹实验(VOPBA)及质谱初步鉴定的结果显示,Tn细胞膜上的翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)是与BV囊膜蛋白GP64互作的候选蛋白。     

PRRSV GP5蛋白和CSFV E2蛋白在杆状病毒囊膜表面的共展示及展示蛋白的免疫原性分析

本试验旨在构建以杆状病毒表面展示系统为基础的猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟双价基因工程亚单位疫苗候选株.利用杆状病毒表面展示技术构建展示猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白和猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的重组杆状病毒BacSC-Dual-ORF5-E2.该重组病毒带有His6标签,且胞质区域(CTD)和跨膜区域(TM)均来源于杆状病毒囊膜蛋白gp64的CTD和TM.对重组病毒进行western blot分析、激光共聚焦显微镜观察、免疫金电子显微镜检测、动物免疫试验以及淋巴细胞增殖试验.Western blot分析结果表明,重组杆状病毒中表达了重组GP5和E2蛋白;激光共聚焦显微镜检测表明,重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf-9后在细胞膜上展示了重组GP5和E2蛋白;免疫金电子显微镜观察表明,重组GP5和E2蛋白展示在杆状病毒囊膜上;动物免疫试验表明,重组杆状病毒免疫小鼠后产生了抗PRRSV和抗CSFV的特异性抗体;淋巴细胞增殖试验表明,重组杆状病毒能诱发较强的细胞免疫应答.本试验成功构建表面展示PRRSV GP5蛋白和CSFV E2蛋白的重组杆状病毒,为下一步应用该重组杆状病毒作为双价亚单位疫苗预防PRRSV和CSFV的混合感染奠定基础.     

杆状病毒GP64表面展示元件与L-天冬酰胺酶Ⅱ融合表达的初步试验

GP64是Ⅰ型杆状病毒的主要囊膜糖蛋白,利用基因重组技术在gp64中插入外源蛋白基因,二者在病毒表面融合表达活性肽或蛋白质,可以免去纯化表达产物的繁琐。L-天冬酰胺酶Ⅱ(ASP)是一种临床上广泛使用的蛋白类抗肿瘤药物,利用家蚕杆状病毒(BmNPV)GP64展示系统表面展示ASP,探讨以表面展示有ASP蛋白的出芽型病毒粒子(BV)生产抗肿瘤药物的可行性。构建重组转移载体pFast Bacdual-gp64sp-asp-gp64ctd,并转化E.coli DH10BacTM,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒DNA,将重组杆粒DNA通过脂质体转染至Bm N细胞,获得了重组病毒。重组病毒大量感染Bm N细胞后72 h,收集感染病毒的细胞培养液超速离心纯化BV。采用奈氏试剂法检测接种重组病毒的Bm N细胞内表达融合ASP的酶活力为1 788.4U/mg;Western blot检测纯化后的BV中含融合ASP蛋白,然而BV中的ASP检测不出酶活性。试验结果提示,构建的杆状病毒GP64展示系统可以将ASP转到BV上,但产物的活性保持有待进一步研究。     

犬瘟热病毒囊膜糖蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达及鉴定

为表达具有天然构象的犬瘟热病毒(CDV)囊膜糖蛋白融合蛋白(F)和血凝素蛋白(H),本研究扩增小熊猫源CDV驯化致弱株LP的F、H基因,克隆至pFastBacTM1载体中,测序验证后转化至DH10BacTM感受态细胞,同源重组获得穿梭质粒rBacmid-F、rBacmid-H,将其分别转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rpFB-F、rpFB-H,并将表达的重组融合蛋白(rF)和血凝素蛋白(rH)进行IFA和Western blot鉴定。以犬抗CDV高免血清对重组杆状病毒感染细胞进行IFA鉴定,在感染细胞的细胞膜上可见特异性荧光反应;以鼠抗F、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体对重组杆状病毒感染细胞进行Western blot检测,可见相对分子质量为63和68ku左右的条带,分别为重组融合蛋白(rF)和血凝素蛋白(rH),大小与预期相符。两种囊膜糖蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中均成功表达,且具有良好的反应原性。本研究为CDV病毒样颗粒疫苗的开发等工作奠定了基础。     

杆状病毒宿主域的研究进展

杆状病毒是已知昆虫病毒中的最大类群,是发现最早、研究最多且实用意义很大的昆虫病毒。它是一类有囊膜的单分子双链闭合环状D NA大形病毒,其基因组大小为88￣160Kb,宿主域仅限于无脊椎动物。虽然近年从蛛形纲与甲壳纲中亦分离出了少数几种杆状病毒,但绝大多数杆状病毒是感染昆虫的,迄今已报道有600种以上的昆虫被杆状病毒所感染,包括鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目与毛翅目等7个目。自然界中杆状病毒具有高度的宿主特异性,一种病毒往往只能感染亲缘性较近的少数几种昆虫,并引起大面积流行。本文就杆状病毒宿主域方面的内容作一简述。1昆…     

鹅副黏病毒BZ02株F HN基因的克隆及分子特性分析

鹅副黏病毒(GMPV)属禽Ⅰ型副黏病毒,基因组为单股负链RNA,编码F、HN、M、NP、P、L等6种结构蛋白和2种非结构蛋白[1].其中F蛋白是介导病毒脂蛋白囊膜与宿主细胞表面包膜融合的主要因子,同时也是决定病毒毒力的主要决定因素.     

杆状病毒囊膜蛋白介导病毒侵染宿主细胞中的作用

<正>杆状病毒(Baculovirus)是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒,在分类学上属于杆状病毒科(Baculoviridae),其宿主主要包括鳞翅目(Lepidoptera)、膜翅目(Hymenoptera)和双翅目(Diptera)昆虫。基于杆状病毒全基因组序列构建的系统进化树,将杆状病毒科划分为4个属:Alpha杆状病毒属(以鳞翅目昆虫为特异宿主的NPV),Beta     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3与GP5蛋白在杆状病毒表面的展示

选择猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP5和GP3蛋白作为免疫原,将杆状病毒的表面展示系统作为载体,成功构建了重组转座载体pBacSC-GP5与pBacSC-GP3,通过转化DH10Bac,筛选蓝白斑,转染昆虫Sf-9细胞,获得重组杆状病毒BacSC-GP5、BacSC-GP3。重组病毒感染Sf-9细胞后,经Western blot和激光共聚焦显微镜观察,目的蛋白在感染细胞中获得表达,并且成功展示在了感染细胞的质膜上。将重组病毒经蔗糖梯度超速离心纯化后,经Western blot和免疫透射电镜观察,目的蛋白在重组病毒上获得表达,展示在重组病毒的囊膜上。研究为开发PRRSV新型疫苗奠定基础。     

杆状病毒表面展示系统的发展及应用

杆状病毒表面展示系统(Baculovirus Surface Display,BSD)是近年来发展起来的一种崭新的膜展示技术。其主要原理是通过基因工程的方法,将杆状病毒表面囊膜蛋白基因与所要展示的目的蛋白基因进行融合,形成重组杆状病毒。重组杆状病毒的囊膜蛋白在表达同时,目的蛋白也随即进行表达,并与囊膜蛋白共同运输至病毒囊膜处,特异的与锚定部位结合,展示在杆状病毒表面。该系统由于具有较强的可控性和较高的展示效率,目前已经被广泛应用于基因转导与基因治疗、较复杂的真核蛋白展示、新型疫苗研发以及单克隆抗体的制备等领域。本文对杆状病毒表面展示系统的研究现状进行了阐述和总结,并对其发展和应用前景做出了展望。     

副黏病毒糖蛋白的结构与功能研究进展

副黏病毒是一类包含多种能引起人和动物严重疾病的负链RNA病毒。其病毒颗粒囊膜上排列有两种糖蛋白，分别是识别并结合宿主受体的附着蛋白(hemagglutinin neuraminidase/hemagglutinin/glycoprotein, HN/H/G)和介导病毒颗粒囊膜与宿主细胞膜融合的融合蛋白(fusion protein, F)。这两种糖蛋白通过与病毒受体及细胞膜的互相作用介导了病毒与宿主细胞的特异性识别、结合及融合过程，最终使病毒基因组进入宿主细胞质开启复制过程。由于糖蛋白是主要的病毒抗原及中和抗体靶点，因此近年来对副黏病毒糖蛋白的研究在不断的深入探索。就副黏病毒糖蛋白在其结构、功能及其相互作用方面的研究进展进行了综述，以期为治疗性抗体和疫苗的合理开发提供理论基础。     

小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株病毒样颗粒的构建及其免疫原性

为了构建具有天然构象的小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株病毒样颗粒,本试验扩增了Nigeria 75/1株M、F和H基因,并分别克隆至双启动子载体pFastBac~(TM) Dual中,构建含有双目的基因的重组供体质粒pFastBac~(TM) Dual-2M、pFastBac~(TM) Dual-2F和pFastBac~(TM) Dual-2H;测序正确后转化至DH10Bac~(TM) 感受态细胞,同源重组获得穿梭质粒rBacmid-2M、rBacmid-2F和rBacmid-2H;将其分别转染昆虫细胞Sf9获得重组杆状病毒rpFB-2M、rpFB-2F和rpFB-2H。以鼠抗M、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体与绵羊抗PPRV阳性血清对重组杆状病毒感染细胞进行间接免疫荧光(IFA)鉴定,可见特异性荧光;以3种重组杆状病毒共感染昆虫细胞Sf9的方式组装病毒样颗粒,放大培养后进行病毒样颗粒纯化。Western blot检测纯化后样品可见相对分子质量为38 000,59 000,68 000左右的条带,表明基质膜蛋白与2种囊膜糖蛋白成功组装出病毒样颗粒,且免疫小鼠可诱导产生保护性中和抗体。本试验为后续小反刍兽疫病毒(PPRV)病毒样颗粒疫苗的进一步研发奠定了基础。     

应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH_la株囊膜糖蛋白 (GP5 )基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB中 ,与杆状病毒线性DNA(Bac_N_BlueTMDNA)共转染昆虫细胞sf9,经过三轮蚀斑纯化后 ,获得重组杆状病毒rBac_GP5。用该重组病毒感染sf9细胞后 ,应用间接免疫荧光试验、SDS_PAGE和Westernblot检测表明 ,GP5基因在杆状病毒系统中获得了高效表达 ,表达产物因糖基化程度差异 ,表观分子量有 2 2、2 5和 30kDa三种总计约占细胞蛋白总量的 2 6 .4%。     

猪瘟病毒cF114株E2基因在家蚕杆状病毒表达系统中的融合表达

为进一步利用家蚕杆状病毒表达系统研制猪瘟病毒(CSFV)新型的亚单位疫苗,将猪瘟病毒cF114株囊膜糖蛋白E2基因克隆至带有GST标签的分泌表达杆状病毒转移载体pAcSecG2T的EcoRⅠ和BamHⅡ位点之间,获得了带有杆状病毒囊膜蛋白gp67信号肽-GST-E2元件的重组杆状病毒转移载体pAcSecG2T-E2,与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,筛选重组病毒(Bm-BacPAK6-E2),PCR证实所分离的重组病毒含有目的片段E2基因。SDS-PAGE图谱显示,感染重组病毒后,在细胞培养液上清和家蚕幼虫、蛹的血淋巴中均可检测到一条分子量为63 kD左右的特异性条带;感染Bm-BacPAK6-E2家蚕蛹的血淋巴可检测到GST活性,接种病毒148 h后重组蛋白的表达水平达到17.11μg/mL。     

新城疫病毒F、NP、M和HN基因在昆虫细胞内的共表达

为构建杆状病毒转移载体，通过PCR的方法将F48E9株新城疫病毒F基因上的StuⅠ位点和NP基因上的XbaⅠ位点进行突变，扩增出全长的F、NP以及F48E9株新城疫病毒M和HN基因片段，将其克隆到pMD18-T载体，再将F、NP、M和HN基因依次亚克隆到杆状病毒转移载体pAeAB4上，F基因和M基因均在p10启动子的操控之下，NP基因和HN基因构建到两个polyhedrin启动子下游，构建重组杆状病毒转移载体pAeAB4-F-NP-M-HN。pAeAB4-F-NP-M-HN与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9，获得重组杆状病毒rBae-F-NP-M-HN。重组杆状病毒感染Sf9细胞，72h后收集细胞和培养上清。Western blot分析显示：M、NP、F和HN蛋白在培养上清中得到了共表达，大小与预期结果一致；感染细胞内只检测到了HN蛋白的表达。这表明M、NP、F和HN蛋白在昆虫细胞内共表达可以自我装配成病毒样颗粒，并且以出芽的方式释放到培养基中。该重组杆状病毒的获得为研究新城疫病毒各结构蛋白之间的相互作用和确定病毒粒子出芽的驱动力等方面奠定了基础。     

以杆状病毒为载体在昆虫细胞中表达致弱Ⅰ型马立克氏病病毒pp38基因同源物

用限制性内切酶Eco RI将不含起始密码子的pp38 基因从重组转移载体质粒pVLpp38 Ⅰ中切出,将致弱Ⅰ型MDV pp38 基因同源物克隆进该转移载体的相同位点。用所得的含pp38 基因同源物的重组转移载体质粒pVL pp38′与野生型杆状病毒(AcMNPV)以脂质体介导法共转染昆虫细胞系Sf9 后,用单克隆抗体H19 介导的间接荧光抗体法筛选到能表达MDV pp38 基因同源物的重组杆状病毒克隆。经SDS-PAGE和Western blot试验,证实pp38 基因同源物在Sf9 细胞中得到表达,抗重组杆状病毒血清能像抗MDV 血清那样,与MDV Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒感染的鸡胚成纤维细胞在荧光抗体试验中呈阳性反应。     

牛病毒性腹泻病毒E2基因在昆虫细胞中的表达

为了获得具有良好抗原性的牛病毒性腹泻病毒E2囊膜蛋白,利用PCR方法扩增牛病毒性腹泻病毒E2基因,连接于昆虫杆状病毒表达载体中,构建pFastBacHTA-E2重组质粒.将该重组质粒转化入DH10BAC感受态细胞,经PCR鉴定获得转座杆粒Bacmid-E2.转座杆粒Bacmid-E2转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,感染细胞后,收获得到目的蛋白,用SDS-PAGE和Western blot对重组的表达蛋白进行分析.结果表明,重组E2蛋白大小为43.6 ku,与预期值相符,该蛋白能与牛病毒性腹泻病毒阳性血清发生特异性反应,为进一步研发牛病毒性腹泻病毒ELISA抗体检测试剂盒奠定基础.     

蓖麻蚕NPV感染离体细胞的研究

<正> 蓖麻蚕核型多角体病毒(NPV)是杆状病毒典型代表之一。建立蓖麻蚕NPV-昆虫细胞系统,对于研究病毒的增殖规律,阐述基因表达与调控等基础理论研究具有重要价值。特别是杆状病毒载体系统已成为杆状病毒分子生物学研究领域的热门课题。国内已开始构建蓖麻蚕NPV表达载体,期望在细胞和活体水平表达外源基因。因此,选择和建立适宜的病毒宿主离体系统,有利于蓖麻蚕NPV作为载体的     

病毒糖基化作用对免疫应答的影响

病毒蛋白糖基化较为常见,但糖基化的类型各不相同。病毒的糖基化蛋白具有识别宿主细胞,介导病毒囊膜与宿主细胞融合以及引起病毒免疫逃避现象等多种生物学特性。人类免疫缺陷病毒的GP41与猪呼吸与繁殖综合征病毒GP5蛋白上存在诱骗表位,诱骗表位抑制临近中和表位的识别。GP5蛋白膜外区上非中和表位A表位会降低临近中和表位B表位的免疫原性,使针对B表位中和抗体延缓产生。除了两个表位位置临近外,寡糖链对B表位的遮蔽或许是造成该现象的主要因素。本文就糖基化的类型,病毒糖基化蛋白的生物学特性以及与糖基化作用相关的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白诱骗表位进行了介绍以期阐明糖基化作用与免疫应答现象之间的联系。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白在杆状病毒表面的展示

本试验将猪圆环病毒2型(PCV2)去核定位区ORF2基因克隆到杆状病毒表面展示转座载体pBacSC中,转化DH10Bac大肠杆菌感受态,经抗性及蓝白斑筛选得到含ORF2基因的重组杆状病毒DNA,以脂质体介导法将此重组DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。对重组病毒进行Western-blot分析和免疫金电子显微镜检测。结果表明,PCV2 Cap蛋白在重组杆状病毒中获得表达;免疫金电子显微镜观察表明,重组蛋白展示在杆状病毒囊膜上。本试验成功构建表面展示PCV2 Cap蛋白的重组杆状病毒,为下一步应用重组杆状病毒作为亚单位疫苗奠定基础。     

鸡新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白的单克隆抗体的生物学活性

NDV是一种属于副粘病毒科的有囊膜的单股RNA病毒。它和其它副粘病毒一样,具有两种糖蛋白(HN和F),以纤突形式从病毒的囊膜凸出。HN蛋白介导病毒对细胞的吸附作用和神经氨酸酶活性,而F蛋白介导膜的融合。尽管对HN蛋白的结构和功能做过一些研究,但为了更好地认识副粘病毒感染的机制,有几个方面有待于澄清。例如,附着细胞和神经氨酸酶活性涉及的是同一活性位点还是不同活性位点仍待解决,因为支持这两种观念的证据都有。另外,神经氨酸酶在感染中所起的作用尚未完全了解。某些研