转录调控因子CsgD强化重组大肠埃希菌生物被膜催化转化桑树黄酮苷的研究

生物被膜催化剂具有可再生、可持续和可扩展等优势,但其生长慢、产量低等问题限制了其在桑树黄酮苷生物转化中的应用。本文以产α-L-鼠李糖苷酶RhaB1的重组大肠埃希菌为研究对象,通过过表达其生物被膜转录调控因子基因csgD,考察CsgD对胞外聚合物分泌、细菌运动和群体感应等生物被膜形成过程关键因子及其催化性能的调控影响。结果表明,过表达菌株形成生物被膜在20 h达到成熟期,比原始菌株延长了25%,生物被膜产量提高了61.51%,说明过表达csgD对生物被膜生长具有促进作用。培养24 h后,过表达菌株分泌的紧密型胞外多聚物中多糖和蛋白质质量浓度为47.54 mg/L和54.72 mg/L,比原始菌株提高了18.24%和37.44%;过表达菌株的游动、群集和蹭行运动半径分别为3.41 mm、7.29 mm和10.61 mm,比原始菌株提高了7.23%、8.00%和7.06%。荧光定量PCR结果显示,过表达菌株中胞外聚合物基因(pgaA、bcsA)、运动性基因(fimH、motB)和群体感应基因(luxS、lsrB、aphA)的表达量显著上升,表明过表达csgD对胞外聚合物分泌、细菌运动和群体感...     

葡聚糖外切酶和葡聚糖内切酶基因密码子的优化及表达

[目的]合成经过密码子优化的葡聚糖外切酶和葡聚糖内切酶基因,并将2个基因在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)中进行分泌表达。[方法]对瘤胃真菌(Piromyces rhizinflatus,P.rhizinflatus)的外切葡聚糖酶cbhYW23-1基因(Gen Bank登录号:EU314937.1)和产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes,F.succinogenes)的内切葡聚糖酶end-1基因(Gen Bank登录号:X88561.1)进行L.lactis MG1363密码子偏爱性优化,并在2个基因的上游和下游分别引入ClaⅠ/XbaⅠ和Hind Ⅲ酶切位点,得到含有优化的cbhYW23-1基因和end-1基因的克隆载体p UC57-cbhYW23-1和p UC57-end-1;通过酶切后分别连接到构建的组成型分泌载体p MG36e+P32+SPusp45上,得到2个基因的表达载体,然后电转至L.lactis MG1363中,利用红霉素抗性筛选得到高拷贝转化重组子;以CMC-Na(羧甲基纤维素钠)为底物验证其活性及表达情况。[结果]成功地构建了cbhYW23-1基因和end-1基因的分泌型表达载体,2个基因均能够在L.lactis MG1363中高效稳定表达,2株重组菌株表达的外切葡聚糖酶酶活和内切葡聚糖酶酶活分别为118.80 U/mL和294.32 U/mL。[结论]密码子优化后的2个纤维素酶基因在L.lactis中获得理想稳定的表达,其高效基因工程菌的构建为将来实现这2种纤维素酶的工业化生产奠定了技术基础。     

康宁木霉AS3.2774纤维素酶CBHⅡ基因与乳酸菌非抗性穿梭表达载体的重组及在大肠杆菌中的表达

以康宁木霉AS3.2774 m RNA为模板,通过RT-PCR技术,扩增了1 413 bp的CBHⅡ全长基因,利用T-A克隆,将CBHⅡ克隆至克隆载体p MD18-T Simple Vector,构建质粒p MD18-T-CBHⅡ。以Sma I和Sph I双酶切p MD18-T-CBHⅡ和以胸苷酸合成酶基因(thymidylate synthase,thy A)为选择压力的非抗生素抗性的穿梭表达载体p W425t,将纯化的CBHⅡ亚克隆到p W425t中,得到原核表达重组质粒p W425t-CBHⅡ,可在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达。将p W425t-CBHⅡ转化在thy A基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coli X13中,通过质粒提取、PCR鉴定、酶切鉴定、分析测序以及生长功能弥补筛选阳性克隆。SDS-PAGE分析,约49.6 k D的蛋白可见,刚果红染色显示重组大肠杆菌可产生明显的水解圈,并用p NPC法测得重组大肠杆菌的CBHⅡ酶活力在温度50℃、p H值5.0时达到最大。     

β-1,3-1,4葡聚糖酶基因双拷贝工程菌株的构建与发酵研究

本试验旨在研究β-1,3-1,4葡聚糖酶双拷贝基因毕赤酵母工程菌株的构建及发酵。首先,通过对质粒pGAP-glu-opt进行PCR扩增获得密码子优化的β-1,3-1,4葡聚糖酶基因glu-opt,用EcoR I和Not I双酶切后与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,获得重组质粒p9K-glu-opt。该重组质粒经Sac I线性化后转化毕赤酵母GS115菌株,利用不含组氨酸的MDS平板和摇瓶培养,筛选重组菌株,命名为GS115/9K-glu-opt。制备GS115/9K-glu-opt感受态细胞,再用线性化的重组质粒pPIC-glu-opt二次转化,在含有抗生素Zeocin的YPDS平板上筛选glu-opt基因双拷贝重组菌株GS115/2xglu-opt。双拷贝重组菌在10 L发酵罐中进行高密度发酵培养及甲醇诱导表达,β-1,3-1,4葡聚糖酶最高酶活达到21 600 U/mL,约为单拷贝工程菌株X33/pPIC-glu-opt发酵活力的1.44倍;蛋白表达量达8.4 g/L,约为X33/pPIC-glu-opt的1.68倍。     

绵羊干扰素tau在毕赤酵母中的表达

应用绵羊的干扰素tau基因IFNt,根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子选择偏好进行分子改造。改造后的基因IFNt克隆到毕赤酵母表达载体p PIC9上,构建得到重组毕赤酵母表达质粒p PIC9-IFNt。电转化于毕赤酵母GS115菌株,对转化后菌体诱导表达,上清SDS-PAGE检测,并优化诱导表达条件。结果表明:IFNt基因已重组到酵母染色体上,并能正常分泌表达,最佳诱导条件为:200 r/min,28℃,0.5%甲醇,96 h。该研究为真核表达绵羊IFNt的生产应用提供了一定的理论依据。     

鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因缺失株平衡致死系统的构建及生物学特性分析

本研究旨在构建基于减毒鼠伤寒沙门菌的平衡致死系统。将打靶基因片段Cat基因重组入鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因位置,之后将温敏型质粒pCP20转入菌体中用以消除Cat基因片段,通过PCR技术两步法筛选出缺失株Δasd LH430;将asd⁺的原核表达质粒pYA3493转入Δasd LH430,经PCR及测序鉴定表明鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430（pYA3493）构建成功。对构建的基因缺失株研究表明,该缺失株失去了在二氨基庚二酸（DAP）阴性环境中生存的能力;糖发酵试验表明,缺失菌株在利用碳源的能力方面与亲本菌株保持一致;9种生化试验结果显示,缺失菌株遗传了亲本菌株的生化特性;遗传稳定性试验表明,缺失菌株能够稳定遗传缺失的423 bp的基因片段;将绿色荧光基因转入所构建的平衡致死系统,成功构建携带绿色荧光基因的重组菌Δasd LH430（pYA-gfp）,对其研究表明该重组菌能够有效表达绿色荧光蛋白。本研究成功构建了鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430（pYA3493）,能够有效表达所携带的基因,该系统可作为疫苗活载体来携带外源基因。     

鲤春病毒(SVCV)糖蛋白基因的原核表达

通过将鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus,SVCV)糖蛋白(Glycoprotein,G)基因截短后构建重组表达载体,实现体外高效表达G蛋白,为有关原核诱导蛋白提供参考。以质粒pEGFP-G为模板设计引物,分别扩增G基因的不同片段,与密码子优化后的G基因分别插入pET-32a表达载体,构建重组表达载体pET-32a-GX和pET-32a-OG。经过鉴定后,将重组质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3),通过适宜条件的诱导表达,获得诱导产物并进行SDS-PAGE和Western blotting检测。构建了重组表达载体pET-32a-GX与含密码子优化后G基因的重组表达载体pET-32a-OG;经适宜条件诱导表达了G蛋白后的SDS-PAGE和Western Blotting检测,表明G蛋白成功表达,且含截短片段的重组载体pET-32a-G2的蛋白表达量最高,与原G序列有相同的免疫原性。成功构建截短后的原核表达载体pET-32aGX与密码子优化后的重组表达载体pET-32a-GX,并实现体外大量诱导SVCV的G蛋白。     

鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因缺失株平衡致死系统的构建及生物学特性分析

本研究旨在构建基于减毒鼠伤寒沙门菌的平衡致死系统。将打靶基因片段Cat基因重组入鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因位置,之后将温敏型质粒pCP20转入菌体中用以消除Cat基因片段,通过PCR技术两步法筛选出缺失株Δasd LH430;将asd~+的原核表达质粒pYA3493转入Δasd LH430,经PCR及测序鉴定表明鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430(pYA3493)构建成功。对构建的基因缺失株研究表明,该缺失株失去了在二氨基庚二酸(DAP)阴性环境中生存的能力;糖发酵试验表明,缺失菌株在利用碳源的能力方面与亲本菌株保持一致;9种生化试验结果显示,缺失菌株遗传了亲本菌株的生化特性;遗传稳定性试验表明,缺失菌株能够稳定遗传缺失的423 bp的基因片段;将绿色荧光基因转入所构建的平衡致死系统,成功构建携带绿色荧光基因的重组菌Δasd LH430(pYA-gfp),对其研究表明该重组菌能够有效表达绿色荧光蛋白。本研究成功构建了鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430(pYA3493),能够有效表达所携带的基因,该系统可作为疫苗活载体来携带外源基因。     

家蚕类ω3-脂肪酸脱氢酶基因的克隆、表达及功能研究

ω3-脂肪酸脱氢酶是生物体内催化多不饱和脂肪酸合成的关键酶之一,其表达受生物胁迫和非生物胁迫因素的影响。从家蚕蛹中克隆了类ω3-脂肪酸脱氢酶基因(Bm FAD3-like),该基因具有一个长度为1 083 bp的开放阅读框,编码由360个氨基酸残基组成的分子质量为41.5 k D的蛋白质。将该基因克隆到p YES2.0载体,构建重组表达载体p YBm FAD3-like及重组酿酒酵母工程菌株YBm FAD3-like后进行诱导表达,收集菌体提取脂肪酸,经气相色谱检测表明异源表达的重组Bm FAD3-like能够将诱导表达体系中加入的外源底物亚油酸(LA)转化为α-亚麻酸(ALA)。半定量RT-PCR检测Bm FAD3-like基因mRNA几乎在家蚕5龄第3天幼虫的所有组织中都有转录,在5龄幼虫期、蛹期和蛾期的转录水平较高,并且其转录水平受低温(0℃)和真菌(球孢白僵菌Beauveria bassiana)侵染(6~36 h)诱导显著上调。对家蚕蛹体注射siRNA沉默目的基因12~72 h后,Bm FAD3-like mRNA转录水平显著下调。研究结果表明,Bm FAD3-like的表达产物能催化LA在ω3位脱氢生成ALA,并且该基因在蚕体受到低温诱导和真菌侵染等胁迫时显著上调表达,外源siRNA能够介导该基因的沉默,显著下调其转录水平。     

猪融合抗菌肽基因双质粒共转化重组毕赤酵母菌的构建

为构建高效表达的猪融合抗菌肽蛋白的重组酵母菌发酵表达体系,规模化生产制备新型免疫分子防控动物传染病,本试验从实验室先前构建的p GAPZαA-P质粒中克隆出已构建好的猪融合抗菌肽CAMPs基因片段。通过I nfusion技术,将C AMPs片段分别克隆入p PIC9K和p PICZαA真核表达质粒中,并通过P CR以及测序验证,成功构建了p PIC9K-CAMPs和p PICZαA-CAMPs重组质粒。通过电转化将线性化p PIC9K-CAMPs转入毕赤酵母G S115基因组中,并筛选高拷贝菌株G S-PK-CAMPs。再将线性化p PICZαA-CAMPs转入重组酵母G S-PK-CAMPs中,筛选出高拷贝菌株G S-PKZ-CAMPs。对重组酵母GS-PKZ-CAMPs进行诱导表达后作转录表达研究,检测抗菌肽是否表达。最终结果显示,成功获得了G S-PKZ-CAMPs可诱导表达菌株,这给猪融合抗菌肽蛋白的大规模发酵制备和应用于动物传染病的防治奠定了可靠的初步基础。     

嗜麦芽窄食单胞菌胞内具二硫键还原活性酶蛋白的研究

研究旨在克隆并表达嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)胞内具二硫键还原活性的酶蛋白。以Stenotrophomonas maltophilia基因组DNA为模板,扩增目的基因谷胱甘肽还原酶(Glr),构建重组质粒p ET-22b-Glr,并转化到表达菌株BL21(DE3)中得到重组菌,经IPTG诱导表达后,测定二硫键还原酶活性。结果表明,该重组酶基因大小为1 359 bp,酶活力为1.85 U/mg。酶学性质研究表明,重组谷胱甘肽还原酶的最适反应p H值为6.0,最适反应温度为40℃。对角蛋白酶K降解羽毛角蛋白的研究表明,该酶对其降解羽毛促进率为15%。结果揭示了Stenotrophomonas malto-philia胞内液具有促进胞外液角蛋白水解活性的内在机制。     

牛病毒性腹泻病毒E_0-E_2融合基因重组卡介苗的构建

为了增强重组卡介苗对牛病毒性腹泻黏膜病的免疫效果,本研究将敲除疏水氨基酸及密码子优化的E0基因与去除了C末端的疏水序列E2截短基因采用重叠延伸PCR的方法进行融合后,将其分别与p MV261/p MV361载体连接,电转化至卡介苗中,构建重组卡介苗。45℃热诱导重组卡介苗表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果证明E0-E2融合基因在卡介苗中成功表达,目的蛋白大小为66.5 ku,且具有反应原性。     

桑树皱叶病毒外壳蛋白基因的原核表达和抗体制备及应用

桑树皱叶病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)是近年从感病桑树中分离鉴定的一种新的桑树病毒,该病毒属于双生病毒科。由于MCLV外壳蛋白基因(cp)序列中含有较多大肠埃希菌(Escherichia mori)BL21(DE3)的稀有密码子而限制了其在大肠埃希菌中的表达。通过人工合成DNA的方法对MCLV cp基因序列进行优化,将其中40个大肠埃希菌稀有密码子变换成同义偏爱密码子,构建优化后的MCLV cp基因的原核表达载体p GEX4T-MCLV CP并转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,经0.1 mmol/L IPTG诱导及SDS-PAGE电泳鉴定,实现了融合蛋白GST-MCLV CP在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达。通过SDS-PAGE纯化后切胶回收原核表达的融合蛋白GST-MCLV CP,以其为抗原免疫新西兰大白兔制备MCLV CP的多克隆抗体,经间接ELISA法测定该抗血清的效价为1∶4 096,Western blot检测其能与MCLV发生特异性反应。用制备的抗血清对MCLV感染阳性的桑叶样品进行间接ELISA检测,其检出率仅为25%,但将桑叶样品的粗汁液煮沸处理后能显著提高MCLV的检出率,检出率达83.3%。     

鸡IFN-α基因的多点突变及其在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母基因的密码子选择偏爱性,在不改变其编码的氨基酸序列的前提下,对鸡IFN-α序列进行PCR介导的定点突变优化,将鸡IFN-α成熟肽序列中136～143位相近的4个Arg密码子和N端的6个稀有密码子突变为毕赤酵母高表达优越密码子,构建了含正确突变和未突变序列的克隆载体pMD-IFNm、pMD-IFN和酵母表达载体pPICZ-IFNm、pPICZ-IFN,电击转化毕赤酵母X-33菌株,经筛选、鉴定表明鸡IFN-α基因已整合到酵母基因组中.通过表达产物的抗病毒活性测定,筛选出突变与未突变高表达酵母转化子各1株.经密码子优化的突变重组酵母菌株PP-IFNm于BMMY培养基中诱导72 h上清中抗病毒活性单位可达410U/mL,其活性比未优化重组酵母株PP-IFN(48.33U/mL)提高了约10倍.     

禽腺病毒4型鞭毛重组蛋白的原核表达及其免疫效果研究

为研究禽腺病毒4型重组鞭毛-fiber2蛋白免疫保护性,将鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因与禽腺病毒4型的fiber2基因融合,再将融合基因和单独的fiber2基因分别克隆到原核表达载体p ET-28a,后将构建的p ET-28a-flagellin-fiber2和p ET-28a-fiber2重组载体分别转入大肠杆菌BL21细胞,经IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE和Western Blot鉴定表达产物,再将表达产物纯化后免疫21日龄SPF鸡;结果表明,重组菌在37℃培养条件下1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h可表达最多的可溶性重组蛋白,Western Blot分析表明,所表达的重组蛋白均能与禽腺病毒血清4型感染阳性血清发生特异性反应,说明所表达蛋白具有良好反应原性,动物试验表明,表达的两种目的蛋白能为鸡提供一定保护力,且低剂量的重组鞭毛-fiber2蛋白产生较好的免疫保护效果。     

密码子优化型鹅细小病毒病毒样颗粒的表达与鉴定

根据昆虫细胞密码子的偏嗜性,对鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)VP2基因的密码子进行优化,利用Bac-to-Bac表达系统构建了表达优化VP2基因的重组杆状病毒,通过感染昆虫细胞(Sf9)获得病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)。SDS-PAGE分析显示Sf9细胞中出现了65 kDa的蛋白条带,间接免疫荧光(indirect immunofluorescent assay,IFA)和Western blot结果均证实表达产物能与鼠抗GPV VP2抗体发生特异性反应,说明其具有良好的免疫反应性。同时,试验结果还证明,密码子优化后的GPV VP2基因在昆虫细胞中表达量得到了提高,明显高于野生型VP2基因。透射电镜观察纯化后的昆虫细胞表达产物,可见直径约30 nm的VLPs,表明密码子的优化并不影响VP2蛋白的组装。本研究为进一步研制诊断抗原以及新型GPV疫苗等奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白在本氏烟草中的表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立一种非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)抗体间接ELISA检测方法,利用马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)介导的植物生物反应器在本氏烟草中表达ASFV p30蛋白,并以表达的蛋白作为包被抗原,对间接ELISA各反应条件进行优化。依据ASFV SY-18株的CP204L(p30)基因序列,按照本氏烟草密码子的偏好性,对p30基因(231～536 bp)的核苷酸序列进行优化、人工合成及克隆,通过In-Fusion连接技术将扩增的p30基因插入到PVY基因组的P1和HC-Pro基因之间,构建PVY-p30重组病毒质粒,以摩擦的方式将质粒接种本氏烟草叶片,14 d后,通过RT-PCR和Western blot分析目的基因的转录和重组蛋白的表达情况,并利用Ni-NTA-琼脂糖亲和层析柱纯化本氏烟草中表达的p30重组蛋白,Western blot分析p30重组蛋白的纯化效果和反应原性,将纯化后的p30重组蛋白作为包被抗原,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法。结果显示,构建的PVY-p30重组病毒能够系统性侵染本氏烟草;p30重组...     

桑树miR482的表达特性及生物功能研究

MicroRNA (miRNA)作为一种重要的基因表达调控因子,在植物生长发育和响应环境胁迫过程中具有重要的调节功能.本研究克隆了桑树miR482基因(MulmiR482),发现该基因可以表达加工成两种成熟体mul-miR482-5p和mul-miR482-3p,两者在桑树根中均具有较高的表达丰度,而在叶片中的丰度较低.通过拟南芥嫁接试验发现mul-miR482-5p和mul-miR482-3p在植物体内具有长距离运输特性.将MulmiR482基因转入拟南芥,发现其可以在拟南芥中表达并可加工成成熟体,同时发现MulmiR482基因在拟南芥中表达降低了转基因植株对盐胁迫和丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000的抗性.上述结果为深入研究桑树mul-miR482的生物功能和其表达调控机制奠定了基础.     

猪流行性腹泻病毒流行毒株S1片段的克隆表达及其抗体制备

通过对猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株S基因进行序列分析,选取S1蛋白502~641氨基酸位置,根据大肠杆菌密码子偏嗜性进行密码子优化,PCR融合扩增片段,并将其克隆到原核表达载体上,获得重组质粒p ET32a-S417、p XXGST-S417。将获得的重组质粒转化到BL21感受态细胞,成功诱导表达、纯化,以GST-S417重组蛋白作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。结果表明:本试验所选区域具有好的抗原免疫原性,制备的多克隆抗体能特异性识别目的蛋白,为PEDV诊断试剂盒和疫苗研制提供了理论依据。     

副猪嗜血杆菌β-半乳糖苷酶的原核表达与活性检测

克隆表达副猪嗜血杆菌β-半乳糖苷酶(BgaC),并测定其酶学特性。以副猪嗜血杆菌SH0165菌株基因组为模板,将BgaC基因的序列(1 791bp)克隆到pET32a质粒上,并电转化BL21表达菌株。以His标签融合蛋白纯化操作方法纯化表达产物。用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定β-半乳糖苷酶的天然分子质量,以邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷为底物测定其酶学特性。结果表明,在大肠埃希菌BL21中成功表达了副猪嗜血杆菌的BgaC基因,经鉴定pET32a+BgaC重组菌表达的蛋白大小为82.4ku。纯化后BgaC的酶比活力为1 795U/mg,pET32a+BgaC重组蛋白的最适pH为6~7,最适温度为30℃~37℃。副猪嗜血杆菌β-半乳糖苷酶(BgaC)具有糖苷酶活性能够介导糖蛋白的降解,在氨基酸序列上存在高度保守的区域,在生物技术领域具有广泛的应用前景。