Bmo-miR-2771对家蚕丝胶蛋白基因BmSer-1表达的调控作用

微小RNA(miRNA)可通过抑制mRNA转录或使RNA降解的方式在转录后水平调节靶基因的表达。研究与家蚕丝胶蛋白基因1(BmS er-1)转录后表达有关的miRNA(Bmo-miR)及其作用方式,以丰富丝胶蛋白基因表达的精细调控信息。首先从miRBase 21数据库中获得全部成熟体Bmo-miR,通过生物信息学分析筛选到一个对BmS er-1有潜在调控作用的BmomiR,命名为Bmo-miR-2771。设计茎环引物,采用半定量RT-PCR方法检测Bmo-miR-2771及其预测靶基因BmS er-1在家蚕5龄3 d幼虫头部、脂肪体、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺、中肠等组织器官以及血淋巴细胞中的表达水平,结果显示Bmo-miR-2771特异性地在中部丝腺中表达,并且靶基因BmS er-1在中部丝腺的相对表达量也明显高于其他组织。将构建的表达BmomiR-2771的重组质粒pcD NA3.0(ie1-egfp-pri-miR-2771-SV40)和表达BmS er-1 3'-UTR的重组质粒pG L3(A3-luc-Ser-1 3'UTRSV40)共转染家蚕卵巢培养细胞BmN,并以共转染pcD NA3.0(ie1-egfp-SV40)和pG L3(A3-luc-Ser-1 3'UTR-SV40)的BmN细胞为阳性对照,以海肾荧光素酶表达载体pRL-CMV为内参,检测荧光素酶活性,结果显示实验组的荧光素酶活性相对于阳性对照组显著降低(P0.05),从细胞水平证实了Bmo-miR-2771对BmS er-1基因表达具有负调控作用。     

Bmo-miR-2755*对丝素蛋白基因BmFib-L和BmP25表达的调控作用

为了研究家蚕miRNA对丝素蛋白基因表达的调控作用,采用生物信息学方法筛选获得对家蚕丝素轻链基因(BmFib-L)和P25蛋白基因(BmP25)有潜在调控作用的Bmo-miR-2755*。利用半定量RT-PCR技术分析Bmo-miR-2755*及其靶基因BmFib-L、BmP25在家蚕4~5龄期幼虫后部丝腺和5龄3 d幼虫不同组织器官中的表达水平,结果显示三者在后部丝腺组织中的表达水平都较高,呈现严格的时空特异性。以pcDNA3质粒为载体,构建Bmo-miR-2755*的重组表达载体pcDNA3[ie1-egfpprimiR-2755*-SV40];以pGL3.0-Basic质粒为载体,分别构建BmFib-L 3'UTR、BmP25 3'UTR与荧光素酶报告基因luc融合的重组报告质粒pGL3.0[A3-luc-Fib-L-3'UTR-SV40]和pGL3.0[A3-luc-P25-3'UTR-SV40]。以海肾荧光素酶表达载体pRL-CMV为内参,分别将构建的Bmo-miR-2755*重组表达载体和2个重组报告质粒共转染BmN细胞,通过检测细胞中的荧光素酶活性,明确Bmo-miR-2755*可显著下调BmFib-L基因的表达,并能上调BmP25基因的表达,但上调作用未达显著水平。上述结果为研究家蚕miRNA的功能和阐明蚕丝蛋白基因表达调控分子机制提供了新的实验数据。     

家蚕bmo-miR-217对核型多角体病毒(BmNPV)lef-1基因表达的调控作用

昆虫的单链小分子RNA(microRNAs)不仅通过与自身的靶基因互补进行转录后水平调控,从而参与重要的生命过程,并且还可以与病原体靶基因相互作用,在免疫防御方面发挥重要功能。给家蚕5龄眠起幼虫接种家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)后72 h,收集蚕体血淋巴提取总RNA用于高通量测序,经克隆验证获得一条由Bm NPV诱导上调表达的家蚕miRNA(bmo-miR-217),用生物信息学方法预测到bmo-miR-217对应的一个病毒靶基因为lef-1。构建bmo-miR-217及Bm NPV lef-1 3'-UTR的表达载体,并共转染家蚕卵巢培养细胞Bm N,于48 h后通过检测细胞的双荧光素酶相对活性,显示出bmo-miR-217可显著下调Bm NPV lef-1基因的表达(P0.05)。已知lef-1是Bm NPV侵染复制的必需基因之一,因此抑制其表达是家蚕先天免疫的一种有效策略。     

家蚕蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的诱导表达模式及蜕皮激素响应元件核心保守区的识别

核受体基因家族是介导昆虫蜕皮激素(20E)作用的关键信号分子。为了研究家蚕丝腺中核受体异源二聚体编码基因——蜕皮激素受体基因Bm EcR和超气门蛋白基因Bm USP的表达模式,应用实时荧光定量PCR技术检测家蚕5龄幼虫正常状态下和用2×10~(-3)μg/μL蜕皮激素处理后Bm EcR与Bm USP在丝腺组织中的表达变化。结果表明,20E处理后,Bm EcRA、Bm EcR-B1和Bm USP在中、后部丝腺的表达量与对照组相比均有不同程度增加,说明20E能够促进Bm EcR-A、Bm EcR-B1和Bm USP基因的表达;但中部丝腺与后部丝腺Bm EcR-A、Bm EcR-B1和Bm USP基因的表达变化趋势不同。利用等温滴定量热技术(ITC)获得的家蚕蜕皮激素受体结构域蛋白Bm EcR-B1D与蜕皮激素响应元件Bm E75A-EcRE及其缺失突变体相互作用的亲和力常数(K)、反应热(ΔH)和熵(ΔS),显示了Bm EcR-B1D蛋白能够与Bm E75A-EcRE进行结合,并发现Bm E75A-EcRE的核心保守区为编码序列TCTTC,推测该区域有可能是Bm EcR-B1D蛋白结合在Bm E75A-EcRE上的精确位点。     

家蚕铁蛋白Ferritin家族基因的鉴定及序列特征与表达谱分析

机体内的铁蛋白Ferritin能存储和释放铁离子,在调节细胞的铁离子平衡中发挥重要作用。采用生物信息学方法分析家蚕基因组中Ferritin基因家族成员Bm Fer1、Bm Fer2、Bm Fer3和Bm Fer4的序列特征,并通过转录组芯片数据和实时定量PCR分析其时空表达谱,为研究蚕体内的铁元素代谢机制提供基础数据。Bm Fer1、Bm Fer2、Bm Fer3具有Ferritin蛋白家族典型的5个α螺旋结构,但铁离子结合位点的种类和数量相对较少。Bm Fer1和Bm Fer3为线粒体铁蛋白,具有O糖基化位点;Bm Fer2和Bm Fer4为细胞质铁蛋白,具有N糖基化位点。Bm Fer1、Bm Fer4为重链型铁蛋白,具有典型的亚铁氧化酶活性中心,在系统进化上与代表物种的重链型铁蛋白聚为一支;而Bm Fer2为轻链型铁蛋白,无亚铁氧化酶活性中心,聚类于轻链型分支。转录组芯片数据表明,家蚕5龄幼虫中肠中Bm Fer1、Bm Fer2的表达量明显高于其他各组织,而且在头部、脂肪体、血细胞、马氏管中的表达量是Bm Fer1的平均值高于Bm Fer2。在家蚕幼虫5龄4 d至蛾期的发育过程中,Bm Fer1和Bm Fer2的表达量均明显上调,尤以上蔟后期发育至蛾期的上调最为明显。实时定量PCR分析显示,Bm Fer1和Bm Fer2在家蚕5龄幼虫丝腺组织的表达量明显高于其他组织。Western blotting分析发现Bm Fer2在家蚕胚胎细胞中有表达,并在催青后的蚕卵中上调表达,推测Bm Fer2基因在家蚕早期胚胎发育中已开始转录、表达行使其功能。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin16的表达规律及体外重组表达

家蚕(Bombyxmori)的丝腺是丝蛋白合成分泌的场所,存在多种丝氨酸蛋白酶抑制剂。为探究家蚕丝蛋白的合成和保护机制,采用半定量RT-PCR的方法调查家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin16在家蚕不同发育时期和5龄第5天幼虫各个组织器官中的表达特征,结果表明家蚕serpin16基因仅在4眠-5龄第6天的发育期表达,并且仅在丝腺中特异表达,其中在中部丝腺前区转录水平最高,而在中部丝腺中区和后区的转录水平较低;进一步构建pGEX-4T-1-serpin16原核表达载体,并转化至大肠杆菌(Eschevichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导获得融合蛋白,纯化后得到单一的目的蛋白。家蚕serpin16基因在幼虫丝腺的特异表达模式提示其可能与家蚕的吐丝过程密切相关,推测该基因在维持丝腺稳定的泌丝环境中发挥重要作用。     

家蚕丝素基因表达水平的定量分析

采用实时定量RT-PCR方法,对丝素轻链基因(fib-L)、丝素重链基因(fib-H)、P25基因在家蚕幼虫不同组织和不同发育时期的表达进行了定量分析。结果发现3种丝素基因除主要在5龄幼虫的后部丝腺中表达外,在其它组织如脂肪体和中部丝腺中也有一定程度的表达;在4龄眠期的后部丝腺中3种丝素基因也有一定的表达水平,其中fib-L在这一时期的表达量较高。同时发现在5龄第3天和第5天的后部丝腺中,fib-H、fib-L与P25在mR-NA水平上的摩尔比分别为9∶18∶1和19∶32∶1,推测丝素基因的表达可能具有转录后调控,此结果说明家蚕丝素基因的表达可能具有更加精细的调控机制。     

家蚕胸腺素对蚕体抗核型多角体病毒感染能力的影响

胸腺素(THY)在动物进化过程中高度保守,并在许多生命活动中发挥重要作用。将家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)感染家蚕5龄幼虫后,分别提取蚕体及不同组织的RNA和蛋白质,检测Bm THY基因的转录及蛋白质表达的变化,并探究利用重组胸腺素r Bm THY增强家蚕抗病毒能力的可行性。qRT-PCR检测结果表明,感染Bm NPV后的家蚕5龄幼虫,其血淋巴、脂肪体、丝腺和气管中的Bm THY基因mRNA转录水平不同程度上调,而马氏管、中肠和头部组织中Bm THY基因mRNA转录水平则呈下调趋势;Western blotting检测家蚕5龄幼虫感染Bm NPV后72 h,蚕体内Bm THY蛋白的表达水平下降42.3%。家蚕5龄幼虫接种Bm NPV后,分别添食质量浓度为340μg/m L(高剂量)、34μg/m L(中剂量)和3.4μg/m L(低剂量)的r Bm THY溶液,调查3组幼虫的发病率为43.8%、54.0%和57.6%,而对照组幼虫分发病率为62.2%。研究结果初步证明Bm NPV感染可降低蚕体及部分组织中Bm THY的基因转录与蛋白质表达水平,高剂量r Bm THY添食处理可以在一定程度上提高家蚕抗Bm NPV病毒感染的能力。     

家蚕翅原基发育关联基因BmHMGS的鉴定与表达特征分析

家蚕幼虫的翅原基最终发育为成虫的翅,翅原基发育与家蚕的变态发育紧密关联。为了研究激素作用下家蚕翅原基发育的分子调控机制,以经过蜕皮激素20E体外诱导培养和未经诱导培养的家蚕5龄幼虫翅原基为材料分别提取总蛋白质,利用Shotgun质谱分析在20E诱导组的翅原基中获得132种差异蛋白,在未经20E诱导组的翅原基中获得76种差异蛋白。进一步通过生物信息学技术及GO分类法在20E诱导组的翅原基的差异蛋白中,筛选到1个具有生物调节作用的酶类蛋白基因Bm HMGS作为翅原基发育相关的候选基因,设计引物并以上蔟1 d的蚕体翅原基总RNA反转录得到的c DNA为模板,克隆了该基因。通过qRT-PCR检测到Bm HMGS基因在幼虫5龄1 d、上蔟3 d、蛹期1 d蚕体内的表达量较高,其中在上蔟3 d的表达量达到峰值。构建重组载体进行Bm HMGS的原核表达并制备抗体后,采用Western blot技术在5龄1~7 d和上蔟1~3 d的蚕体翅原基、脂肪体中及上蔟1~3 d的生殖腺中都可以检测到Bm HMGS的表达,并且在翅原基中的表达没有发育时期特异性。研究结果表明,从20E诱导组的家蚕翅原基中鉴定的Bm HMGS与翅原基发育相关,其表达在5龄至上蔟阶段没有时期和组织的特异性,推测Bm HMGS是一个具有多种生物学功能的基因。     

有机磷农药辛硫磷对家蚕卵巢培养细胞DNA损伤的单细胞凝胶电泳检测

采用单细胞凝胶电泳技术检测农药对家蚕卵巢培养细胞(Bm N)DNA的损伤作用,从细胞毒理学方面确证农药对家蚕的残留毒性,并探讨家蚕培养细胞作为农药危害及残留检测生物标志物的可行性。以有机磷杀虫剂辛硫磷以及Bm N细胞供试,用0.05 mg/L辛硫磷药液(约为家蚕5龄第1天幼虫24 h LC50的1/100)处理正常Bm N细胞,24 h后观察到处理组Bm N细胞出现明显的凋亡现象,通过单细胞凝胶电泳检测到Bm N细胞的DNA条带有95.43%出现拖尾现象。试验结果表明Bm N细胞对辛硫磷非常敏感,低浓度辛硫磷即会对细胞DNA造成严重损伤,该项技术可用于农药对家蚕的危害及残留毒性鉴定,同时也说明Bm N细胞可以作为农药的细胞毒性研究材料。     

家蚕核型多角体病毒极早期蛋白PE38与家蚕SRSF蛋白激酶的相互作用关系验证

家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)是家蚕血液型脓病的病原,其极早期蛋白PE38参与病毒的侵染、复制与增殖。通过酵母双杂交和荧光双分子互补(Bi FC)试验证实Bm NPV PE38蛋白和家蚕SRSF蛋白激酶(Bombyx mori SRSF protein kinase 1-like,Bm SRPK)之间存在互作关系,推测Bm NPV可能是通过影响宿主的前体mRNA组成性和选择性剪接来获得对自身增殖有利的微环境。进一步利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析感染Bm NPV后Bm N细胞中Bm SRPK的表达变化以及正常家蚕5龄第3天幼虫体内Bm SRPK表达的组织特异性,发现感染病毒后Bm N细胞中Bm SRPK的表达量有所增加;Bm SRPK在正常幼虫的精巢、中肠和脂肪体中表达量较高,在血细胞中的表达量最低。研究结果有助于进一步深入研究Bm NPV和家蚕宿主之间复杂的相互作用关系。     

家蚕丝素P25蛋白的多克隆抗体制备与应用

P25蛋白是家蚕(Bombyx mori)丝素蛋白的主要成分之一。根据BmP 25基因ORF序列设计引物,以家蚕5龄第3天丝腺cD NA为模板,RT-PCR扩增获得BmP 25的ORF全长片段。将构建的含BmP 25的原核表达重组质粒转化大肠埃希菌Rosetta(DE3)菌株感受态细胞,对家蚕丝素P25蛋白进行重组表达和纯化,并免疫家兔制备获得多克隆抗体,用于研究家蚕丝腺中P25蛋白的合成和分泌规律。利用制备的多克隆抗体对家蚕品种大造5龄第3天幼虫9个组织的总蛋白质样品进行Western blot检测,结果在中部丝腺和后部丝腺检测到P25蛋白,表明该抗体有较好的特异性。进一步利用此多克隆抗体分别对家蚕5龄第5天幼虫中部丝腺和后部丝腺不同区域进行荧光免疫组化分析,结果在后部丝腺的细胞和腔内观察到明显的荧光信号,而中部丝腺后部的细胞仅有微弱信号,腔内的荧光信号强度随着丝素蛋白的从后向前运输越来越弱,以致在中部丝腺的前部和中部未检测到荧光信号。推测可能是P25蛋白在丝素蛋白从溶胶状态到凝胶状态的转化过程中,被逐步包裹在丝素蛋白聚合物中导致其不能被检测到。利用该多克隆抗体对家蚕不同品种的茧丝蛋白进行Western blot检测,均能获得特异性的杂交条带,表明该抗体还可用于家蚕茧丝及丝制品的分子检测鉴定,为开发丝制品的检测试剂盒提供了条件。     

PI3K/AKT/TORC1信号通路对丝素蛋白合成转录因子SGF1表达的影响

SGF1(silk gland factor 1)是一种转录调控因子,属于Fox家族的Fox A亚家族成员,能够启动丝素基因的表达,合成丝素蛋白。已知果蝇和其他高等动物中的PI3K/AKT/TORC1信号通路可以调控Fox转录蛋白的表达。为了探究家蚕幼虫后部丝腺(PSG)中PI3K/AKT/TORC1信号通路对SGF1表达水平的影响,对4龄第4天和5龄第7天家蚕幼虫分别注射信号通路抑制剂Wort、Rapa和LY294,24 h后解剖取出后部丝腺,一组用于免疫组织化学染色实验,另一组用于提取蛋白质进行Western blot检测。免疫组织化学染色实验表明,与对照组相比,注射3种信号通路抑制剂的家蚕幼虫后部丝腺组织的绿色荧光亮度明显减弱;Western blot检测表明,与对照组相比,实验组家蚕幼虫后部丝腺的蛋白质浓度有所下降。综合以上结果初步得出PI3K/AKT/TORC1信号通路抑制剂处理均可降低家蚕幼虫后部丝腺中SGF1表达的结论,即提示可以通过上游信号通路PI3K/AKT/TORC1影响SGF1的表达水平,进而调控丝素蛋白的合成。     

家蚕丝胶基因研究概况

丝胶是茧丝的重要组成部分,起着胶粘和保护丝素的作用,同时在很多领域有着潜在应用。编码丝胶蛋白的主要有3个丝胶基因Ser1、Ser2和Ser3,都是在中部丝腺中被特异表达。Ser1基因的启动子上游存在3个转录调控位点:SA、SB和SC,转录因子SGF-1和SGF-3分别与SA和SB、SC结合对Ser1基因的表达进行调控。Ser1只在中部丝腺后部的150个细胞中表达,Ser2在5龄起始的时候在所有的中部丝腺细胞中都有表达,后来只在中部丝腺前部表达,而Ser3只存在于中部丝腺中前部。本文从分子生物学角度出发,概述丝胶基因的研究进展以及存在的问题。     

家蚕蜕皮激素22激酶2(BmEcK2)的序列及基因表达特征分析

前期研究发现在感染家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrovirus,Bm CPV)的家蚕幼虫中肠中,有一个下调表达的差异蛋白可能参与了家蚕对Bm CPV感染的抵抗过程。利用Blastp进行同源性比对的结果显示,该蛋白质与尺蠖(Operophtera brumata)的未知蛋白质OBRU01_04785和蜕皮激素22激酶(Ecdysteroid 22-kinase)的序列相似度分别为51%、49%,进一步通过多序列比对和系统进化分析发现该蛋白质与Ecdysteroid 22-kinase蛋白的亲缘关系最近,属于蜕皮激素激酶超家族;该蛋白质与家蚕中已知的蜕皮激素22激酶1(Bm Ec K1)的序列相似度为24.4%,因此将其命名为Bm Ec K2。实时荧光定量PCR检测Bm Ec K2基因m RNA在家蚕5龄幼虫中肠组织中的转录水平最高,其次是马氏管、丝腺和卵巢,而在血淋巴、头部、精巢、脂肪体中几乎检测不到转录;家蚕5龄起蚕感染Bm CPV后24、48、72 h,中肠中Bm Ec K2基因m RNA的转录水平下调,分别是对照组家蚕中肠的0.32、0.45和0.21倍。研究结果初步提示,Bm CPV感染导致家蚕中肠中的Bm Ec K2下调表达,进而可能影响到家蚕体内激素调节水平的变化。     

家蚕丝腺Matchmaker cDNA文库的构建和3种蚕丝蛋白基因转录因子编码区的克隆

采用Clontech公司SMARTTM技术,分别构建了家蚕4龄眠蚕后部丝腺(PSG0)以及5龄第3天后部丝腺(PSG3)、中部丝腺(MSG3)和脂肪体(FAT3)的Matchmaker cDNA文库,用A3基因引物对几个文库的质量进行了检测;从cDNA文库和家蚕基因组中克隆了FMBP-1、POU-M1和BmFkh 3种在蚕丝蛋白基因表达调控中起重要作用的转录因子编码区,并对其序列进行了分析。结果表明,所建cDNA文库能够用于利用酵母的杂交系统开展蚕丝蛋白基因的表达调控研究。     

家蚕烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶基因(BmNADK)的高温应激表达分析

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶(NAD kinase,NADK)是生物体内氧化还原调节和氧化应激反应的重要酶类。以对高温耐受性不同的家蚕品种的5龄幼虫为材料,进行34℃连续高温处理和42℃高温冲击3 h处理,通过实时荧光定量PCR检测家蚕NADK基因(Bm NADK)在雌蚕和雄蚕的脂肪体、中肠、丝腺3个器官组织中的表达水平,探究该基因是否与家蚕对高温的应激反应有关。结果显示,5龄期2种高温环境胁迫均可引起Bm NADK基因在蚕体3个器官组织中上调表达,其中在脂肪体表达的上调最为显著,且雄蚕脂肪体中的上调表达明显高于雌蚕,当恢复常温环境条件时,Bm NADK基因在蚕体组织的表达量也随之下降;高温胁迫下Bm NADK基因在耐高温家蚕品种7532幼虫组织中的表达量高于对高温耐受性差的品种皓月。研究结果显示Bm NADK基因与家蚕对高温的应激反应相关,在耐高温家蚕品种及雄蚕体内的应激表达水平相对较高。     

人类免疫缺陷病毒HIV结构蛋白Gag在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

人类免疫缺陷病毒(HIV)是导致艾滋病的主要病原之一,HIV病毒的核心结构蛋白Gag有自我装配功能,并能激发体液免疫和细胞免疫,是理想的HIV疫苗靶抗原。将Gag基因克隆至质粒p Bac PAK8中构建重组质粒,并与线性化的家蚕杆状病毒基因组DNA共转染Bm N细胞,得到重组家蚕杆状病毒Bm NPV-Gag。将该重组病毒感染Bm N细胞和家蚕5龄幼虫,SDS-PAGE、Western blotting检测显示在重组病毒感染的Bm N细胞和家蚕5龄幼虫血淋巴中均有与Gag蛋白大小(55 k D)相符的特异性条带出现,证明重组Gag蛋白成功表达。用ELISA法测定重组病毒感染后不同时间目的蛋白质的表达变化:Bm N细胞中的Gag蛋白含量在感染后的第4天达到最大值6.995 pg/个,在感染第5天后出现下降趋势;5龄幼虫血淋巴中的Gag蛋白含量在感染后的第7天最高,为790.1 ng/m L。重组Gag蛋白在家蚕杆状病毒表达系统中的成功表达,为艾滋病疫苗的研究探索了新的途径。     

家蚕丝腺因子SGF-1的基因克隆及序列结构和表达特征与亚细胞定位

Fox类转录因子在细胞生长、增殖、分化和胚胎发育等过程中发挥重要功能,SGF-1是家蚕丝腺细胞转录因子,属于Fox类转录因子家族。家蚕SGF-1(BGIBMGA005101-TA)基因位于第25号染色体nscaf2823:112743~113792(+strand),含有1个外显子,CDS全长1 050 bp,编码349个氨基酸。家蚕品种大造5龄第3天幼虫的基因芯片表达谱显示,SGF-1基因在大多数组织中有表达,在丝腺中高量表达,其中在前部和中部丝腺的表达量略高于后部丝腺,在雄蚕中的表达量略高于雌蚕。氨基酸组成分析显示,SGF-1蛋白富含脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸和亮氨酸,且多数为亲水性氨基酸。序列结构分析表明,SGF-1包含典型的Forkhead结构域,其两端分别为Forkhead_N末端结构域和HNF3_C末端结构域,其中大多数氨基酸残基形成了无规则卷曲结构,α-螺旋与β-折叠结构分别约占18.0%和0.6%。从家蚕后部丝腺克隆了SGF-1基因,并构建麦芽糖结合蛋白标签融合表达载体,表达并纯化了重组SGF-1蛋白。通过RT-PCR与Western blotting检测分别从基因转录水平和蛋白质表达水平上证实,SGF-1在家蚕5龄第3天幼虫丝腺中高量表达。亚细胞定位实验显示SGF-1定位于细胞核中。这些结果为深入研究SGF-1的结构和功能提供了有益的基础信息。     

家蚕细胞色素P450基因Bmcyp6A8的克隆及序列与表达分析

昆虫细胞色素P450第6亚家族(CYP6)氧化酶在对异源有毒物质的代谢中具有重要作用。采用生物信息学方法获得与果蝇CYP6亚家族基因cyp6A8同源的家蚕cyp6A8基因序列,预测该基因的开放阅读框(ORF)为1572bp,编码523个氨基酸,推定的蛋白分子质量为61.52kD,等电点为8.17。以家蚕5龄第3天幼虫头部cDNA为模板,用设计的特异引物PCR扩增出一条约1500bp的条带,大小与家蚕cyp6A8基因的ORF预测值接近,命名为Bmcyp6A8基因(GenBank登录号:GQ241737)。同源性分析结果:Bmcyp6A8基因与野桑蚕cyp6AE8基因的相似性为93%;与棉铃虫cyp6AE12基因的相似性为57%;与人cyp3A43基因的相似性为48%。芯片数据分析显示Bmcyp6A8基因在家蚕5龄第3天幼虫的头部、表皮与中部丝腺前部高量表达,与家蚕CYP6亚家族的其它横向同源基因不同的是,只有该基因在中部丝腺前部表达,推测其具有功能特异性。