苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒对家蚕的感染性分析

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒作为一种新型微生物源低毒杀虫剂,能够防治大多数鳞翅目昆虫并广泛应用于农业生产,它对同属于鳞翅目昆虫的家蚕是否具有感染性是该生物农药在桑保和蚕区植保上推广的关键。     

苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒在家蚕蛹体内的复制及重组病毒外源基因的表达

家蚕蛹在复眼着色期,经4℃冷藏24小时后,可被Ac NPV(苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒)感染。在蛹体内复制出的多角体大小差异较大,且比在昆虫Sf—21细胞中繁殖的Ac NPV和在蚕蛹体内形成的Bm NPV多角体小。在蛹体内繁殖的Ac NPV的游离病毒可以回返感染Sf—21细胞。由蚕蛹内分离的Ac NPV基因组DNA的限制性内切酶图谱与野生型的Ac NPV相同。以上结果证明Ac NPV可以在蚕蛹体内复制。含HBsAg基因(人乙肝表面抗原)的重组Ac NPV亦可感染家蚕蛹,并能正确表达外源基因。此外,还发现化蛹后第2天的家蚕蛹被注射约5×10~5PFU的Ac NPV,可诱导“人工滞育蛹”现象的发生,在25℃经过30天后蛹仍存活,发育停滞在复眼着色前阶段。     

家蚕中肠细胞与家蚕核型多角体病毒经口感染因子P74的互作蛋白筛选

家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)包涵体衍生型病毒粒子(ODV)被家蚕幼虫食下后通过侵染中肠上皮细胞引发全身性感染,这个过程称为经口感染。已知有多种ODV囊膜蛋白在经口感染中发挥关键作用,被称为经口感染因子(PIF)。P74作为最早被鉴定的PIF,与ODV结合中肠上皮细胞有关。为了鉴定宿主家蚕中肠细胞中与P74互作的蛋白质,构建家蚕中肠酵母文库,并以P74作为诱饵进行酵母双杂交筛选。初步筛选到7种互作候选蛋白,分别为U3小核仁核糖核蛋白IMP3、60S核糖体蛋白L5、JAB-MPN结构域蛋白、细胞质肌动蛋白A3、35 k D蛋白酶、富半胱氨酸和组氨酸蛋白1-B和真核翻译起始因子1A。免疫共沉淀实验结果表明JAB-MPN结构域蛋白和P74之间存在强烈互作,该蛋白质可能是ODV结合中肠细胞的关键宿主因子。研究结果为进一步阐明Bm NPV经口感染的详细分子机制提供了新的线索。     

家蚕核型多角体病毒ODV囊膜蛋白基因的融合表达及引导外源蛋白进入多角体的研究

为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的包涵体衍生病毒(ODV)囊膜蛋白在病毒粒子包涵入多角体过程中的作用,选择2个ODV囊膜蛋白ODV-E25和ODV-E56作为研究对象,利用能够表达多角体蛋白的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建了融合表达E25-EGFP和E56-EGFP的重组病毒,在家蚕卵巢培养细胞系(BmN)中进行表达和定位分析。结果表明2种融合蛋白均在BmN细胞中成功表达,并于荧光显微镜下观察到绿色荧光主要分布在细胞核中。从感染的BmN细胞中收集纯化多角体,观察到多角体也能激发出绿色荧光,用Western blot方法进一步证实多角体中含有融合蛋白。这一现象表明当囊膜蛋白基因与外源基因融合表达时,外源融合蛋白能够进入多角体内部,推测这2种ODV囊膜蛋白不仅在病毒粒子包涵入多角体的过程中起信号引导作用,并能引导外源目的蛋白进入多角体。     

家蚕核型多角体病毒对寄主细胞凋亡抑制蛋白BmAPI5表达的影响

API5是一种新的细胞凋亡抑制蛋白因子,能有效抑制细胞凋亡。API5在结构与功能上高度保守,并已在包括家蚕在内的多种昆虫中发现存在同源基因。本文检测了家蚕幼虫BmAPI5基因在BmNPV和大肠杆菌侵染后的转录与表达变化。结果表明,微生物侵染能快速显著诱导BmAPI5基因的转录与表达,其中以BmNPV的诱导作用较为明显。这表明BmAPI5可能参与BmNPV-宿主的互作机制。     

家蚕核型多角体病毒多角体蛋白的多克隆抗体制备及应用试验

杆状病毒(baculovirus)多角体蛋白(polyhedrin)是晚期高水平表达的蛋白质,对于维持病毒粒子在自然环境下的稳定性和在宿主之间的传播至关重要。PCR扩增家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)多角体蛋白基因polh,亚克隆到原核表达载体p ET32,获得重组质粒p ET32-polh,并转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)表达菌株进行原核表达,诱导表达的融合蛋白带His标签,经镍柱纯化后用于免疫新西兰大白兔,制备抗多角体蛋白的多克隆抗体。Western blot检测该多克隆抗体能够特异识别Bm NPV的多角体蛋白。利用该多克隆抗体进行免疫荧光和Western blot分析多角体蛋白的亚细胞定位及表达时相,结果显示多角体蛋白定位于细胞质,且在病毒感染后48 h才可以被检测到。该多克隆抗体可用于Bm NPV多角体蛋白的功能研究。     

青海草原毛虫核型多角体病毒的初步研究

1987年从青海省海北州草地上罹病死亡青海草原毛虫(Gynaephora qing haien sis Chouet Ying)幼虫分离获得草原毛虫核型多角体病毒(GqNPV)。多角体(PIB)近圆形、菱形、三角形或六角形,大小约0.26—0.294βm。试验结果显示 GqNPV 对草原毛虫有较强的毒力。其杀虫效果达85%,并有后效作用。     

BmNPV多角体蛋白基因编码区结合蛋白的鉴定

家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)是一种具有较强传染性的病毒,在感染的极晚期超高水平表达一种约29 kD的碱溶性多角体蛋白。但该蛋白为病毒复制的非必需蛋白,因此,利用该基因可以被删除或被外源基因替换而不影响病毒的复制的原理构建重组病毒,可以实现外源基因的高水平表达。然而,目前虽已经有较多文献研究多角体蛋白高水平表达的分子机制,但迄今对于多角体蛋白基因编码区的结合蛋白尚不明确。本研究通过DNA pull-down联合质谱技术对结合在多角体蛋白编码区的蛋白质进行鉴定,共鉴定到78个宿主来源的蛋白和49个病毒自身编码的蛋白。对这些蛋白进行GO注释,结果表明这些蛋白除了具有共同的核酸结合功能外,还有其他不同的生物学功能,共同在多角体蛋白的超高水平表达过程中发挥作用。进一步从上述蛋白中筛选出了最值得深入研究的9个宿主蛋白和10个病毒蛋白。对这些蛋白进行深入研究,将为深入揭示多角体蛋白超高水平表达的分子机制提供新的线索。     

家蚕核型多角体病毒酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因核苷酸序列分析

从家蚕核型多角体病毒中国镇江株 (BmNPV ZJ)基因组DNA中克隆出酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因 (ptp) ,该基因的编码部分由 5 0 7个核苷酸组成 ,其中A为 16 3、C为 99、G为 113、T为 132 ,G +C含量约为 4 2 %。根据其核苷酸序列推演的蛋白质由 16 8个氨基酸残基组成 ,其中含有酪氨酸蛋白磷酸酯酶催化活性区的 11个氨基酸“HC”基序。该基因与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV)ptp和BmNPV T3株 (日本 )的ptp核苷酸序列的同源性分别为 96 8%和 98 2 %。BmNPV ZJ酪氨酸蛋白磷酸酯酶 (BmNPV ZJPTPase)的氨基酸全序列与AcMNPV、BmNPV T3、芹菜夜蛾核型多角体病毒 (AfMNPV)PTPase和黄杉毒蛾核型多角体病毒 (OpMNPV)PTPase 1的氨基酸全序列的同源性分别为 97%、97 6 %、96 %和 6 0 % ,而与OpMNPVPTPase 2的同源性仅为 2 0 %。在NCBI数据库中查找BmNPV ZJPTPase的同源性序列 ,查找到的 5 99381个序列中发现至少有 14种mRNA加帽酶其N端部分存在PTPase催化活性区的“HC”基序 ,但其氨基酸全序列的同源性只有 31%～ 32 %。该基因序列已被GenBank数据库收录 ,登录号为AF316 871     

利用双色荧光观察分析重组家蚕杆状病毒对昆虫细胞及蚕体组织的感染

尝试将红色荧光蛋白(RFP)作为昆虫表达体系的分子标签,克隆了rfp基因的读码框,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将该基因插入家蚕核型多角体病毒(BmNPV)中,获得重组杆状病毒BmNPV-rfp。对家蚕细胞的感染表明,rfp适于在昆虫细胞中表达,在显微镜下红色荧光很明显,说明RFP可以作为杆状病毒表达的分子标签。BmNPV-rfp和另一种插入绿色荧光蛋白基因gfp的家蚕重组杆状病毒BmNPV-gfp混合感染家蚕细胞和幼虫的实验表明,二者的荧光很少在同一细胞中发生重叠,说明昆虫细胞大多只感受1次同一来源的病毒。BmNPV-rfp、BmN-PV-gfp与AcNPV混合感染Sf21细胞的结果也证明了该推断,并且还显示AcNPV可以协助BmNPV来源的病毒基因在Sf21细胞中表达以及协助病毒增殖或产生杂交病毒,但尚未明确其机制。     

柞蚕卵巢细胞原代培养及对核型多角体病毒的敏感性

对柞蚕卵巢细胞采用原代培养法,经6—7天形成细胞单层。对培养2周以上的细胞单层,进行柞蚕核型多角体病毒的感染试验,经2—3天可见部分细胞核内形成多角体,约半月感染率达60％左右。     

家蚕核型多角体病毒增殖关键基因的鉴定

选择家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)基因组中可能与病毒增殖相关的8个基因dbp、lef-2、lef-3、lef-7、lef-10、lef-11、p143和vp1054作为候选基因,利用家蚕内源性microRNA骨架构建候选基因的干扰载体,并采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对上述候选基因进行干扰试验,筛选病毒增殖的关键基因,以期为开辟家蚕抗Bm NPV研究新路径打下基础。对8个候选基因的RNA干扰试验显示:干扰lef-7对Bm NPV的增殖没有明显影响;对lef-2和lef-11表达的干扰效率最高,达到90%以上,其中干扰lef-11后病毒对细胞的感染率仅为9.16%,远远低于对其他基因干扰后的感染率。依据试验结果初步确认8个病毒增殖相关基因中,lef-11对病毒增殖的影响最大。     

马疱疹病毒1型gD囊膜蛋白互作蛋白的鉴定分析

旨在筛选并分析与马疱疹病毒1型(EHV-1)gD囊膜蛋白相互作用的宿主蛋白。用免疫共沉淀和LCMS/MS质谱技术鉴定出与EHV-1 gD囊膜蛋白互作的宿主蛋白,并进行生物信息学分析。免疫共沉淀联合质谱分析鉴定到229个与EHV-1 gD囊膜蛋白互作的宿主蛋白,对蛋白功能分析发现大多数蛋白与形成细胞骨架有关,细胞骨架不仅能支撑细胞形态,还参与物质运输,结果提示有部分蛋白参与囊泡运输并在其中发挥重要作用,还存在与囊泡形成直接相关的蛋白——网络蛋白重链,为探究EHV-1二次囊膜化的形成过程和研究gD囊膜蛋白与囊泡间的关系奠定了基础。     

昆虫质型多角体病毒与杆状病毒多角体的结构比较

依据已有的研究结果,分析比较昆虫质型多角体病毒和杆状病毒多角体的结构差异。2种病毒都产生多角体,其中质型多角体病毒多角体的原子结构展现一个错综复杂的三聚体组装,即通过多角体蛋白分子突出的N-端螺旋臂互相连接在一起;杆状病毒和质型多角体病毒的多角体晶体相似,蛋白序列的N-末端也是α-螺旋。由此表明这2种病毒的多角体蛋白及其共同结构基础具有同源性。但一些研究表明质型多角体病毒和杆状病毒的多角体基础分子组织形成不同。尽管这2种病毒多角体含有相近的结构单位及共有对称方式,但是多角体分子在结构上差别较大,在晶体内的组装形式也不同,特别是二硫键和N-端区域的区域交叉使杆状病毒多角体的晶体构造稳定坚固,C-端臂使其结构单位相互连接在一起。有研究表明N-末端螺旋突出臂在杆状病毒和质型多角体病毒中也具有不同的结构功能,但目前并没有结构方面的证据证明这2种病毒多角体具有共同的进化起源。     

利用家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统在BmN细胞中可溶性表达PRG-1蛋白

杆状病毒Bac-to-Bac表达系统由于操作简便等优点,被广泛应用于外源蛋白的表达。利用新构建的家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac系统可溶性表达一个大分子质量的融合蛋白———piwi相关基因编码蛋白PRG-1。为了提高目的蛋白的表达量,对重组病毒感染剂量及产物收获时间进行优化,并利用GST亲和层析纯化融合蛋白。结果表明在家蚕卵巢培养细胞BmN中表达的重组GST-PRG-1是可溶性蛋白;最佳的感染条件是病毒粒子对BmN细胞的感染复数(MOI)=1,并在感染后96 h收获细胞。试验结果表明,新构建的家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统可用于大分子蛋白的可溶性表达。     

斜纹夜蛾核型多角体病毒的研究与应用

斜纹夜蛾属鳞翅目夜蛾科,是世界性分布的暴食性害虫,为害十字花科、茄科、葫芦科、豆科及粮、棉等99科290多种农作物.斜纹夜蛾食性广,繁殖快,长江中下游地区在20世纪90年代以来几乎连年暴发成灾,已成为十字花科蔬菜、城市绿化地花草的最主要害虫之一.斜纹夜蛾在桑树上间歇暴发为害,严重影响蚕桑生产.长期以来化学药剂的大量使用,不仅使害虫的抗药性增强,而且对生态环境带来了很大影响.在桑树上应用农药防治,更易引起家蚕中毒,造成蚕茧减产.