鹅源新城疫病毒F基因和HN基因的克隆及序列分析

为了解近年鹅群中新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的流行变异情况,试验于2018年从广东地区疑似患有新城疫病死鹅的病料中分离到1株NDV,对其进行了生物学毒力测定及致病性研究,并利用RT-PCR技术扩增该分离株F基因和HN基因全长片段,进行克隆与序列分析。结果表明:分离株GD299的生物学毒力指标鸡胚平均致死时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内致死指数(ICPI)和6周龄静脉接种指数(IVPI)分别为58 h、1.56和2.2,F基因裂解位点为112R-R-Q-K-R-F117,GD299株为强毒株;F基因和HN基因核苷酸序列和氨基酸序列与参考毒株的同源性为82.9%～99.5%,属于基因群Ⅶ型,其中F基因属于Ⅶf亚型;与经典强毒株La Sota株、F48E9株氨基酸序列进行比较,F基因氨基酸序列出现多处位点变异。说明目前流行的NDV已发生一定变异。     

一株鸵鸟胚源新城疫病毒生物学特征和遗传发生分析

从死亡的鸵鸟胚胎中分离到1株新城疫病毒毒株,经毒力检测为强毒株,鸡胚平均死亡时间为45h,IVPI为2.90,IPCI为1.88.RT-PCR扩增出融合蛋白(F)基因,测定核苷酸序列并进行遗传发生分析和酶切位点分析.对基因编码的氨基酸序列进行了推导,该毒株的蛋白酶裂解激活位点附近的氨基酸序列为112R(K)RQKR↓F117,为强毒特征序列,然而该毒株并未引起该鸵鸟群发病.根据绘制的系统进化发生树和F基因上3种限制性内切酶(RE)位点分布,确定该毒株均为基因Ⅶ型.该病毒与在我国鸡群、鹅群同期流行的毒株有很高的同源性.     

3株鹅源新城疫病毒的分子特征和遗传发生分析

2005年分离的3株鹅源新城疫病毒毒株经毒力（MDT）检测为强毒株，鸡胚平均死亡时间为48～60h。RT—PCR扩增出了融合蛋白（F）基因，测定相应的核苷酸序列并进行遗传发生分析和酶切位点分析。对基因编码的氨基酸序列进行了推导，3个试验毒株的蛋白酶裂解激活位点附近的氨基酸序列均为112R（K）RQKR↓F117，为强毒特征序列。根据绘制的系统进化发生树和F基因上3种限制性内切酶（RE）位点分布．确定了这3个毒株均为基因Ⅶ型。以上证据表明该基因型的新城疫病毒在我国鹅群的流行占据一定优势。     

鹅源新城疫病毒的分离鉴定及其致病性

从吉林省某发病鹅场分离到1株病毒,经血凝、血凝抑制试验和RT-PCR鉴定证实,该毒株为新城疫病毒,命名为MHK-1株.毒力测定结果表明,该病毒的鸡胚平均死亡时间(MDT)为43 h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.63,鸡胚半数致死量(ELD50)为10-8.3/0.2 mL,表明该毒株为新城疫病毒强毒株.经致病性试验表明,该病毒对鹅有很强的致病性.分子病毒学分析表明,MHK-1株F基因裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株氨基酸序列特点.     

鸡新城疫病毒新疆分离株F基因遗传进化分析

对2株分离自新疆乌鲁木齐市的鸡源新城疫病毒F基因进行了扩增、序列测定和分析.结果显示,该2株新城疫病毒F基因核苷酸序列长度分别为1586 bp和1654 bp,分别编码520和545个氨基酸；氨基酸裂解位点的序列均为112R-R-Q-K-R-F117,具备了基因Ⅶ型强毒株的特征；同源性分析表明,该2株新城疫病毒分离株与...     

一株新城疫病毒的分离鉴定及其F基因的克隆与序列分析

本试验对山东某鸡场发生疑似新城疫感染的肉鸡分离得到的一株病毒,经鸡红细胞血凝、血抑试验和动物回归试验,结果表明,该分离株为新城疫病毒。对其毒力学指标进行测定,结果MDT为55.6h,ICPI为1.95,IVPI为2.85,表明该毒株为新城疫强毒株。PCR特异性扩增NDV-SD-02的F基因,大小为1662bp,编码553个氨基酸,F基因裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株氨基酸序列的特点,与生物学特性测定的结果完全相符。对分离株F基因的序列分析表明,与近年来国内外分离得到的Ⅶ型NDV同源性较高,为84.7%~98.9%,该毒株属基因Ⅶ型。     

一株基因Ⅱ型新城疫病毒的检测及HN、F基因序列分析

为了掌握辽宁省新城疫病毒(NDV)的分布特点,试验采用新城疫荧光RT-PCR方法检测到1株新城疫病毒,通过接种鸡胚分离鉴定后将其命名为CK/YK1/2013,通过PCR扩增得到HN、F基因全长片段并测定了基因序列。结果表明:该毒株可以使接种鸡胚在38 h内死亡,具备强毒株的生物学特性。CK/YK1/2013的F基因在裂解位点的氨基酸序列为111GGRQGRL117,与弱毒株LaSota序列相同,与其他已知强毒株的裂解位点不同。CK/YK1/2013的HN、F基因与Ⅱ型LaSota毒株的同源性为99.6%,与F48E9及Ⅶ型的同源性分别为89.1%和83.0%,基因进化树分析表明该毒株属于Ⅱ型NDV。     

鸡新城疫病毒的分离与鉴定

应用鸡胚接种技术从南宁市郊区一个疑似发生新城疫鸡群采集的样品中分离到一株病毒,经对分离毒株进行血凝试验、血凝抑制试验和RT-PCR鉴定,结果表明分离的毒株为新城疫病毒;对分离株进行毒力测定、致病性试验及对包含裂解位点的F基因部分片段的序列进行测定与遗传进化分析。结果表明,毒株对鸡胚平均致死时间为62.6 h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数为1.56,30日龄易感鸡攻毒后2 d开始出现明显的临床症状,攻毒后5 d内全部死亡,表明该分离株属新城疫强毒株,F基因裂解位点氨基酸基为112RRRKRF117,F基因遗传进化分析发现该毒株属于基因Ⅶ型,与同年从广西发病的白鹭分离的新城疫毒株亲缘关系较近。     

鸭源新城疫病毒TH-1株的分离鉴定及遗传进化分析

试验从吉林省通化某地发病死亡鸭子病料中分离到1株具有血凝性的病毒,通过血凝试验、血凝抑制试验、血清中和试验及融合蛋白(F)基因的扩增测序,初步鉴定为新城疫病毒,命名为TH-1株。该病毒鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)及6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)分别为53.4 h、1.85和2.575,表明该新城疫病毒为强毒。F蛋白多肽裂解位点为112-RRQKRF-117,符合新城疫强毒株裂解位点氨基酸序列,进一步证明该毒株为新城疫强毒株。F基因核苷酸及氨基酸同源性比对发现,TH-1株与中国野鸭源新城疫病毒分离株mallard China HLJ株的同源性最高,核苷酸同源性达到了99.3%,同为新城疫基因Ⅶ型毒株,与目前新城疫流行的主要基因型Ⅶ型相一致,为鸭源新城疫的有效防制提供了理论基础。     

新城疫病毒ShD-5-04株F基因和HN基因序列分析

从山东潍坊某非典型新城疫发病鸡群中分离到一株新城疫病毒(暂命名:ShD-5-04),其生物学特性表明该病毒具有新城疫强毒株的一些特征。通过RT-PCR特异性地扩增出F和HN基因序列,并对其进行核苷酸序列测定和分析,结果表明ShD-5-04株的F和HN基因开放性阅读框架(ORF)为1662bp和1716bp,分别编码489个和571个氨基酸,与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84.1%～88.7%之间,氨基酸同源性在88.1%～93.3%之间;HN基因核苷酸序列的同源性在82.1%～87.4%之间,氨基酸同源性在88.6%～90.9%之间;F蛋白裂解位点区(112-117)氨基酸组成与强毒株一致,说明NDV山东分离株(ShD-5-04)为新城疫强毒株。     

一株鸡新城疫强毒株的分离及生物学特性鉴定

本试验应用一步法RT-PCR和荧光RT-PCR方法分离到一株新城疫病毒,并对此毒株F基因进行了克隆、测序和分析,发现F蛋白裂解位点氨基酸序列为112Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe117,与新城疫病毒强毒株特征相符,从分子水平上证明了本试验所分离毒株为新城疫强毒株。结合GenBank中其他新城疫参考株F基因序列进行比较发现,本试验所分离毒株与目前流行的强毒株Taiwan/95、SKY/03、SGM/01的F基因裂解位点氨基酸序列完全一致,而与传统疫苗毒La Sota株的裂解位点则不同。     

鹅源新城疫病毒自然弱毒株的分离与鉴定

从江苏省某健康鹅群分离并筛选出一株病毒,经鸡胚传代培养和血清学试验,证明该毒株为新城疫病毒。应用电镜技术、生物学特性检测对其进行鉴定,结果表明:该毒株MDT为146.4h,ICPI为0.375,参照判定标准,确定该毒株为NDV弱毒株。通过RT-PCR方法,扩增出该毒株F基因,并进行克隆和序列测定,其F蛋白裂解位点的序列为112G-K-Q-G-R-L117,符合典型的NDV弱毒株的特征,从基因和分子水平上进一步证明该毒株为NDV弱毒株,通过绘制的系统发育进化树进行分析,表明该毒株为F基因Ⅰ型新城疫病毒,并将该毒株暂命名为G0405。     

一株基因Ⅵ型鸭新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

以一株鸭新城疫病毒NDV-SS分离株基因组RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增其F基因,并进行克隆和序列测定。通过序列分析软件将该毒株F基因氨基酸推导序列与GenBank上已发表的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)F基因相关代表序列进行同源性及遗传进化关系分析。测序结果表明,NDV-SS株F基因全长1662bp,编码553个氨基酸,其蛋白裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合NDV强毒株特有的序列结构特征。同源性及遗传进化关系分析结果表明,NDV-SS株为基因Ⅵ型毒株,与鸽源新城疫IT-227、Italy-2736分离株具有较高同源性和较近的亲缘关系,推测其可能是由鸽源新城疫病毒变异所产生的。     

一株基因Ⅶb亚型新城疫病毒F和HN基因的序列分析

为分析从某鹅病料样品中分离鉴定的一株新城疫病毒(NDV) (Goose/Foshan/2010)F和HN基因的序列特征,本研究采用RT-PCR方法扩增该病毒的F和HN基因的ORF序列,并进行序列测定.经序列比对、进化分析表明,Goose/Foshan/2010株属于基因Ⅶb亚型病毒株,F蛋白裂解位点序列为112RRQKRF117,-HN蛋白由571个氨基酸残基组成,具有强毒株分子特征.对F和HN蛋白分析表明,其HN蛋白存在E347D和K495E两个点突变;此外,HN蛋白缺失了538位～540位的糖基化位点.该分离株为我国首次报道的鹅源基因Ⅶb亚型NDV分离株,与秘鲁及马来西亚早期基因Ⅶb亚型分离株进化关系密切,表明我国目前新城疫的流行情况十分复杂.     

新城疫病毒ShD-5-04株F基因的克隆与毒力分析

通过RT-PCR特异性扩增出新城疫病毒(NDV)山东分离株(ShD-5-04)的F基因序列,对其进行核苷酸序列测定和分析.结果表明,ShD-5-04株的F基因开放性阅读框为1 662 bp,编码489个氨基酸.与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相同序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84.1%～88.7%之间,氨基酸同源性在88.1%～93.3%之间;F蛋白裂解位点区(112位～117位)氨基酸组成与强毒株一致,从基因水平上说明NDV ShD-5-04株为新城疫强毒株.     

鸡新城疫病毒SXWN株的分离鉴定与基因分型

为了调查陕西省渭南市某鸡场新城疫高抗体蛋鸡群出现产蛋率下降及神经症状的原因,试验采用鸡胚接种、血凝-血凝抑制试验和RT-PCR技术对其进行了研究。结果表明:分离得到一株新城疫病毒,命名为SXWN株;对SXWN株进行毒力测定,鸡胚半数致死量(ELD 650)为1×108./0.1 mL,鸡胚最小致死量的平均致死时间(MDT)为52 h;通过F基因主要功能区片段克隆测序发现,SXWN株与我国常用的疫苗B1、La Sota株的核苷酸同源性仅为83.4%和83.7%,相应的氨基酸序列同源性均为85.4%;进化树分析发现,SXWN株属于基因Ⅶ型毒株;F蛋白裂解位点为112RRQ↓KRF117,符合新城疫强毒株的裂解位点特征。说明分离得到的SXWN株为基因Ⅶ型新城疫强毒株。     

鸡副黏病毒YM毒株F基因的克隆及遗传进化关系研究

近年来,我国相继有新城疫强毒株出现的报道,为分析这些强毒株与疫苗株之间的遗传进化关系,研究新城疫的流行病学特点,文章以华中农业大学病毒室分离的YM毒株基因组RNA为模板,利用RT-PCR扩增F基因的cD-NA,将其连接入pMD18-T载体,经筛选证明已获得鸡副黏病毒YM毒株F基因的阳性克隆子。核苷酸序列和氨基酸序列分析表明,YM毒株属于NDV基因Ⅶ型强毒株;F蛋白氨基酸序列与中国标准强毒株F48E9 F蛋白氨基酸序列同源性为86％,与弱毒疫苗Lasota／46株氨基酸序列同源性仅为83％,证明为变异株,且其重要的抗原位点343位氨基酸由Leu→Pro,免疫原性发生了较大变化。从基因进化树也可见,其与中国标准强毒株F48E9,弱毒疫苗Lasota／46株的进化关系较远,这从分子角度解释了为什么高免的鸡仍然暴发新城疫。     

一株鸭新城疫强毒的分离鉴定和分子特性分析

从山东地区发病鸭中分离到一株新城疫病毒(SDLP09),经测定,其鸡胚半数致死量(ELD50)、鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)、6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)分别为107.84/0.1 mL、48.5 h、1.80、2.36,表明该新城疫病毒为强毒.通过分析其融合蛋白(F)发现,F蛋白多肽裂解位点为112RRQKRF117,符合NDV强毒株裂解位点氨基酸序列.F基因分型及氨基酸同源性比较发现,SDLP09株属于基因Ⅶ型,与野鸭源强毒NDV同源性更高,提示着该毒株可能来源于野鸭.     

一株基因Ⅱ型新城疫病毒的分离及基因组分析

本研究从2008山东表现神经症状的某新城疫疫苗免疫鸡群中分离到一株病毒。通过鸡红细胞凝集试验和血凝抑制试验,表明为新城疫病毒,将其命名为ck/CH/LSD/08-29。根据GenBank上登录的新城疫病毒基因组序列,设计14对引物经过RT-PCR扩增病毒感染的尿囊液,同时应用3'-RACE和5'-RACE技术,扩增得到该病毒全部基因组序列。结果表明,该毒株基因组由15186个核苷酸序列组成,编码6种结构蛋白,在RNA上的顺序依次为3'-NP-P-M-F-HN-L-5'。F基因裂解位点处的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株氨基酸序列特点。通过F基因裂解位点附近高变区389个核苷酸序列构建遗传进化树,证明该毒株在分类地位上属于基因Ⅱ型。此外,病毒感染SPF鸡试验证明ck/CH/LSD/08-29毒株属于强毒嗜神经型毒株,能引起SPF鸡高致死率。     

两株新城疫病毒山东分离株的克隆及遗传变异分析

本试验根据已发表的新城疫病毒(NDV)的F基因序列设计特异性引物,对山东地区两株NDV流行株的F基因进行了克隆与序列分析,分别扩增到了A株和B株F蛋白编码区全基因,ORF全长均为1662bp。应用分子生物学软件对A株和B株的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了分析。两毒株核苷酸序列同源率为87%,都编码553个氨基酸,氨基酸同源率为91%。与部分已发表的毒株相比:A株与～株同源率最高,为98%,B株与JS鹅株同源率最高,为98%。抗原位点、糖基化位点的数量和位置高度保守,半胱氨酸残基数量不同,A株13个,B株12个。分离株都具有3个强疏水区。A株、B株裂解区氨基酸序列符合强毒株特点,二者均为强毒株。从基因分型情况看,A株属于基因Ⅸ,B株属于基因Ⅶ。A株与F48E9株遗传距离最近,B株与JS鹅株遗传距离最近。