家蚕丝素P25蛋白的多克隆抗体制备与应用

P25蛋白是家蚕(Bombyx mori)丝素蛋白的主要成分之一。根据BmP 25基因ORF序列设计引物,以家蚕5龄第3天丝腺cD NA为模板,RT-PCR扩增获得BmP 25的ORF全长片段。将构建的含BmP 25的原核表达重组质粒转化大肠埃希菌Rosetta(DE3)菌株感受态细胞,对家蚕丝素P25蛋白进行重组表达和纯化,并免疫家兔制备获得多克隆抗体,用于研究家蚕丝腺中P25蛋白的合成和分泌规律。利用制备的多克隆抗体对家蚕品种大造5龄第3天幼虫9个组织的总蛋白质样品进行Western blot检测,结果在中部丝腺和后部丝腺检测到P25蛋白,表明该抗体有较好的特异性。进一步利用此多克隆抗体分别对家蚕5龄第5天幼虫中部丝腺和后部丝腺不同区域进行荧光免疫组化分析,结果在后部丝腺的细胞和腔内观察到明显的荧光信号,而中部丝腺后部的细胞仅有微弱信号,腔内的荧光信号强度随着丝素蛋白的从后向前运输越来越弱,以致在中部丝腺的前部和中部未检测到荧光信号。推测可能是P25蛋白在丝素蛋白从溶胶状态到凝胶状态的转化过程中,被逐步包裹在丝素蛋白聚合物中导致其不能被检测到。利用该多克隆抗体对家蚕不同品种的茧丝蛋白进行Western blot检测,均能获得特异性的杂交条带,表明该抗体还可用于家蚕茧丝及丝制品的分子检测鉴定,为开发丝制品的检测试剂盒提供了条件。     

家蚕丝腺因子SGF-1的基因克隆及序列结构和表达特征与亚细胞定位

Fox类转录因子在细胞生长、增殖、分化和胚胎发育等过程中发挥重要功能,SGF-1是家蚕丝腺细胞转录因子,属于Fox类转录因子家族。家蚕SGF-1(BGIBMGA005101-TA)基因位于第25号染色体nscaf2823:112743~113792(+strand),含有1个外显子,CDS全长1 050 bp,编码349个氨基酸。家蚕品种大造5龄第3天幼虫的基因芯片表达谱显示,SGF-1基因在大多数组织中有表达,在丝腺中高量表达,其中在前部和中部丝腺的表达量略高于后部丝腺,在雄蚕中的表达量略高于雌蚕。氨基酸组成分析显示,SGF-1蛋白富含脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸和亮氨酸,且多数为亲水性氨基酸。序列结构分析表明,SGF-1包含典型的Forkhead结构域,其两端分别为Forkhead_N末端结构域和HNF3_C末端结构域,其中大多数氨基酸残基形成了无规则卷曲结构,α-螺旋与β-折叠结构分别约占18.0%和0.6%。从家蚕后部丝腺克隆了SGF-1基因,并构建麦芽糖结合蛋白标签融合表达载体,表达并纯化了重组SGF-1蛋白。通过RT-PCR与Western blotting检测分别从基因转录水平和蛋白质表达水平上证实,SGF-1在家蚕5龄第3天幼虫丝腺中高量表达。亚细胞定位实验显示SGF-1定位于细胞核中。这些结果为深入研究SGF-1的结构和功能提供了有益的基础信息。     

家蚕丝素基因表达水平的定量分析

采用实时定量RT-PCR方法,对丝素轻链基因(fib-L)、丝素重链基因(fib-H)、P25基因在家蚕幼虫不同组织和不同发育时期的表达进行了定量分析。结果发现3种丝素基因除主要在5龄幼虫的后部丝腺中表达外,在其它组织如脂肪体和中部丝腺中也有一定程度的表达;在4龄眠期的后部丝腺中3种丝素基因也有一定的表达水平,其中fib-L在这一时期的表达量较高。同时发现在5龄第3天和第5天的后部丝腺中,fib-H、fib-L与P25在mR-NA水平上的摩尔比分别为9∶18∶1和19∶32∶1,推测丝素基因的表达可能具有转录后调控,此结果说明家蚕丝素基因的表达可能具有更加精细的调控机制。     

麝鼠繁殖期与非繁殖期PIK3IP1基因表达分析

麝鼠(Ondatra zibethicus)是一种重要的经济动物,繁殖期时香腺快速发育并分泌麝鼠香,但其香腺发育和泌香调控机制至今尚未阐明。磷脂酰肌醇3激酶相互作用蛋白1(PI3Kinteracting protein1,PIK3IP1)是PI3K/AKT通路重要的调控蛋白。本研究通过总RNA提取、反转录和qPCR等技术,研究PIK3IP1基因在麝鼠繁殖期与非繁殖期香腺、睾丸、心、肺、肝、肾、肌肉等组织中mRNA的表达情况,并分析表达水平的差异。结果显示,PIK3IP1基因在繁殖期和非繁殖期7个组织中均有表达。在香腺、睾丸、肺、肝中,繁殖期表达量高于非繁殖期,其中香腺组织表达差异极显著(P0.01)。其他组织无明显差异(P≥0.05)。因此推测PIK3IP1基因可能通过PI3K/AKT信号通路在香腺发育和泌香过程中起到了重要调控作用。     

不同产丝量家蚕品系后部丝腺的蛋白质组学分析

家蚕幼虫后部丝腺是合成和分泌丝素蛋白的重要器官。为从蛋白质水平探究不同家蚕品系产丝量差异的原因,应用蛋白质组学研究方法,选取3个产丝量有较大差异的家蚕品系Ndx、大造和21-872为材料,通过双向电泳和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对各品系5龄第5天幼虫后部丝腺表达的差异蛋白进行鉴定,查找与丝蛋白合成相关的蛋白质。结果表明,茧丝突变品系Ndx后部丝腺的蛋白质表达水平与普通丝量品系大造和高丝量品系21-872有差异,差异表达蛋白种类主要为应激反应相关蛋白、能量相关蛋白、蛋白质合成相关蛋白和一些酶类,其中核糖体磷酸化蛋白P0和P2、蛋白质二硫化物异构酶、丝素轻链蛋白Fib-L以及丝素蛋白P25等在Ndx后部丝腺的含量明显低于其它2个品系。推测在茧丝突变品系Ndx的后部丝腺中,上述蛋白质表达量的变化可能是导致其不能正常吐丝结茧的原因。     

用保幼激素和蜕皮激素处理离体培养家蚕丝腺对丝蛋白基因表达的影响

蜕皮激素(20E)和保幼激素(JH)具有共同调控家蚕丝蛋白合成的作用。将家蚕5龄第3天幼虫的中部和后部丝腺置于含不同浓度20E或JH的培养基中进行离体培养,于培养不同时间通过定量PCR检测丝素蛋白基因及丝胶蛋白基因的表达变化。结果表明,蜕皮激素处理对丝蛋白基因表达的影响,因激素使用剂量和作用时间不同而异;保幼激素处理会抑制丝蛋白基因的表达,尤其对丝素蛋白重链基因Bmfib-H的表达抑制作用更为明显,50 ng/m L JH处理48 h后Bmfib-H的表达水平下调1倍左右;蜕皮激素和保幼激素共同处理比单一激素处理更有助于丝蛋白基因的表达,但用保幼激素先处理丝腺24 h后再用蜕皮激素和保幼激素共同处理,会显著抑制丝素蛋白轻链基因Bmfib-L的表达。试验在排除蚕体内源激素干扰的条件下,从转录水平初步分析了保幼激素和蜕皮激素对家蚕丝蛋白基因表达的调控机制。     

表达Ⅰ型类人胶原蛋白和脯氨酰4-羟化酶α-蛋白的转基因家蚕品系构建

家蚕丝腺具有高效合成与分泌蚕丝蛋白质的能力,探究利用转基因方法开发家蚕丝腺为生物反应器生产高附加值外源蛋白质的技术途径。将Ⅰ型类人胶原蛋白基因(HCool-Ⅰ)和胶原蛋白羟基化修饰所必需的脯氨酰4-羟化酶α-亚基基因(BmP 4Hα)通过piggyB ac转座子及显微注射方法,同时转入家蚕早期胚胎,在丝素轻链基因fib-L启动子驱动下转入的2个外源基因在家蚕幼虫后部丝腺获得表达。利用反向PCR和生物信息学等方法鉴定、分析转基因家蚕基因组中有19个外源piggyB ac的整合位点,分别位于基因的外显子区域、内含子区域和基因间区,可定位至家蚕的15条染色体上。实时荧光定量PCR检测不同整合位点的转基因家蚕品系幼虫后部丝腺中HCool-Ⅰ基因mRNA转录量存在极显著差异,转录量最高和最低的品系间相差23倍左右;转基因家蚕后部丝腺中BmP 4Hα基因mRNA的转录量比野生型家蚕高出2万多倍。利用SDS-PAGE检测转基因家蚕G3代5龄5 d幼虫的后部丝腺总蛋白质在55 kD和64 kD处分别存在特异性蛋白条带,表明BmP 4Hα和HCool-Ⅰ蛋白已在G3代转基因家蚕丝腺中获得表达。     

家蚕丝腺发育相关基因Bmsage缺失突变体的RNA-seq分析

Bmsage是在家蚕丝腺中特异表达的基因,之前的研究明确其对丝素重链基因fib-H转录具有调控作用。在开展Bmsage功能的研究中,运用CRISPR/Cas9基因敲除系统,获得了Bmsage缺失的纯合突变体家蚕,其表型特征是幼虫的丝腺异常发育,缺失中部丝腺和后部丝腺。以Bmsage缺失型家蚕及正常型家蚕产下后5 d的卵为材料,应用RNA-seq测序技术在转录水平上获得194个差异表达基因。对Bmsage缺失型家蚕突变体胚胎期的这些差异表达基因进行GO功能注释,结果显示:Bmsage基因缺失后,对家蚕生理功能的影响主要集中在一些细胞组分,如与肌肉功能相关的肌球蛋白基因和肌钙蛋白基因都明显上调表达,与碳水化合物代谢相关的基因如多种凝集素基因和糖苷酶基因,除个别下调表达外,其余均上调表达;排在前10的GO term中,出现较多的是与几丁质分解代谢相关的几丁质酶基因和多种丝氨酸蛋白酶抑制剂基因。KEGG信号通路分析显示:差异基因主要与一些糖类、脂类和氨基酸的代谢的信号通路相关,其中又以糖类代谢为主,如半乳糖代谢、糖胺聚糖降解及氨基糖和核苷酸糖代谢,所以Bmsage可能参与了多个糖类代谢途径;在差异基因中,与丝腺发育关系最大的是几丁质酶基因、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因和丝氨酸蛋白酶抑制剂基因,以及一些转运RNA基因(如TRNAE-CUC、TRNAN-GUU、TRNADGUC和TRNAV-GAC)。因此推测Bmsage可能通过复杂的调控网络,参与了丝腺组织的分化与形成过程。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin16的表达规律及体外重组表达

家蚕(Bombyxmori)的丝腺是丝蛋白合成分泌的场所,存在多种丝氨酸蛋白酶抑制剂。为探究家蚕丝蛋白的合成和保护机制,采用半定量RT-PCR的方法调查家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin16在家蚕不同发育时期和5龄第5天幼虫各个组织器官中的表达特征,结果表明家蚕serpin16基因仅在4眠-5龄第6天的发育期表达,并且仅在丝腺中特异表达,其中在中部丝腺前区转录水平最高,而在中部丝腺中区和后区的转录水平较低;进一步构建pGEX-4T-1-serpin16原核表达载体,并转化至大肠杆菌(Eschevichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导获得融合蛋白,纯化后得到单一的目的蛋白。家蚕serpin16基因在幼虫丝腺的特异表达模式提示其可能与家蚕的吐丝过程密切相关,推测该基因在维持丝腺稳定的泌丝环境中发挥重要作用。     

家蚕丝胶基因的表达与调控

家蚕丝腺在胚胎期分化完成以后,就已经能够合成和分泌液状丝物质,但直到5龄第3日以后才开始大量合成和分泌丝蛋白(丝素和丝胶),其中中部丝腺合成和分泌丝胶蛋白,后部丝腺合成和分泌丝素蛋白.家蚕丝蛋白基因的这种时间特异性和组织特异性表达现象,引起了众多研究者的兴趣.这种表达模式目前已经成为真核细胞基因表达调控研究的理想模式,正在被广泛和深入地研究.     

奶牛脐带间充质干细胞介导PI3K/Akt/mTOR信号通路对乳腺上皮细胞凋亡调控研究

本实验旨在探究脐带间充质干细胞(UC-MSCs)介导磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路对乳腺上皮细胞(BMECs)凋亡的调控作用。将处于对数生长期的UC-MSCs与BMECs按照1:2的比例混合共培养72 h,对照单独培养的UC-MSCs和BMECs,再分别用PI3K抑制剂LY294002(50μmol/mL)和mTOR抑制剂RAPA(50 nmol/mL)孵育细胞48 h,采用流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况。结果表明:将UC-MSCs与BMECs共培养,能够显著抑制BMECs细胞凋亡,加入PI3K抑制剂LY294002和mTOR抑制剂RAPA孵育BMECs后,极显著地促进了BMECs细胞凋亡(P0.01),但是与UC-MSCs共培养后,这种抑制作用明显得到抵消。UC-MSCs通过介导PI3K/Akt/mTOR信号通路参与调控BMECs的凋亡;抑制剂LY294002和RAPA通过阻断PI3K/Akt/mTOR通路促进BMECs凋亡。综上可知,UC-MSCs能够激活被阻断的PI3K/Akt/mTOR信号通路,使其重新参与调控BMECs。     

Bmo-miR-2771对家蚕丝胶蛋白基因BmSer-1表达的调控作用

微小RNA(miRNA)可通过抑制mRNA转录或使RNA降解的方式在转录后水平调节靶基因的表达。研究与家蚕丝胶蛋白基因1(BmS er-1)转录后表达有关的miRNA(Bmo-miR)及其作用方式,以丰富丝胶蛋白基因表达的精细调控信息。首先从miRBase 21数据库中获得全部成熟体Bmo-miR,通过生物信息学分析筛选到一个对BmS er-1有潜在调控作用的BmomiR,命名为Bmo-miR-2771。设计茎环引物,采用半定量RT-PCR方法检测Bmo-miR-2771及其预测靶基因BmS er-1在家蚕5龄3 d幼虫头部、脂肪体、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺、中肠等组织器官以及血淋巴细胞中的表达水平,结果显示Bmo-miR-2771特异性地在中部丝腺中表达,并且靶基因BmS er-1在中部丝腺的相对表达量也明显高于其他组织。将构建的表达BmomiR-2771的重组质粒pcD NA3.0(ie1-egfp-pri-miR-2771-SV40)和表达BmS er-1 3'-UTR的重组质粒pG L3(A3-luc-Ser-1 3'UTRSV40)共转染家蚕卵巢培养细胞BmN,并以共转染pcD NA3.0(ie1-egfp-SV40)和pG L3(A3-luc-Ser-1 3'UTR-SV40)的BmN细胞为阳性对照,以海肾荧光素酶表达载体pRL-CMV为内参,检测荧光素酶活性,结果显示实验组的荧光素酶活性相对于阳性对照组显著降低(P0.05),从细胞水平证实了Bmo-miR-2771对BmS er-1基因表达具有负调控作用。     

家蚕高蛋白血症模型建立及其丝腺细胞凋亡的特点研究

以阻止熟蚕吐丝的方法建立家蚕高蛋白血症模型,研究模型家蚕丝腺退化过程中细胞程序性死亡的特点,探索家蚕高蛋白血症模型的发病机制。形态解剖学观察显示,模型家蚕的丝腺退化过程延长了2倍时间;组织切片HE染色显示,模型家蚕的中部丝腺和后部丝腺都出现了退化启动推迟的现象。对家蚕组织解体退化信号通路相关基因表达水平的检测显示,模型家蚕丝腺细胞中自噬信号基因Atg6和Atg8的转录水平显著低于对照组家蚕,而凋亡信号基因Dronc的转录水平则显著高于对照组家蚕。免疫组化染色显示,模型家蚕丝腺细胞中凋亡启动蛋白Caspase-3在丝腺退化过程中持续表达。研究结果表明高蛋白血症模型家蚕丝腺细胞的凋亡活动增强,而丝腺退化延缓与自噬作用启动延迟有关。     

家蚕丝素蛋白H链基因启动子区域的克隆及活性分析

家蚕(Bombyxmori)丝素蛋白H链基因(fib-H)具有在后部丝腺组织专一性、高效性表达的特点。为利用其时空调控机制,通过PCR扩增方法克隆fib-H启动子片段,并进行序列分析,进而构建由fib-H启动子控制报告基因DsRed的重组载体pSK-FH-DsRed-PolyA,通过家蚕BmN细胞和丝腺进行瞬时表达。结果表明:克隆的fib-H启动子序列具有典型的丝腺特异性表达启动子的特征,并可以驱动DsRed报告基因在BmN细胞和家蚕后部丝腺组织中瞬时表达。     

胰岛素样生长因子1调节动物糖脂代谢的机理及营养调控研究进展

胰岛素样生长因子1(IGF-1)主要通过与胰岛素样生长因子受体偶联或作用于胞内磷脂酰肌醇激酶（PI3K）等细胞内激酶,激活PI3K/苏氨酸蛋白激酶（AKT）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）等信号通路,引发胰岛素抵抗,减少甘油三酯合成,正向调控糖脂代谢;此过程还需上调过氧化物酶增殖物激活受体γ表达,促进糖胺聚糖分泌,抑制叉头转录因子磷酸化,增加脂肪沉积,反向调控糖脂代谢。本文就IGF-1对动物糖脂代谢的调控机理及营养调控研究进展进行综述,旨在为调控动物糖脂代谢提供参考。     

家蚕5龄幼虫后部丝腺细胞酶基因表达的比较分析

基于了解家蚕后部丝腺细胞分泌丝素蛋白基因的表达调控信息,阐明蚕茧高产的机理,根据EST分析结果,分析了家蚕5龄幼虫不同发育时期后部丝腺细胞中酶基因的表达谱特征。发现家蚕5龄幼虫第1天和第5天的生理生化反应涉及氧化还原酶的数量最多,达到30个,转移酶数量达28个,水解酶数量达22个,合成酶数量达12个,裂合酶数量达6个,异构酶数量最少,只有4个。这6种酶基因在家蚕5龄第1天和第5天之间表达差异不大,表达频率超过10次的酶只有细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ、S腺苷甲硫氨酸合成酶和肽基脯氨酸顺反异构酶。上述结果暗示家蚕5龄不同时期,丝素蛋白合成能力的差异与酶分子的数量关系不密切。     

抑制PI3K/AKT信号通路对鹿茸干细胞的影响

旨在探究PI3K/AKT信号通路在鹿茸干细胞[包括生茸区骨膜(antlerogenic periosteum,AP)与角柄骨膜(pedicle periosteum,PP)细胞]中所发挥的作用,以期为揭示哺乳动物器官发生和完全再生机制提供借鉴。本研究通过MTT分析、细胞周期检测、细胞骨架染色等方法研究了抑制PI3K/AKT信号通路后对鹿茸干细胞增殖、细胞黏附、细胞周期、细胞骨架和促血管形成作用的影响。结果发现:1)相对于PP细胞,PI3K/AKT信号通路在调控AP细胞增殖和维持细胞骨架方面具有更为重要的作用;2)AP细胞条件培养液具有明显的促血管形成作用,PP细胞条件培养液不具有明显促进血管形成的作用。试验结果初步表明:相对于鹿茸再生,PI3K/AKT信号通路在鹿茸发生过程中的调控作用更为重要。     

禽呼肠孤病毒蛋白质启动PI3K/Akt信号通路的分析

旨在找出激活PI3K/Akt信号通路的禽呼肠孤病毒(ARV)蛋白质。选取ARV中潜在具有激活PI3K/Akt信号通路活性的σA、σNS、μA、μB和μNS蛋白作为研究对象,将这5个基因克隆到真核表达载体pcAGEN,成功构建重组质粒σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μNS-pcAGEN。将构建的重组质粒转染Vero细胞,采用间接免疫荧光和Western blot检测目的蛋白质的表达,并通过流式细胞术和Western blot,检测转染后Vero细胞磷酸化Akt(P-Akt)的表达量。结果显示,5个目的蛋白质均得到表达。转染σA-pcAGEN或σNS-pcAGEN的Vero细胞,P-Akt的表达量明显升高,而使用PI3K特异性抑制剂LY294002则能抑制P-Akt的表达量明显升高。结果表明,ARV的σA蛋白和σNS蛋白能激活细胞的PI3K/Akt信号通路。     

家蚕miR-0047对丝胶蛋白基因BmSer-1表达的调控作用研究

对家蚕中部丝腺小RNA高通量测序获得若干新miRNA,生物信息学分析发现Bmo-miR-0047可能对家蚕丝胶蛋白基因Bm Ser-1有调控作用。设计特异性茎环引物,利用半定量RT-PCR检测分析家蚕5龄3 d幼虫丝腺(包括前、中、后部丝腺)、头部、脂肪体、表皮、中肠、马氏管、精巢/卵巢、血淋巴细胞和气管等12个器官组织中Bmo-miR-0047的表达情况。结果显示,中部丝腺中Bmo-miR-0047的相对表达量明显高于其他组织,说明在家蚕5龄幼虫期Bmo-miR-0047对Bm Ser-1基因的表达调控存在时空特异性。为了进一步分析Bmo-miR-0047对Bm Ser-1基因表达的调控作用,构建重组表达载体pc DNA3.0(ie1-egfp-pri-miR-0047-SV40)和p GL3(A3-luc-Bm Ser-1 3'UTR-SV40),并以海肾荧光素酶报告质粒pRL-CMV为内参,利用家蚕卵巢培养细胞Bm N进行共转染。转染后检测发现实验组Bm N细胞中的荧光素酶活性与对照组相比显著减弱,表明Bmo-miR-0047在体外培养细胞中对Bm Ser-1基因的表达具有负调控作用。     

家蚕丝素重链启动子克隆片段在家蚕体内和昆虫培养细胞内的渗漏表达

为了探讨家蚕丝素重链基因的调控机制,应用重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)为基因转移载体,以绿色荧光蛋白基因为报告基因,研究了丝素重链基因启动子克隆片段在家蚕丝腺的不同部位,以及脂肪体细胞和Sf9培养细胞中的表达渗漏。结果发现,丝素重链启动子克隆片段在家蚕中部丝腺存在表达渗漏,并且在中部丝腺前部的表达活性要强于中部丝腺的中部和后部;克隆片段在脂肪体组织存在表达渗漏,通过荧光解剖显微镜可以在体表观察到绿色荧光;克隆片段在Sf9培养细胞中也存在表达渗漏。上述结果说明目前已知的有关家蚕丝素重链基因的调控元件仍不充分,家蚕基因组中可能还有其他调控丝素重链基因表达组织和时相的特异性元件存在。