棉花阿拉伯半乳糖蛋白基因的克隆、表达与染色体定位分析

陆地棉李氏超短纤维突变体(Li1li1)是显性单基因突变体,表现为茎秆、叶片卷曲,纤维短至6mm,其隐性纯合体(li1li1)则表现为株型和纤维发育都正常。对开花后10d的李氏纤维发育正常材料(li1li1)和超短纤维突变体(Li1li1)胚珠纤维混合体进行mRNA差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)分析,获得1条在李氏纤维发育正常材料中上调表达的差异片段。进一步通过5'RACE技术获得全长为621bp的cDNA,测序及DNA序列的生物信息学分析表明该cDNA片段与拟南芥编码阿拉伯半乳糖蛋白基因AGP14有52%相似性,故命名为GhAGP。表达特征分析表明,该基因在陆地棉根、茎、叶和纤维中组成性表达,在棉纤维中优势表达。基因组序列分析显示,该基因在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中各有1个拷贝,在四倍体棉种陆地棉TM-1和海岛棉海7124中分别存在2个拷贝,表明A、D亚组中各有1个拷贝。利用本实验室陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉海7124培育的含140个单株的BC1作图群体,将GhAGP基因的2个拷贝分别定位在四倍体棉花部分同源转化群染色体6和染色体25上。     

棉花S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因的克隆及低温下的表达分析

根据棉花S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase, SAMDC)基因已知EST序列设计引物,采用RACE和RT-PCR技术克隆获得该基因的全长cDNA序列,命名为GhSAMDC (GenBank登录号为JN020148)。生物信息学分析表明,GhSAMDCcDNA序列全长1 874 bp,涵盖tiny ORF (tORF)、upstream ORF (uORF)和main ORF (mORF) 3个植物SAMDC基因特征ORF。其中mORF长1 064 bp,编码含355个氨基酸残基的SAMDC酶原,预测分子量为38.25 kD,该酶原含有高度保守的酶原剪切位点结构域(LSESSLF)和与SAMDC蛋白快速降解有关的PEST (TIHVTPEDGFSYAS)结构域。GhSAMDC基因组DNA序列全长2 743 bp,包含3个内含子,均位于5'' UTR,其中一个位于uORF内。聚类分析表明,GhSAMDC与葡萄中该蛋白的同源关系最近,并且与其他双子叶植物聚为一类。荧光定量PCR分析结果表明,GhSAMDC表达受低温诱导,在冷敏感品种新陆早1号中基因表达水平明显高于在耐冷品种新陆早33号中。     

一个新的棉花MYB类基因(GhTF1)的克隆及染色体定位分析

MYB类转录因子是指含有MYB结构域的一类转录因子, 广泛参与植物发育和代谢调节。含2个MYB结构域的R2R3类MYB转录因子在植物体内主要参与次生代谢的调节和控制细胞的形态发生。从优质材料7235不同发育时期的棉纤维混合cDNA文库中克隆了一个棉花MYB转录因子基因GhTF1(GenBank登录号: EF651783)。该cDNA序列长1 115 bp, 其开放读码框长度为771 bp, 编码256个氨基酸。表达特征分析表明, 该基因在陆地棉7235不同组织中均表达, 但表达量不同, 特别在开花前1 d, 开花后8 d和11 d的纤维细胞中优势表达。该基因在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中开放读码框区的序列较保守, 但在非编码区差异较大, 在内含子区存在大片段插失和碱基替换现象。Southern杂交结果表明该基因在陆地棉基因组中存在2个拷贝, 推测A、D亚组中各有1个拷贝。利用海7124和TM-1两亲本配置的BC₁作图群体, 将GhTF1定位在染色体10上。     

一个新的棉纤维表达蛋白cDNA的克隆、表达及功能初步分析

通过陆地棉高品质纤维种质系7235的棉纤维混合cDNA文库随机测序,得到一个开放阅读框(open reading frame,ORF)完整的棉纤维表达蛋白(GhCFE,GenBank登录号:DQ073045)cDNA序列。该cDNA序列全长1274bp,最大的ORF为996bp,编码332个氨基酸,其理论上的等电点pI=6.14,分子量Mw=37.7KD。它的N-末端存在一个长度为27个氨基酸残基的信号肽。RT-PCR分析表明,该基因在根、茎中不表达,在叶片中微弱表达,在不同发育时期的纤维细胞中均表达,且在纤维伸长期表达量最高。进化树显示GhCFE与已报导的3个棉纤维表达蛋白cDNA有很高的同源性。通过构建酵母表达载体,发现该基因对酵母细胞的伸长和细胞壁加厚没有显著影响。利用pBI121质粒构建了含35S启动子的正义表达载体和含棉纤维特异表达启动子E6的正义和反义表达载体,正在通过农杆菌介导的遗传转化,开展该基因的功能验证。     

甘蔗S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(ScSAM)的克隆及表达

利用RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种新台糖22号(ROC 22)中克隆获得SAM基因的cDNA序列,命名为ScSAM,GenBank登录号为KC172558。用生物信息学方法预测分析其序列,cDNA全长1466 bp,含有1个1191 bp的完整开放阅读框(ORF),编码396个氨基酸,与高粱和玉米等植物的SAM蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,甘蔗ScSAM与高粱的SAM蛋白亲缘关系较近。Real-time PCR分析表明ScSAM为组成型表达,在根中的表达量最高,是叶中表达量的3.6倍。其在黑穗病菌胁迫和低温(4℃)、聚乙二醇(PEG)、NaCl非生物胁迫下均被诱导表达,但表达模式不同;在H₂O₂胁迫下其表达被抑制。推测其可能参与甘蔗抗黑穗病过程,且在甘蔗抗寒、抗旱、抗盐和抗氧化等胁迫过程中也起某种作用。     

棉花纤维特异/优势表达基因的染色体定位

 棉纤维是研究植物细胞伸长和细胞壁建成以及纤维素生物合成的优良模型,迄今为止,已经分离了许多纤维特异/优势表达的基因。为了便于这些基因的图位克隆使其能够应用于棉花纤维品质的改良中,本研究采用分离群体定位法和Blast分析法对这些基因进行染色体定位。利用陆地棉、海岛棉BC₁种间分离群体,将GhCFE定位在第6染色体,GhGLP1-250定位在第19染色体。Blast分析将11个基因定位到棉花染色体上。这些基因与棉纤维的伸长和细胞壁的合成相关,与这些基因连锁标记的获得有助于棉花纤维长度和强度的分子标记辅助选择。     

棉花液泡膜H~+-ATPase A亚基的克隆及表达载体的构建

液泡膜H+-ATPase在植物应对非生物胁迫中起着十分重要的作用,对其关键亚基基因的克隆及分析,有助于阐释V-ATPase在逆境下的调节及响应机制。本研究利用RT-PCR技术从棉花中克隆了一个液泡膜H+-ATPase亚基A基因,命名为Gh VHA-A。该基因ORF为1 872 bp,编码623个氨基酸,预测的蛋白质理论分子量为68.41 k D,等电点为5.17。通过氨基酸序列比对和系统进化树分析发现,Gh VHA-A与可可V-ATPase A亚基的同源性最高,达到97.9%,在进化上亲缘关系较近;且在编码蛋白的氨基酸序列上有两个与ATP或GTP的磷酸基团相互作用的保守结构域GAFGCGKT和PSVNWLISYS,说明A亚基是相对保守的。本研究构建了植物表达载体p CAMBIA 1304-VHA-A,并转入到根癌农杆菌(GV3101)中,为后续研究棉花V-ATPase A亚基基因在干旱胁迫应答中的功能奠定试验基础。     

一个陆地棉半胱氨酸蛋白酶全长cDNA的克隆及其序列特征分析

植物体内的半胱氨酸蛋白酶（CP）在一系列重要的生理代谢途径中发挥作用,在种子萌发过程中它们与许多贮藏蛋白的降解有关[1],它们可能催化大多数蛋白前体向成熟蛋白转化过程中的翻译后加工过程[2,3],从而为幼苗的生长发育提供营养物质;……     

一个新的棉花MYB类基因(GhTF1)的克隆及染色体定位分析

MYB类转录因子是指含有MYB结构域的一类转录因子,广泛参与植物发育和代谢调节。含2个MYB结构域的R2R3类MYB转录因子在植物体内主要参与次生代谢的调节和控制细胞的形态发生。从优质材料7235不同发育时期的棉纤维混合cDNA文库中克隆了一个棉花MYB转录因子基因GhTF1（GenBank登录号：EF651783）。该cDNA序列长1115bp,其开放读码框长度为771bp,编码256个氨基酸。表达特征分析表明,该基因在陆地棉7235不同组织中均表达,但表达量不同,特别在开花前1d,开花后8d和11d的纤维细胞中优势表达。该基因在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中开放读码框区的序列较保守,但在非编码区差异较大,在内含子区存在大片段插失和碱基替换现象。Southern杂交结果表明该基因在陆地棉基因组中存在2个拷贝,推测A、D亚组中各有1个拷贝。利用海7124和TM-1两亲本配置的BC1作图群体,将GhTF1定位在染色体10上。     

一个棉花GDSL脂肪酶基因的克隆与功能分析

GDSL脂肪酶与GXSXG脂肪酶是2个重要的脂肪酶亚家族。其中, GDSL家族脂肪酶具有水解酶活性, 能水解多种酯类物质。本试验根据新乡小吉无绒无絮(XinWX)和无绒有絮(XinFLM)近等基因系纤维起始期29K芯片竞争杂交结果, 选择了一个在纤维起始期具有极显著表达差异的EST序列(GenBank登录号为DR458916), 以该序列信息为探针, 利用电子克隆方法并进行cDNA及基因组全长基因PCR扩增、测序验证, 克隆获得一个陆地棉GDSL脂肪酶基因(GhGDSL;GenBank登录号为KC186125)。该基因ORF长1065 bp, 编码354个氨基酸, 含有5个外显子和4个内含子。该基因在二倍体棉种基因组中含一个拷贝, 在四倍体棉种基因组中含2个拷贝。序列比对显示该基因在四倍体棉种的2个亚组中独立进化, 且D亚组比A亚组变异大。染色体定位显示该基因2个拷贝分别位于A4 (Chr. 4)和D4 (Chr. 22)染色体上。定量RT-PCR结果表明, GhGDSL在开花后3~10 d的纤维组织中表达量高, 其中在海7124中表达高峰在8DPA, 在TM-1中表达高峰从5DPA持续到10DPA。利用[(TM-1×Hai7124)×TM-1]的BC₁S₁群体开展GhGDSL功能与纤维、种子品质性状关联分析, 发现该基因A亚组的拷贝与种子脂肪含量存在显著相关(P=0.048);D亚组的拷贝与种子蛋白含量存在极显著相关(P=0.008)。推测GhGDSL基因功能与种子中脂肪、蛋白代谢相关, 同时也参与纤维伸长过程。     

新疆棉花4个主栽品种的体细胞胚胎发生及植株再生

以新疆4个主栽棉花品种新陆中20、新陆早24、新陆早33和03298为材料, 通过不同浓度的激素组合成功地诱导获得了体细胞胚并进一步发育成苗。研究发现, 所用的4种激素组合均能有效诱导愈伤组织, 其中又以0.02 mg L^-1或0.10 mg L^-1 KT和0.1 mg L^-1 2,4-D组合的诱导效果最佳; 两个诱导措施有利于胚性愈伤组织的产生, 即沿中柱纵切棉花下胚轴切段, 并以纵切面接触培养基; 愈伤组织诱导培养基中KNO₃用量加倍。挑选黄绿色、灰绿色或浅绿色的质地疏松的愈伤组织继代于无激素且KNO₃含量加倍的培养基中可产生胚性愈伤组织, 并在高比例KT/2, 4-D(0.05 mg L^-1或0.10 mg L^-1 KT和0.01 mg L^-1 2,4-D)促进下发育成胚。借助在培养基上垫滤纸产生干燥作用, 并间隔使用强透气效果的棉塞对培养三角瓶进行透气处理, 体细胞胚可成熟发育并产生根系发达的正常再生植株。应用此法, 4个实验材料在6~8个月内即可获得大量再生苗。     

三个陆地棉水孔蛋白基因的克隆与表达分析

从陆地棉SSH-cDNA文库的测序结果中得到一条具有完整ORF的陆地棉水孔蛋白基因序列,将其命名为GhAQP2。以该基因编码的氨基酸序列为探针,在棉花EST数据库经同源搜索得到2个相似性较高的EST,利用RACE技术获得其全长cDNA序列,将其基因命名为GhAQP3和GhAQP4。基因结构分析发现GhAQP2和GhAQP3各有4个外显子,3个内含子;GhAQP4有3个外显子,2个内含子。生物信息分析表明3个基因编码蛋白均含有6个跨膜区,2个NPA结构域,其氨基酸序列具备MIP超家族典型的蛋白保守区序列特征。多序列比对发现3个基因的氨基酸序列与其他物种PIP2类水孔蛋白氨基酸序列具有很高的同源性。qRT-PCR分析表明,GhAQP2在纤维伸长后期优势表达,GhAQP3在下胚轴和子叶中高表达,GhAQP4在纤维伸长前期优势表达,推测3个基因在不同的组织中发挥作用。GhAQP2在20DPA优势表达,为研究该基因在纤维伸长向次生壁加厚期转化过程中的表达调控提供了重要信息。     

棉花耐低钾基因型筛选条件和指标的研究

以2004年我国棉区的主栽品种/组合/品系为主, 收集50个基因型, 在苗期室内液培条件下(低钾浓度和高钾浓度分别为0.02 mmol L^-1和2.50 mmol L^-1)对棉花耐低钾基因型的适宜筛选苗龄和评价指标进行研究, 并与田间缺钾土壤(速效钾含量为59.88 mg kg^-1)的筛选结果进行比较。结果表明, 棉花5叶期幼苗基因型间生物量的变异系数明显高于3叶期, 适宜进行耐低钾基因型筛选。低钾条件下的绝对生物量与相对生物量(0.02/2.50)、吸钾量和钾利用指数(KUI, 单位浓度钾所形成的生物量)极显著(P < 0.01)相关, 相关系数分别为0.7690、0.9522和0.9791。根长、根表面积与整株吸钾量的相关系数分别为0.5201(P < 0.01)和0.3325(P < 0.05)。子叶缺钾斑占子叶总面积的比例(S)在基因型间变化幅度大(变异系数为44.46%)、符合正态分布、与生物量极显著相关(r = –0.4455, P < 0.01), 可作为棉花苗期耐低钾基因型筛选的辅助指标。种子含钾量与棉花幼苗子叶的S值、生物量、钾吸收量和KUI均无相关关系。液培条件下5叶期幼苗的整株生物量与田间条件下产量器官干重极显著相关(r = 0.5091, P < 0.01), 证明苗期室内液培筛选具有可行性, 可作为对大量基因型的初筛方法, 典型基因型需要在田间进行复筛。     

小麦TaABC1L的克隆及表达特性分析

通过反向Northern筛查小麦旱选10号幼苗水分胁迫诱导表达的cDNA文库，选择一个在水分胁迫1、6和12 h均上调表达的cDNA克隆作为“种子”序列，利用电子延伸和RT-PCR方法，获得一个开放阅读框为1 434 bp，编码477个氨基酸的cDNA序列。由该序列推测编码的蛋白含有1个典型的ABC1保守域（123~243氨基酸）和1个AARF域（42~369氨基酸），但是没有发现ABC1向线粒体转移的信号肽前体序列（PD017350），因此，将该基因命名为TaABC1L。同源比对结果表明，TaABC1L只与水稻、拟南芥中4个尚未研究功能的基因编码的氨基酸序列高度同源。实时定量RT-PCR结果显示，TaABC1L对渗透、高盐、低温等逆境胁迫和ABA处理均表现出应答反应，但是在不同胁迫条件下表达高峰出现的时间和表达强度上存在差异。其中受NaCl胁迫1 h，基因的表达量已达到对照的30倍，之后其表达量迅速回落，但仍高于对照；受ABA诱导时，其表达量略有增加，在12 h的最高表达量也仅为对照的2倍。     

棉花不同类型品种耐低钾能力的差异

以2004年我国棉区主栽的转基因抗虫棉与非抗虫棉、常规棉与杂交棉以及不同熟性的48个品种/杂交种/品系为材料, 对室内液体培养条件(钾胁迫浓度为0.02 mmol L^-1)下幼苗和田间缺钾土壤(速效钾含量为59.88 mg kg^-1)上成株的耐低钾能力进行了比较。结果表明, 抗虫棉组在苗期低钾条件下的生物量、吸钾量和钾利用指数以及田间缺钾土壤上的产量器官干重分别显著或极显著低于非抗虫棉组20.1%、15.0%、23.7%和20.9%, 而且苗期生物量最低的5个品种均为抗虫棉, 田间产量器官干重最低的5个品种中4个为抗虫棉; 杂交棉组的上述各指标分别显著或极显著高于常规棉组28.0%、19.9%、26.4%和43.2%, 而且苗期生物量和田间产量器官干重最高的5个品种中各有4个为杂交棉; 此外, 抗虫棉耐低钾的杂种优势强于非抗虫棉, 如杂交抗虫棉的上述各指标分别较常规抗虫棉显著或极显著提高37.0%、24.6%、44.3%和59.4%, 而非抗虫棉组的杂交棉只有钾胁迫下的苗期生物量和田间产量器官干重显著高于常规棉27.7%和29.9%; 品种熟性不影响棉花的耐低钾能力; 各类型品种内部的耐低钾能力也存在显著的品种差异, 常规抗虫棉耐低钾能力强的品种(系), 其苗期生物量和田间产量器官干重与常规非抗虫棉和杂交抗虫棉耐低钾能力中等的杂交种相当。     

棉花半乳糖基转移酶基因GhGalT1启动子的克隆及表达分析

糖基转移酶(glycosytransferase, GT)是催化活化的供体糖基转移到特异受体生成糖苷键的酶类, 在应答多种生物和非生物胁迫中起重要作用。本研究利用PCR技术从陆地棉品种Coker 312基因组中分离克隆了GhGalT1基因的启动子, 序列长度为539 bp, 命名为pGhGalT1。启动子分析软件PlantCARE分析表明pGhGalT1含有CAAT-box、TATA-box核心元件, 以及响应干旱、热、脱水、防御与胁迫应答的顺式作用元件MBS、HSE、MYCCONSE、TC-rich repeats和CGTCA-motif等。因此将pGhGalT1构建到启动子检测载体pBI101-GUS上, 形成pBI101-pGhGalT1-GUS融合表达载体, 以检测其启动子活性。通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥, 经卡那霉素抗性筛选及PCR检测成功获得阳性转基因植株。对T₃代转基因拟南芥进行组织化学染色分析显示该启动子主要在生长5~15 d的幼苗主根及侧根根尖表达, 在子叶及莲座叶边缘也有微弱表达。非生物胁迫和激素处理后的组织化学染色、GUS酶活性及GUS基因定量分析结果显示GhGalT1基因的启动子受盐、渗透胁迫和激素(6-BA、MeJA、BL)的诱导, 该结果为合理选用启动子改良作物提供理论依据。     

陆地棉三个WRKY基因的克隆及表达分析

WRKY转录因子可调控下游抗逆基因的表达,进而在植物生长发育以及对外界环境的反应中起着重要的调控作用,目前对棉花WRKY家族基因的研究比较少。本研究利用电子克隆的方法,从陆地棉品种山农圣杂3号中克隆得到了3个具有完整开放阅读框的棉花WRKY基因,聚类分析表明它们同属于WRKY家族中的第Ⅱ类。利用RT-PCR结果表明:250mmol/LNaCl盐胁迫和20%PEG6000干旱胁迫下同时诱导GhWRKY4的基因表达,GhWRKY5仅受干旱胁迫下的诱导,而GhWRKY6对这两种逆境胁迫都没有变化。     

三个转Bt基因抗虫杂交棉杂种优势的解剖学分析

选取湘杂棉3号、南抗3号和鲁棉研15等3个大面积推广的强优势转Bt基因抗虫杂交棉及其亲本为材料,剖析盛花期主茎功能叶（倒4叶）的叶片结构、叶表皮气孔特征以及主茎功能叶的叶脉、叶柄、铃柄和对应的果枝叶叶柄等器官的维管束组织结构。结果表明,3个F1及亲本共9个材料的主茎功能叶（倒4叶）主叶脉中的维管束形态有三分支型、两分支型和无分支型3种,杂种及亲本之一的维管束都为三分支型,说明三分支型的维管束是显性遗传。F1功能叶主叶脉、功能叶叶柄、果枝叶叶柄、铃柄的维管束性状（导管总数、单个导管面积、维管束总面积、维管束组织比）和叶片厚度、叶片栅栏细胞大小的优势表现因组合而异。主叶脉、功能叶叶柄、果枝叶叶柄、铃柄的维管束以及叶片厚度、叶片栅栏细胞大小的优势与杂种的产量优势可能没有关系或相关性较小。3个F1的下表皮单位叶面积气孔总面积均表现超亲优势。果枝叶可能比主茎功能叶对铃的发育影响更大。     

新疆滴灌棉花花铃期干旱复水对叶片光合特性及产量的影响

在新疆气候生态条件下, 采用膜下滴灌植棉技术, 控制花铃期0~60 cm土壤滴水下限分别为田间持水量的45%(中度干旱)、60%(轻度干旱)和75%(正常供水, 对照), 滴水上限均为田间持水量, 研究不同程度干旱复水对棉花叶片光合特性及产量形成的影响。结果表明, 干旱降低了叶片净光合速率(P_n)和气孔导度(G_s), 中度干旱下叶片光化学猝灭系数(qP)、PSⅡ电子传递量子产量(Ф_PSⅡ)降低, 非光化学猝灭系数(NPQ)升高。复水后3 d内P_n和G_s恢复, 以轻度干旱恢复最快; Ф_PSⅡ和qP与Pn的变化相似; NPQ复水后1~2 d显著降低。从初花期至盛铃前期, 轻度干旱复水后光合物质累积量与对照无明显差异, 盛铃后期至吐絮期低于对照, 籽棉产量较低; 中度干旱复水后光合物质累积量及籽棉产量均最低。