拟南芥抗灰霉病相关基因的克隆与原核表达

为了从拟南芥中获得抗灰霉病相关基因以及进行基因分析,本试验利用RACE技术获得了该基因的cD-NA全长(1190 bp),并用生物信息学方法和Southern Blotting技术明确了该基因是编码372个氨基酸的转录调节/结合蛋白的AT5G67480基因,以单拷贝形式存在于拟南芥基因组中。编码的蛋白含有BTB/POZ结构域,体外诱导表达的蛋白对灰霉病菌的生长有一定的抑制作用。     

极细链格孢菌66 kDa激活蛋白的纯化及诱导烟草抗TMV的功能

激活蛋白是一类来源于真菌、诱导植物获得系统抗性的蛋白激发子。通过加热离心、乙醇沉淀、离子交换层析、超滤等方法,从极细链格孢菌(Alternaria tenuissi ma)JH505菌株的菌丝体中分离纯化出一种激活蛋白,在SDS-PAGE银染图谱显示单一条带,表观分子量约为66 kDa,糖蛋白特异性染色确定其为糖蛋白。该蛋白可以诱导三生烟提高对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的抗性,处理后的三生烟叶片TMV枯斑数显著减少,枯斑抑制率可达到49%。     

拟南芥感染灰霉病菌后差异表达基因分析

利用SSH(抑制性消减杂交)技术,对接种灰霉病菌后不同拟南芥生态型差异表达的基因进行了分析,对SSH产物条带进行回收和二次扩增,得到6个差异表达条带。经反式NORTHERN杂交检测均为阳性片段。对其进行克隆、序列测定,获得了7个差异表达的序列。同源性分析表明,它们与转录、膜内外物质转移、蛋白合成、信号传递等生命活动相关的基因有一定的同源性,其中1个片段的序列与拟南芥乙烯信号传递途径有关,推测其可能关联到拟南芥对病菌的抗性。对这些基因片段进行深入的分析和功能研究,将会对拟南芥与灰霉病菌互作的分子机理有更进一步的认识。     

拟南芥WHIRLY2基因超表达引起拟南芥角果发育异常的分子细胞学分析

通过构建拟南芥WHIRLY2基因超表达植株和鉴定这个基因的突变体,对WHIRLY2基因调控拟南芥角果的发育过程进行了分析.表型观察结果显示过量表达WHIRLY2基因的植株角果发育异常,出现变黄、干瘪和早衰现象,角果果皮细胞中叶绿体的数量明显比野生型少,叶绿体中淀粉粒的数目比野生型明显增多.进一步对角果发育、能量代谢、线粒体基因组稳定、叶绿体淀粉粒代谢相关基因的表达丰度进行qRT-PCR分析,发现WHIRLY2超表达植株角果中与线粒体能量代谢相关的nad1、cytc382、rad50和同时作用于线粒体和叶绿体的atp9基因的表达发生变化.通过线粒体基因组的结构分析和蛋白质凝胶迁移试验,发现WHIRLY2蛋白可以结合在线粒体基因组的nad1和cytc382基因启动子的4个端粒重复序列AAAATCCCC上,推测WHIRLY2可能通过调控nad1和cytc382基因的转录从而参与角果发育的调控.     

DDRT-PCR技术分析籽粒苋镉胁迫下相关基因的差异表达

以镉污染修复植物籽粒苋(Amaranthus hypochondriacus)的根、叶、果为实验材料,利用DDRT-PCR技术分析籽粒苋Cd胁迫下基因表达水平的变化。结果表明:回收差异片段获得镉处理诱导的4个差异表达序列(EST-1、EST-2、EST-3和EST-4),经Blastn比对,EST-1与土人参26S核糖体RNA基因部分序列(GB|HQ843466.1)一致性为99%,EST-2与虎耳草26S核糖体RNA大亚基基因部分序列(GB|AF036498.1)一致性为93%,EST-3与大肠杆菌菌株TW14359 DNA聚合酶Ⅲα亚基基因(ECs0186)完整CDS(GB|EU906049.1)一致性为97%,EST-4与米曲霉RIB40 β-葡萄糖苷酶基因(XM_001816779.2)一致性为99%;经Blastx比对,EST-1与假定蛋白MTR_5g051030[苜蓿](XP_003614386.1)氨基酸序列相似性为26%,EST-2与假定衰老相关蛋白[柏杉](GB|ACA30301.1)氨基酸序列一致性为98%,EST-3与DNA聚合酶Ⅲα亚基 [大肠杆菌OP50](ZP_06935700.1)氨基酸序列一致性为100%,EST-4与β-葡萄糖苷酶[黄曲霉NRRL3357](XP_002383240.1)氨基酸序列一致性为99%;4个差异表达基因通过调控蛋白质代谢、DNA复制和糖代谢等途径来应答镉胁迫。     

河西走廊玉米制种田细链格孢菌叶斑病诊断及病原鉴定

根据田间调查和病原菌鉴定,明确了河西走廊玉米制种田叶部发生的重要病害之一是细链格孢菌叶枯病(Alternaria altevnata)。该病害在河西走廊制种玉米上发生呈逐年加重趋势。     

拟南芥不同生态型对灰葡萄孢的抗病性

为明确拟南芥不同生态型对灰葡萄孢的抗病性,并筛选具有抗性的拟南芥材料,试验通过对拟南芥11个生态型进行接种试验,研究其对21个灰葡萄孢菌株的反应,结果发现,有10个灰葡萄孢菌株对拟南芥的11个生态型表现抗/感差异。其中Col-0、Ws-0和Ler生态型接种灰葡萄孢菌株BC18后表现典型的抗病和感病反应。组织病理学试验进一步确定了Col-0、Ws-0生态型为抗病生态型,而Ler为感病生态型,试验结果为进一步的植物抗病基因的克隆和相关作物的遗传改良奠定基础。     

拟南芥AtBT4对灰葡萄孢的抗性机制分析

【目的】揭示AtBT4在拟南芥抗灰葡萄孢中与SA、JA信号途经的相互关系。【方法】利用RT-PCR技术,检测用SA、SA类似物BTH、JA、ACC及灰葡萄孢处理拟南芥野生型Col-0后其AtBT4的表达情况;检测经SA和JA处理后拟南芥SA、JA途径相关突变体AtBT4的表达情况;并检测接种灰葡萄孢后拟南芥野生型Col-0、bt4突变体和回复突变体抗病相关基因的表达情况。【结果】JA处理和接种灰葡萄孢后,拟南芥野生型Col-0中AtBT4的表达明显增强。但经JA处理后,JA不敏感突变体jar1的AtBT4表达变化趋势与野生型明显不同,AtBT4的表达水平不受JA诱导。SA信号途径相关突变体eds5、sid2和npr1中AtBT4的表达明显低于野生型,但变化趋势与野生型基本一致。bt4突变体中抗病相关基因PR1、PR4、PDF1.2和BIK1的表达明显低于野生型和回复突变体。【结论】AtBT4的表达受JA和灰葡萄孢的诱导,AtBT4突变影响抗病相关基因PR1、PR4、PDF1.2和BIK1的表达,AtBT4可能通过SA、JA信号途径影响拟南芥对灰葡萄孢的抗性。     

拟南芥中热胁迫相关microRNA的差异表达

对改良CTAB法、改良热酚法和Trizol法3种方法在提取拟南芥叶片的总RNA中的效果进行了比较,并利用半定量RT-PCR技术检测热胁迫相关microRNA(miRNA)的表达情况。结果表明:Trizol法提取能得到高质量的拟南芥叶片总RNA,效果优于改良CTAB法、改良热酚法;筛选的4个拟南芥miRNA的表达受到热胁迫的诱导,在38℃不同时间处理下各个miRNA的表达情况都有差异,随着处理时间的延长,其表达量均出现明显提高的情况。     

库尔勒香梨萼片脱落与宿存相关基因的差异表达分析

[目的]利用mRNA差异显示(mRNA differential display PCR,DDRT-PCR)技术,寻找、筛选并确定与库尔勒香梨萼片脱落和宿存相关基因的差异表达时期以及相关的差异基因.[方法]以新疆库尔勒香梨盛花前期、盛花期及其盛花后期三个时期同一花序的第2和第4朵花为试材,通过DDRT-PCR技术分离和克隆库尔勒香梨萼片脱落和宿存相关基因片段.[结果]分离得到42条差异片段,其中双引物片段有7条,在GenBank中同源性比较发现有2条与控制开花以及激素调节有密切关系的SPL和MYB类转录因子有很高的同源性,分别是78;和86.83;.[结论]实验为获得香梨萼片脱落与宿存差异表达基因建立的体系.为相关基因全长的克隆奠定基础,并为进一步验证其功能提供依据.     

转录因子AtWRKY28在拟南芥与甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)亲和性互作中的功能分析

WRKY是植物特有的一类转录因子,是一个超级大家族,与植物多种逆境胁迫应答密切相关,在植物防御病原菌的侵染中发挥十分重要的作用。拟南芥转录因子WRKY28属于WRKY家族的成员,包括一个WRKYGQK核心序列和一个Cys2His2锌指型结构。为了鉴定拟南芥WRKY28的功能,构建了反义抑制表达株系和转基因过表达株系并进行抗病性鉴定。研究表明,反义抑制表达株系降低了对腐生型真菌甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)的抗性,而转基因过表达株系提高了对甘蓝链格孢菌的抗性。由此可见,转录因子WRKY28参与了拟南芥对甘蓝链格孢菌的免疫应答,是其抗病反应中的一个正调控因子。     

不同生态型拟南芥对植物病原真菌的抗病性

拟南芥是研究植物与病原菌互作的模式植物,本试验用17种植物病原真菌测定了11个拟南芥生态型的抗病性。结果表明,在供试的11个拟南芥生态型中,生态型NAHG、SHA、WS-2、WS-0与供试的所有菌株表现为非亲和反应,而生态型COL、C24、ND-1、EST-1、KAS-1、BAY-0、LER与不同病原菌的反应表现不同。     

梨黑斑病菌对苯醚甲环唑的敏感性分析

采用菌丝生长速率法测定了苯醚甲环唑对分离自金水梨园的43个梨黑斑病菌[Alternaria alternata(Fries)Keissler]菌株的EC_(50)。结果表明,苯醚甲环唑对梨黑斑病菌菌株的EC_(50)分布在0.071 9~1.488 6μg/m L范围内,平均值为0.507 2±0.333 3μg/m L。W检验梨黑斑病菌对苯醚甲环唑敏感性的频次分布呈正偏态分布。菌株主体表现为敏感,但存在敏感性降低的菌株。     

草莓FaAP1基因植物表达载体构建及在拟南芥中的超表达

为研究草莓AP1同源基因FaAP1的功能,构建了其植物表达载体pBI121-FaAP1,并导入到农杆菌菌株GV3101中。利用花序浸染法将该基因导入拟南芥,经抗性筛选、PCR检测表明获得了3个转化株系。结果显示,与对照相比,转基因株系明显早花,成花时间可提早10d以上;同时其营养生长受到抑制,植株个体矮小,莲座叶数目减少;在早花的同时,转化株系花器官异常,不能形成种子。表明草莓FaAP1基因参与了成花过程的调控。     

拟南芥动蛋白AtOvKLP的序列分析及原核表达

选择拟南芥AtOvKLP蛋白作为研究对象,对其氨基酸序列和结构域进行了分析.结果表明,AtOvKLP蛋白ATP结合位点序列(FAYGQTGSGKT)与大多数动蛋白中的ATP结合位点序列不完全一致(YGQTGS-GKT);通过与动蛋白其它亚家族的系统分析比较,发现AtOvKLP与KHC亚家族类的各动蛋白距离较近;同时构建了pET-khc原核表达载体,并得到了体外表达蛋白.     

拟南芥sscd1–1点突变对其表达的影响

为了探明拟南芥sscd1–1突变体中sscd1–1突变基因表达水平的降低是由剪切效率所致还是由自身启动子影响所致,分别构建了由外源35S启动子驱动的SSCD1正常基因和sscd1–1突变基因的表达载体及由内源自身启动子驱动的SSCD1正常基因和sscd1–1突变基因的表达载体,并将其转入到拟南芥sscd1–1突变体中。采用RT–PCR分析sscd1–1突变基因的表达。结果显示:外源35S启动子驱动的sscd1–1突变基因的表达与正常基因相比没有明显差别,而内源自身启动子驱动的sscd1–1突变基因的表达显著降低,这表明sscd1–1的点突变没有影响其剪切效率;sscd1–1突变基因表达水平的降低是由内源自身启动子影响所致。     

梨黑斑病病菌的致病条件

盖森链格孢(Alternaria geisen)是梨树致病真菌之一,能引起梨黑斑病.本研究探讨了接种方法、温度、保湿方法等因子对梨黑斑病病菌致病性的影响及24种病原菌的致病性.结果表明,采用喷雾法和涂抹法室内接种梨黑斑病病菌,该病菌具有较强的致病性;梨黑斑病病菌侵染的最适温度为28 ℃,采用2%水琼脂保湿时该病菌具有较强的致病性.24种病原菌的致病性,用喷雾法接种,强致病性菌株占54.2%(病情指数>25%);用涂抹法接种,强致病性菌株占50%(病情指数>25%),表明大多数菌株具有较强的致病性.结果还表明菌株接种后的病情指数与菌丝生长速率、产孢量相关性不显著;但与菌落颜色存在一定的关系,颜色越深,致病性越强.由此推测,梨黑斑病病菌致病性的强弱可能与其产生色素有关.     

木霉菌T-115D对马铃薯早疫病菌的拮抗作用

为了明确木霉菌T-115D对马铃薯早疫病菌的拮抗作用和拮抗机制,采用平板对峙培养试验和木霉菌T-115D发酵液对马铃薯早疫病菌生长的抑制试验,研究木霉菌T-115D对马铃薯早疫病菌的拮抗作用及其机制。对峙培养结果表明,木霉菌能迅速占领大部分空间,抑制马铃薯早疫病菌的生长,显微镜观察发现,木霉菌菌丝可缠绕和寄生早疫病菌菌丝;木霉菌发酵液对马铃薯早疫病菌菌丝生长有较强抑制作用,在木霉菌T-115D发酵液稀释3倍后对菌丝生长的抑制率为90.4%,发酵原液对马铃薯早疫病菌孢子萌发的抑制率为100%,说明木霉菌T-115D对马铃薯早疫病菌具有明显的拮抗作用,其拮抗机制包括抑制菌丝生长和孢子萌发、营养空间竞争和寄生作用。