小麦avenin-like type-B基因启动子的克隆及功能验证

为深入研究ALPtype-B基因的调控机理及胚胎特异性表达特性,采用农杆菌转化技术,将含有ALPtype-B基因启动子的双元表达载体转化烟草。对阳性转基因烟草植株进行GUS组织化学检测定性分析。结果显示,小麦ALPtype-B基因启动子可驱动报告基因在烟草种子的胚乳中特异表达,在其他组织中没有表达。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因植物表达载体的构建

以含鸡传染性法氏囊病病毒(杭州分离株，HZ96)VP2基因的质粒PBS为模板，根据其序列设计引物进行PCR扩增，得到1．5kb左右长的VP2基因产物；用Kpn Ⅰ和SalⅠ酶切纯化的PCR产物；将纯化的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下定向克隆到植物表达载体Cambia1301水稻胚乳特异性启动子GTl下游，并经PCR、酶切和测序鉴定．植物重组表达栽体经三亲交配已导入根癌农杆菌中．     

小麦GPX基因的克隆及植物表达载体构建

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPXs)是植物体内清除活性氧的主要酶,与植物抗逆性紧密相关。为利用农杆菌介导法转化小麦以及提高小麦抗逆能力奠定基础,采用RT-PCR方法从小麦品种新麦26中克隆GPX基因的编码区序列,运用T-A克隆方法克隆pGM-T载体,通过酶切、连接和转化等技术构建植物表达载体。结果表明:扩增到约为500bp的GPX基因,成功构建植物表达载体pBI121-GPX,并导入农杆菌LBA4044中。     

cry Ia基因小麦高效表达载体的构建

利用在禾谷类作物中表达效率较高的启动子Ubi对含目的基因cryIa的现有载体进行了改造,并引入了筛选标记基因bar,为提高目的基因的表达水平,还在目的基因5′端引入了Ω和Kozak序列,3′端引入了poly(A)序列。成功构建了适用于小麦的抗虫基因植物表达载体pGU4ABBar,该载体含有顺向连接的Ubi-cryIa及Ubi-bar基因表达盒,可用于基因枪、花粉管通道法等介导的小麦遗传转化,人工合成的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因cryIa可以编码对鳞翅目昆虫具有毒杀作用的蛋白。     

3种不同启动子构建ACC脱氨酶基因植物表达载体

从阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)UW4菌株克隆出ACC脱氨酶(1-aminocyclopmpane-1-carboxylic acid deaminase)基因连接至pGEM-T vector上,并采用3种不同启动子(组成型表达启动子CaMV35S、花特异表达启动子CHSA及衰老特异表达启动子SAG12)分别构建ACC脱氨酶基因的植物表达载体,经PCR及酶切鉴定均已构建成功.为后期选择不同的花卉等植物材料遗传转化研究打下基础.     

百合花特异启动子PchsA表达载体的构建及功能分析

【目的】分析从百合中克隆获得的查耳酮合成酶基因(chsA)启动子的组织表达特性。【方法】将chsA启动子片段插入到双元表达载体pCAMBIA 1381中,成功构建了植物表达载体pCAMBIA-CHS,通过根癌农杆菌EHA 105转化拟南芥,用50 mg/L潮霉素对转化植株进行筛选,对阳性植株进行PCR检测和GUS组织化学分析。【结果】PCR检测表明,chsA启动子片段已经整合到拟南芥基因组中,GUS组织化学分析显示,在拟南芥花序中有很强的GUS活性,叶腋处有微量表达,其他组织中不表达。【结论】初步证明百合chsA启动子为花特异表达启动子。     

豆荚特异性启动子Pmsg的克隆及抗大豆食心虫植物表达载体的构建

植物基因工程载体构建时,一般采用组成型启动子,因涉及转基因食品安全性问题,在社会上引起争议。采用组织特异性启动子代替组成型启动子,既可调控下游基因的表达又能解决转基因食品安全性问题。采用同源克隆方法从栽培大豆绥农14中克隆了2 278 bp的豆荚特异性启动子Pmsg,与GenBank上的大豆msg基因启动子序列相似性为99%。构建了由启动子Pmsg调控经人工改造、具有抗大豆食心虫功能的基因(Cry1Iem)的表达载体pBMBt,以及由种子特异性启动子PGy2调控Cry1Iem基因的表达载体pBGBt,为抗大豆食心虫基因工程研究奠定了重要基础。     

小麦DREB基因的克隆及植物表达载体构建

脱水应答元件结合蛋白在高等植物应答干旱、高盐和低温胁迫中发挥重要的作用。根据GenBank中小麦(Triticum aestivum L.)DREB基因的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术从小麦中克隆了DREB基因837 bp的编码区。为进一步研究小麦DREB基因的功能,以pMD18-T-DREB质粒为模板,PCR扩增DREB基因片段,构建了该基因的植物表达载体。经菌液PCR和测序鉴定后,转化到农杆菌LBA4404中,为通过转基因技术深入研究小麦DREB基因的功能奠定了基础。     

花药特异表达基因TaRAFTIN1a启动子的克隆及表达载体构建

组织特异性启动子是植物基因工程改良的重要工具。RAFTIN是禾本科植物花药绒毡层中特异积累与花药发育相关的蛋白,其调控序列可能提供一个很好来源的花药特异性表达启动子。为了解小麦TaRAFTIN1a基因启动子的花药表达特异性,本研究分离了TaRAFTIN1a基因的启动子,生物信息学分析表明,该启动子含有3种花药特异表达元件(总计10个),1个ABRE脱落酸响应元件,TGACG-motif与CGTCA-motif茉莉酸甲酯响应元件各1个,8个ARR1AT细胞分裂素响应元件,以及2个DRE和1个MBS干旱响应元件。采用5'端缺失的方法,分别克隆1429、898和351 bp的启动子片段,经连接、转化与鉴定,构建了3个含TaRAFTIN1a启动子不同区段融合GUS报告基因的植物表达载体,p WAER1,p WAER2,p WAER3,为通过转基因了解启动子的表达特征及其核心作用元件奠定了基础。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因植物表达载体的构建

以含鸡传染性法氏囊病病毒(杭州分离株,HZ96)VP2基因的质粒 PBS为模板,根据其序列设计引物进行PCR扩增,得到1.5 kb左右长的VP2基因产物;用KpnⅠ和 SalⅠ酶切纯化的PCR产物;将纯化的酶切产物在 T4 DNA连接酶的作用下定向克隆到植物表达载体Cambia1301 水稻胚乳特异性启动子GT1下游, 并经PCR、酶切和测序鉴定.植物重组表达载体经三亲交配已导入根癌农杆菌中.     

Bt基因的克隆及植物表达载体的构建

试验将从质粒pB110上克隆得到的Bt基因的片段,连接到高效的植物表达载体质粒pBI121上,此重组质粒经过限制性内切酶酶切分析和PCR鉴定,证明含有抗虫基因的植物表达重组质粒已构建成功。     

大麦核糖体失活蛋白基因与天花粉蛋白基因双价植物表达载体的构建

大麦核糖体失活蛋白(B-RIP)和天花粉蛋白(TCS)均具有广谱抗病毒作用,研究构建了分别由2×CaMV35S启动子调控的大麦核糖体失活基因(rip)和天花粉蛋白基因(tcs)双价植物表达载体pABTR,其植物选择标记为新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ),适用于双子叶植物的遗传转化。并通过三亲本杂交法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为通过农杆菌介导法将双价基因导入植物,培育理想的抗病毒转基因植物奠定基础。     

苏云金芽孢杆菌aiiA基因的克隆及植物表达载体构建

N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)是革兰氏阴性细菌致病过程中的关键信号分子,芽孢杆菌中广泛存在的aiiA基因编码AHL-Lactonase能够水解信号分子AHLs。利用PCR方法从苏云金芽孢杆菌中克隆了aiiA基因,序列分析表明该基因由753个碱基组成,编码含有250个氨基酸残基的蛋白质,核苷酸序列与已报道aiiA的同源性为89%～97%。将该基因连接到植物表达载体pCAMBIA1301中,成功构建了aiiA基因的植物表达载体pCAM-aiiA,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础。     

Wun1启动子Me13''''非转录区的克隆及Hrp基因植物表达载体的构建

采用PCR技术,分别从马铃薯、金花菊基因组DNA中扩增到了马铃薯损伤诱导启动子Wun 1,和对启动子活性有显著增强作用的Me1 3 非转录区。经序列同源性分析表明,马铃薯损伤诱导启动子Wun 1与已知序列的同源性为96.86 %,Me1 3 非转录区的同源性达99 %。得到的Wun 1克隆与原序列有一定的差异,尤其在735～768处差异较大,为一新颖的启动子,现已注册到分子生物学GenBank数据库(GenBank, gi: AY485646)。利用来自欧文氏梨火疫病菌的Hrp基因与克隆的Wun 1启动子和Me1 3 非转录区构建了Wun 1-Hrp-Me1 3 植物表达载体pBI WHM,同时构建了CaMV 35S-Hrp-Me1 3 植物表达载体pBI HM,为下一步鉴定Wun 1启动子和Me1 3 增强子对Hrp基因表达活性的影响及通过遗传转化培育植物抗病品种奠定了基础。     

韧皮部特异性启动子的克隆及含绿色荧光蛋白报告基因新植物表达载体的构建

用PCR方法扩增得到了长度为966bp的笋瓜韧皮部蛋白2基因启动子片段,克隆人pUCm—T载体后,获得了新的重组质粒pUCm—PSP．分别用限制性内切酶酶切重组质粒和pCAMBIA1302植物表达载体,经回收、连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的新型植物表达载体pHZ03．利用细胞感受态法将新植物表达载体分别导入根癌农杆菌EHA105、GV3101、LBA4404和发根农杆菌Ri15834中．     

胰蛋白酶抑制剂SKTI3基因的克隆及其植物表达载体的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因SKTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654 bp,与已发表的SKTI3基因序列同源性达99%。将目的基因片段插入到pB I121 35S启动子下,构建重组质粒pB ISKTI3,采用冻融法将该重组质粒转入农杆菌EHA105中,获得了植物表达载体。     

杀虫基因高效植物表达载体的构建

以质粒pCAMBIA1200、pBI121、pMMAR和pC1300MAR为基础,通过酶切连接,构建植物中间载体pC2MARHyg;再利用pAVAc质粒、载体pGA1611和中间载体pC2MARHyg,构建含有Ubi-1启动子、顺向重复MAR和杀虫基因AVAc的高效植物表达载体pC2MAR-AVAc,然后转化农杆菌EHA105,经筛选鉴定获得阳性克隆,为进一步开展植物抗虫基因工程研究奠定基础。