水牛抑制素α亚基基因的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法从水牛卵巢总RNA中扩增抑制素α亚基基因,并克隆入pMD18-T载体,进行PCR、双酶切及测序鉴定.序列分析结果表明:水牛抑制素α亚基基因编码序列长为1 083 bp,编码360个氨基酸,与牛、人、猪抑制素α亚基基因CDS成熟蛋白氨基酸的同源性分别为96%、80%、87%,表明抑制素α亚基是一组在进化上高度保守的蛋白质.将水牛抑制素α亚基基因CDS克隆到pET-30a表达载体中,转化宿主菌BL21(DE3)进行原核表达.在1 mmol/L IPTG 中,37 ℃诱导表达4 h后抑制素α亚基基因重组蛋白可成功获得表达.将表达产物进行SDS-PAGE分析,结果表达产物主要以包涵体形式存在,分子质量约为40 ku.     

小尾寒羊CIB1基因全长cDNA克隆及原核表达

本研究旨在克隆小尾寒羊钙粘和蛋白1(Calcium and integrin binding protein 1,CIB1)基因cDNA全长,并在原核载体中表达.参照已发表的CIB1基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,采用RT-PCR法,从小尾寒羊睾丸组织中扩增获得CIB1基因全长cDNA.将其克隆到pMD19-T载体,并进行测序分析.将该基因编码区重组于融合表达质粒pET32a中,构建了重组原核表达载体(pET32a-CIB1).将其转化到BL21(DE3)pLysS宿主菌中,用IPTG进行诱导表达.结果表明,克隆的CIB1基因cDNA与GenBank上登录的牛、猪、猕猴、人、小鼠、大鼠、黑猩猩等动物该基因序列的同源性达90%以上,编码氨基酸的同源性在93%以上,并且该序列包含有完整的开放阅读框,大小为576 bp.实现了高效特异性融合表达,表达产物的分子质量约为38 ku.本研究结果为进一步研究CIB1蛋白功能打下良好的基础.     

水牛ghrelin基因原核表达载体构建与蛋白表达

为了研究水牛ghrelin基因的结构与功能,本试验对水牛ghrelin基因进行原核表达载体构建与融合蛋白表达条件的优化。采用RT-PCR方法从水牛胃组织的总RNA中扩增出ghrelin编码区,连接到pRSET-a载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆子,用IPTG进行诱导表达条件的优化。结果表明,成功构建原核表达载体pRSET-a-ghrelin,在2 mmol/L IPTG,37℃的条件下诱导表达4 h,水牛ghrelin重组蛋白可成功获得表达,经SDS-PAGE鉴定发现,ghrelin融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约为20 ku,其表达量占总菌体蛋白量的35%。本试验结果为进一步研究水牛ghrelin基因的结构和功能提供有价值的生物学信息。     

洛阳土种鸡IL-2 cDNA的克隆及原核表达

应用RT-PCR技术从新城疫I系疫苗诱导的洛阳土种鸡胚脾淋巴细胞中扩增到全长0.43kb的鸡IL-2基因cDNA,将IL-2cDNA克隆到PMD-T载体,测序结果表明,该基因为不含终止密码子的目的基因。将该目的基因克隆到原核表达载体PET-28a,获得的重组质粒PET-28a-IL2经酶切、PCR及序列测定,表明IL-2基因插入的位点、大小与读码框均正确。PE-28a-IL2在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE电泳分析,在14ku处出现一条约占总蛋白21％的蛋白带,表明所克隆的IL2基因在大肠杆菌中得到良好的表达,为进一步研究IL-2的生物学特性奠定了基础。     

来航鸡FOXL2基因的克隆与原核表达

根据GenBank已发表的红色原鸡FOXL2基因序列(登录号NM_001012612.1)设计引物,以来航鸡全血为模板,PCR扩增出其基因全长编码区,经BamHⅠ-HindⅢ双酶切后定向克隆于pET28a原核表达载体,获得pET28a-FOXL2重组原核表达载体.将携带有重组原核表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)通过0.5 mmol/L IPTG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大小大约为37 000,与预期表达蛋白大小一致.Western blotting检测显示该蛋白为His融合蛋白,表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白.为进一步探索该基因的生物学功能奠定了基础.     

银狐生长激素cDNA克隆和原核表达

为了获得重组的银狐生长激素,本试验用Trizol的方法从银狐脑垂体组织中提取总RNA,以mRNA为模板,用RT-PCR方法扩增出生长激素成熟cDNA片段并克隆到载体质粒pMD18-T中;通过含有BamHⅠ酶切位点的特异引物从pMD18-T-fGH中亚克隆出cDNA片段,并将其重组到pPROEX^TMHta质粒中,构建了银狐生长激素原核表达质粒pPROEX^TMHta-fGH。将pPROEX^TMHta-fGH原核表达质粒转化DH5α大肠杆菌,用终浓度1 mmol/L IPTG进行诱导,通过SDS PAGE进行检测。结果表明在转化的大肠杆菌中检测到分子量为26 kD的fGH蛋白的存在,表达量占菌体蛋白总量的35%,并且表达产物以包涵体的形式存在。     

水牛SERPINE2基因的克隆、生物信息学及组织表达分析

本试验对水牛SERPINE2基因进行生物信息学分析,探索其在水牛不同组织器官中的表达规律,旨在为研究SERPINE2在水牛生殖过程中的具体调控机制提供理论支持。利用PCR技术克隆水牛SERPINE2基因CDS区的全长序列,在线生物信息学分析程序对SERPINE2进行分析,实时荧光定量PCR技术检测SERPINE2 mRNA在水牛不同组织的表达水平。结果表明：SERPINE2基因CDS区长度为1 191 bp,编码397个氨基酸,通过分析相似性结果,发现水牛和牛、绵羊、山羊的相似性为99.6%;系统进化树结果显示,遗传距离最近的是水牛和牛,绵羊次之。在组成SERPINE2蛋白的氨基酸中,缬氨酸含量较高,占氨基酸总数的9.6%。SERPINE2蛋白是一种不稳定的亲水蛋白,SERPINE2有一个信号肽,没有跨膜结构域。SERPINE2蛋白的二级结构中,α-螺旋结构的占比最高,为41.56%。多个器官检测出SERPINE2 mRNA的表达,其中在卵巢的表达量显著高于其他器官,说明SERPINE2基因可能与卵巢生长发育有重大联系。     

水牛Sox2基因原核表达载体的构建与诱导表达

水牛Sox2基因对体内胚胎的早期发育至关重要,它是重要的多能性干细胞(iPS细胞)标记基因之一,试验通过双酶切重组质粒pMD18-T-Sox2,将水牛Sox2基因定向克隆入原核载体pET-32a(+),成功构建了原核表达载体pET-Sox2,然后利用IPTG诱导,获得诱导表达蛋白,并经过SDS-PAGE电泳分析和Wes...     

水牛TLR2cDNA的克隆与生物信息学分析

本研究通过RT-PCR分段扩增得到水牛Toll样受体2(TLR2) cDNA序列,并利用亚克隆重叠区进行全长序列拼接.将拼接产物与pMD20-T栽体连接,重组质粒经PCR酶切鉴定后测序,并进行生物信息学分析.结果表明,克隆得到的序列全长2 455 bp,含有一个大小为2 355 bp的开放阅读框,共编码784个氨基酸,...     

中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2cDNA的克隆与原核表达

本试验旨在克隆并表达中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation protein -2,MD-2)基因,并用Western blotting进行鉴定。采用RT-PCR技术从中国荷斯坦奶牛外周血白细胞中扩增MD-2 cDNA,并将扩增产物与pMD20-T载体连接,重组质粒经测序鉴定后,构建pET28a-MD-2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果表明,目的基因含有1个483 bp的开放阅读框,编码161个氨基酸;与黄牛、黑猩猩和小鼠MD-2的cDNA序列同源性分别为99.38%、77.02%、68.12%,氨基酸同源性分别为98.75%、65.00%和58.13%。融合蛋白以包涵体的形式存在,分子质量约为25 ku。说明本研究成功克隆并表达了中国荷斯坦奶牛MD-2 cDNA,为其进一步的功能研究提供了理论依据。     

水牛浮舰蛋白2基因克隆及序列分析

试验旨在克隆水牛浮舰蛋白2(Flotillin 2,FLOT2)基因并对其进行生物信息学分析,为揭示该基因在水牛发育繁殖中的作用奠定基础。本研究通过PCR扩增获得了FLOT2基因全长并进行克隆测序,结合生物信息学分析方法,预测及分析其蛋白质结构。结果表明,水牛FLOT2基因编码区长1 287 bp,编码428个氨基酸,3'UTR区长277 bp。多重序列比较分析显示,水牛FLOT2基因核苷酸序列与牛、山羊、绵羊、小鼠、马、猫和人相应序列的相似性分别为98%、98%、97%、90%、93%、92%和92%,系统进化树分析结果表明,FLOT2基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性。对FLOT2蛋白质的分析表明,该蛋白呈弱酸性,无信号肽,细胞亚定位于细胞质中,存在SPFH_flotillin和SPFH_hflk等结构域。microRNA预测结果表明,bta-miR-2438、bta-miR-2379和bta-miR-1777a可能是其3'UTR潜在靶标。研究结果为今后阐明FLOT2基因在水牛繁殖性能中的功能,尤其是在配子及胚胎发生过程中的作用及分子机制奠定了基础。     

Cloning and Sequence Analysis of Buffalo FLOT2 Gene

In order to clarify the effect of Flotillin 2 (FLOT2) gene on the reproductive performance of buffalo, buffalo FLOT2 gene was cloned and analyzed by bioinformatics.FLOT2 was cloned by PCR, cloned and sequenced, then its protein structure was predicted and analyzed by bioinformatics tools.The results showed that the coding region of buffalo FLOT2 gene was 1 287 bp, 3'UTR was 277 bp, encoded 428 amino acids.The buffalo FLOT2 gene shared 98%, 98%, 97%, 90%, 93%, 92% and 92% of similar nucleotide sequence with that of Bos taurus, Ovis aries, Capra hircus, Mus musculus, Equus caballus, Felis catus and Homo sapiens, respectively.Phylogenetic tree analysis showed that FLOT2 gene was highly conserved in different species and evolution.FLOT2 protein was weakly acidic, without signal peptide, located in the cytoplasmic, and with the presence of SPFH_flotillin and SPFH_hflk domain.microRNA prediction showed bta-miR-2438, bta-miR-2379 and bta-miR-1777a maybe target the 3'UTR of buffalo FLOT2.In a word, this study provided an important reference for surveying the regulation mechanism of FLOT2 gene in buffalo reproductive performance, especially, during buffalo gametogenesis and embryogenesis.     

水牛FADS2基因的电子克隆及序列分析

试验旨在利用电子克隆法对水牛Δ6脂肪酸脱氢酶（Δ6-fatty acid desaturases,FADS2）基因进行克隆和生物信息学分析,为探究FADS2基因对水牛泌乳性能的作用机制奠定基础。以奶牛FADS2基因序列（GenBank登录号：NM_001083444.1）为探针设计引物,利用电子克隆法克隆水牛FADS2基因,并通过RT-PCR验证,对FADS2基因的序列特征进行生物信息学分析。测序结果表明,水牛FADS2基因序列全长为36 600 bp,由12个外显子和11个内含子组成,包含一个长1 335 bp的开放阅读框,可编码444个氨基酸。序列同源性分析显示,水牛FADS2基因编码序列与牦牛、黄牛、人、猪、家兔、虎鲸和褐家鼠序列的同源性分别为98.88%、98.88%、89.66%、90.79%、90.85%、92.35%和87.11%。蛋白质预测分析表明,水牛FADS2蛋白分子质量为52.51 ku,理论等电点（pI）为8.75,呈弱碱性,属于亲水性蛋白,无信号肽。系统进化树分析结果表明,FADS2基因在不同物种及进化的过程中具有高度保守性,其中水牛与牦牛、黄牛亲缘关系较近,与褐家鼠亲缘关系较远。水牛FADS2基因的成功克隆为今后阐明水牛泌乳性能的作用机制奠定了基础。     

Cloning and Bioinformatics Analysis of FADS2 Gene in Buffalo

This study was aimed to clone the buffalo Δ6-fatty acid desaturases (FADS2) gene using in-Silico cloning and analyze its genetic struction with bioinformatics, which provide a foundation for investigating the milk performance in buffaloes. Primers were designed according the sequence of FADS2 gene in dairy cow (GenBank accession No.:NM_001083444.1). The FADS2 gene was amplified by RT-PCR, and its sequence was analyzed by bioinformatics. Sequence analysis revealed that the buffalo FADS2 gene had 36 600 bp in length and consisted of 12 exons and 11 introns, containing an open reading frame (ORF) of 1 335 bp which encoding 444 amino acids. Sequence homology analysis indicated that the buffalo FADS2 protein gene showed 98.88%, 98.88%, 89.66%, 90.79%, 90.85%, 92.35% and 87.11% identity with that of Bos mutus, Bos taurus, Homo sapiens, Sus scrofa, Oryctolagus cuniculus, Orcinus orca and Rattus norvegicus, respectively. Protein prediction analysis showed that the molecular weight and isoelectric point (pI) of buffalo FADS2 were 52.51 ku and 8.75, respectively, and the FADS2 protein was weak alkali and the hydrophobicity protein without signal peptide. Phylogenetic tree analysis showed that FADS2 gene was highly conserved in different species and evolutionary processes,buffalo was close to Bos mutus and Bos taurus, and was far from Rattus norvegicus. This study suggested that FADS2 gene was successfully cloned in buffalo, which laid a foundation for clarifying the mechanism of milk performance in buffalo.     

猴B病毒囊膜蛋白gC基因密码子优化及其在大肠埃希菌中的表达

根据猴B病毒E2490标准株gC基因,选择大肠埃希菌偏好的密码子,设计合成了1 200个碱基,共编码400个氨基酸,测序证实后,克隆入pET-28b(+)载体,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),在IPTG诱导下获得50 ku以包涵体形式表达的gC重组蛋白.Western blot分析表明表达产物能够被猴B病毒标准阳性...     

猪圆环病毒2型Cap全基因的克隆与原核表达

Cap蛋白是猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的主要结构蛋白,能诱导免疫保护,是临床上利用血清学诊断PCV2的主要依据。本研究根据PCV2 TJ株全基因核苷酸序列(GenBank登录号:KC751546)设计特异性引物,利用PCR从PCV2 TJ株扩增获得Cap全基因,将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET32a-Cap,经IPTG诱导获得约48 ku的重组融合蛋白,Western blotting分析结果表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体和PCV2阳性猪血清均呈阳性反应。本研究成功克隆Cap全基因,构建原核表达载体,并实现Cap融合蛋白的表达,这为PCV2 Cap蛋白的功能研究及诊断方法的建立和亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

猪瘟病毒NS23'端基因的克隆与原核表达

从真核表达载体pEGFP-NS2中克隆得到猪瘟病毒(CSFV)NS2 3'端的基因片段,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达.结果表明,克隆了大小为363 bp NS2 3'端的基因,重组载体pET-NS2-C363在大肠埃希菌中以包涵体形式表达,表达产物经SDS-PAGE和Weste...     

单核细胞增生李斯特菌精氨酸脱亚胺酶基因的克隆及原核表达

精氨酸脱亚胺酶(ADI)可能介导单核细胞增生李斯特菌抗酸应激,由arcA基因编码。利用分子克隆技术从单核细胞增生李斯特菌10403S扩增得到ADI基因,测序正确后将其插入pET30a表达载体中,构建该基因的原核表达质粒pET30a-ADI,并转化入大肠埃希菌Rosetta中进行诱导表达。核苷酸序列分析显示,ADI基因的完整开放阅读框为1 233 bp,编码410个氨基酸。SDS-PAGE表明:该基因在大肠埃希菌中成功表达,重组蛋白的分子质量约为52.5 ku。为进一步研究精氨酸脱亚胺酶的活性提供了条件,同时也为探索单核细胞增生李斯特菌抗酸应激的机理奠定了重要的基础。