副猪嗜血杆菌ERIC-PCR指纹图谱多样性研究

建立了副猪嗜血杆菌ERIC-PCR分型技术,并应用于临床分离菌株的流行病学调查。试验结果表明,47株副猪嗜血杆菌产生28种不同的指纹图谱,分离自同一猪场和相同血清型的菌株表现出不同的指纹图谱,不能进行血清分型的副猪嗜血杆菌应用该方法可得到充分区分,证实副猪嗜血杆菌ERIC指纹图谱存在丰富的多样性,ERIC-PCR方法是副猪嗜血杆菌流行病学规律分析的有效方法。     

2012～2014年江西地区副猪嗜血杆菌分离株ERIC-PCR指纹图谱分析

在对15种副猪嗜血杆菌血清型参考株鉴定获得15种不同ERIC-PCR指纹的基础上,对2012~2014年分离自江西地区41株副猪嗜血杆菌临床分离菌株进行指纹鉴定。结果表明,41株副猪嗜血杆菌产生20种不同的指纹图谱,相同血清型的菌株表现出不同的指纹图谱,无法进行血清分型的副猪嗜血杆菌应用该方法可得到充分区分。该方法证实副猪嗜血杆菌ERIC-PCR指纹图谱存在丰富的多样性,可适用于副猪嗜血杆菌的快速基因分型及分子流行病学调查。     

中国东南部地区副猪嗜血杆菌分离株ERIC-PCR指纹图谱分析

采用肠杆菌基因间重复一致序列PCR方法,在对15种副猪嗜血杆菌血清型参考株鉴定获得15种不同ERIC-PCR指纹的基础上,对分离自中国东南部发生Glasser's病的不同猪场的111株副猪嗜血杆茵进行了指纹鉴定.结果显示:111株分离株显示出23种指纹图谱,前3种最流行的指纹图谱为ERIC-PCR X X(20/111),X X ⅢⅠ(9/111)和Ⅳ(8/111).且在111株分离株中,来自不同地区的分离株分别表现出不同种类的指纹图谱.该试验表明,ERIC-PCR方法可适用于对某一地区的副猪嗜血杆菌进行分子流行病学的研究和基因型的鉴定;试验结果还揭示了副猪嗜血杆茵在中国东南部地区已广泛存在并具有多样的基因型.     

6株副猪嗜血杆菌基因组DNA的PCR指纹图谱研究

根据肠道菌基因闻重复一致序列，设计了一对特异性引物，采用ERIC-PCR和RAPD技术，研究了副猪嗜血杆菌6个分离菌株的指纹图谱和DNA多态性。结果表明，6个分离株的PCR指纹图谱与15个标准血清型指纹图谱相比较可分辨出4种血清型；6个分离株的RAPD研究结果均表现出多态性。有意义的是，6个菌株的多态性DNA片段也能明显将其分为4种类型的副猪嗜血杆菌，与特异性引物PCR结果相一致。该研究可作为流行病学调查和该菌的分子分型快速诊断方法的基础。     

新疆北部部分地区副猪嗜血杆菌的ERIC-PCR指纹聚类分析

为了解新疆北部部分规模化养猪场副猪嗜血杆菌(H.parasuis)分离株的基因型,本实验采用ERIC-PCR方法结合统计学分析软件,对来源不同的12株H.parasuis进行分子指纹图谱分析.结果表明12株分离株分别位于4个聚类中,各个菌株之间的遗传距离较近,并且含有长度为1 000 bp的相同条带,相同血清型的分离株在其分子指纹聚类上均位于同一个分支中.试验结果表明基于ERIC-PCR的分子指纹聚类分析结合传统的琼脂免疫扩散法可以准确地对不同分离株H.parasuis进行分型.试验结果显示H.parasuis在该地区广泛存在并具有多种不同的基因型,同时为该地区H.parasuis的免疫防治提供了重要的实验依据.     

副猪嗜血杆菌分型方法的研究进展

副猪嗜血杆菌是正常猪群上呼吸道的一种常在菌,但其在特定条件下可以侵入机体并引起严重的全身性疾病.由于同一猪场甚至同一头猪内可能存在多种不同的菌株,因此确定可能导致临床发病的特定菌株显得尤其重要.本文就副猪嗜血杆菌的分型方法进行综述,以期为该病的流行病学调查,临床诊断和防治提供参考.     

一种副猪嗜血杆菌新型分型方法——多基因位点序列分型

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)为革兰氏阴性菌,属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属,是猪副猪嗜血杆菌病的主要致病菌.应用多基因位点序列分型技术对副猪嗜血杆菌进行分型,具有简便快速、重复性强、分辨率较高、所得数据标准等优点.并且还可通过互联网实现实验室间数据共享及比较.通过试验对多基因位点序列分型(MLST)技术的原理、方法及结果进行了阐述.以期为副猪嗜血杆菌的分型提供参考.     

副猪嗜血杆菌分型方法的研究进展

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPs）引发一种以多发性浆膜炎、关节炎及高死亡率为特征，严重危害仔猪和青年猪的传染病。由于该病在近几年发生频繁．受到人们的广泛重视，细菌分离鉴定、血清分型等基础工作基本完成，而毒性因子、保护性抗原及其分子生物学研究并不深入。自然界中的副猪嗜血杆菌具有很大的异质性，群体形态学、荚膜材料、全细胞和外膜蛋白等方面的特性有很大的变化。传统的血清学方法将副猪嗜血杆菌分为15个标准血清型，而20％左右的临床分离菌株不能用血清学方法分型。随着现代生物技术的发展，蛋白质多态性分析技术、限制性酶切片断长度多态性分析技术和PCR技术等应用于副猪嗜血杆菌的分型鉴定，形成多种分型方法，为副猪嗜血杆菌的鉴定和副猪嗜血杆菌病的诊断提供了新技术。     

2009～2010年华南地区副猪嗜血杆菌分离株ERIC-PCR指纹图谱的鉴定和分析

本试验采用肠杆菌基因间重复一致序列多态性聚合酶链式反应(ERIC-PCR)对2009~2010年分离自华南地区的41株副猪嗜血杆菌野生菌株及15株参考菌株进行了指纹图谱的鉴定。利用BioNumerics 5.1软件对所有菌株的ERIC-PCR指纹图谱进行分析,结果显示,15株具有不同血清型的参考菌株均具有不同的指纹图谱;41株华南地区副猪嗜血杆菌野生分离株则具有26个不同的指纹图谱,该方法对所有56株副猪嗜血杆菌的鉴别率为0.984。由此可见,ERIC-PCR分型方法具有较好种间的鉴别能力,可作为副猪嗜血杆菌病流行病学研究中的一种有效的辅助分子手段。     

副猪嗜血杆菌分型方法的研究现状与进展

副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道的一种常在条件性致病菌,以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征,随着近年来分子生物学及相关技术的迅猛发展,副猪嗜血杆菌的分型方法得以快速发展,各分型技术成为研究其流行病学的重要手段.     

副猪嗜血杆菌野外分离株的ERIC-PCR 及其外膜蛋白图谱分析

为了解副猪嗜血杆菌(HPS)现地分离株的流行情况及其进化来源,本研究采用肠杆菌科基因间重复一致序列PCR(ERIC-PCR)分型和外膜蛋白(OMP)分型技术对采集自3个猪场的24株HPS分离株进行分型.结果表明,以ERIC-PCR法分析24个分离株共产生10种DNA指纹图谱,依次分别包含5株、3株、1株、7株、1株、2株、1株、1株、2株和1株分离株.其中一个猪场的分离株仅为图谱Ⅰ和Ⅱ,另外两个猪场分别为图谱Ⅲ、Ⅳ、V和Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、X.试检测结果表明同一猪场存在的菌株有两种或两种以上基因型,并且不同猪场流行的基因型不同.采用OMP分型也表现出与ERIC-PCR分型一致的结果.因此,ERIC-PCR和OMP分型均可以用于HPS的流行病学调查.     

副猪嗜血杆菌流行病学调查及两株分离株耐药性和致病性分析

为了解山东地区副猪嗜血杆菌病的流行情况和流行菌株的生物学特性及致病性,将2016-2018年山东省12个地区送检的103个发病猪的病料进行细菌分离,并对疑似菌株进行形态学观察、PCR鉴定及血清型鉴定,对两株流行菌株进行了培养特性观察、生化特性鉴定、药敏试验及致病性研究。最终分离获得29株副猪嗜血杆菌,分离率为28.16%,其中血清型4型和5型最为流行,其次是1型和12型。该病多发于春秋两季,31~50日龄的仔猪感染率最高。两株流行菌株LZ株和LC株均对青霉素类、头孢类等药物高度敏感,LZ株对庆大霉素、卡那霉素等中度敏感,对林可霉素、链霉素不敏感,LC株对庆大霉素、林可霉素等中度敏感,对卡那霉素、链霉素不敏感;生化特性试验结果显示,LC株和LZ株的硝酸盐还原试验、接触酶试验、葡萄糖发酵试验以及果糖发酵试验的结果均为阳性,吲哚试验、氧化酶试验、甘露醇发酵试验的结果均为阴性;动物致病性试验表明LZ株和LC株均具有较强的毒力,最小发病剂量分别为4.5×10^9 CFU和6.0×10^9 CFU。该研究为副猪嗜血杆菌病的防治提供了重要的参考依据。     

89株副猪嗜血杆菌临床分离株血清型、基因型鉴定与分析

旨在明确副猪嗜血杆菌（HPS）临床分离株分离部位的组织分布,进而探讨其血清型和基因型的流行分布特点及相关性,为猪格氏病（Glässer's disease）的有效防控提供科学依据。针对临床分离鉴定的89株HPS,利用PCR技术鉴定血清型,统计各血清型HPS在不同分离部位的菌株分布数量;应用多位点序列分型（MLST）方法进行序列类型（ST）鉴定分析、位点多态性分析、BURST分群统计和UPGMA系统发育树聚类分析。89株HPS临床分离株共鉴定出9种血清型（1、2、4、5、7、11、12、13、14）以及未定型（NT）,血清4、13、7和5型为优势血清型,分别占比28.09%、22.47%、13.48%和10.11%,有64株HPS分离于肺,占比71.91%;24种ST型,ST267、ST268、ST387和ST365为优势基因型,分别占比26.97%、21.35%、8.99%和5.62%,每个基因位点存在3~13个等位基因,多态性位点从3（g3pd）到71（6pgd）不等,BURST分析中划分为2个单个ST型和11个克隆群（CC）,UPGMA系统发育树被分为4个分支,优势ST型处于2、3、4三个分支中,均对应具有毒力血清型的HPS分离株。HPS临床分离株流行血清型和基因型呈现多元化,具有明显的遗传异质性,同时,ST型与血清型存在一定的交叉性,且与HPS临床致病力相关。     

Identification and Analysis of Serotype and Genotype of 89 Clinical Isolates of Haemophilus parasuis

In this study, we aimed to determine the tissue distribution of clinical isolates of Haemophilus parasuis (HPS) to explore the epidemic distribution and correlation of its serotypes and genotypes, and to provide scientific basis for the effective prevention and control of Glässer's disease. According to the 89 strains of HPS isolated from the clinic, the serotypes of HPS were identified by PCR, and the number of HPS strains in different parts of the isolates was counted. Sequence type (ST) identification analysis, site polymorphism analysis, BURST cluster analysis and UPGMA phylogenetic tree cluster analysis were performed by using the multilocus sequence typing method. Nine serotypes (1, 2, 4, 5, 7, 11, 12, 13, and 14) and undetermined serotypes (NT) were identified from 89 HPS clinical isolates. Serotypes 4,13,7 and 5 were the predominant serotypes, accounting for 28.09%, 22.47%, 13.48% and 10.11%, respectively, and sixty-four strains of HPS were isolated from the lung tissues. ST267, ST268, ST387 and ST365 were dominant genotypes, accounting for 26.97%, 21.35%, 8.99% and 5.62%, respectively, there were 3-13 alleles at each locus, and the polymorphisms ranged from 3(g3pd) to 71(6pgd). The BURST analysis showed that the 89 HPS were divided into 2 single ST types and 11 clonal groups (CC). The phylogenetic tree of UPGMA had 4 branches, the dominant ST type was found in 2, 3 and 4 branches, which was corresponded to the HPS isolates with virulent serotype. The epidemic serotypes and genotypes of HPS are diversified and have obvious genetic heterogeneity. At the same time, ST types and serotypes have some crossover and are related to HPS clinical pathogenicity.     

乳胶凝集试验快速检测副猪嗜血杆菌

利用原核表达并经过纯化的副猪嗜血杆菌TbpB N端蛋白及人工合成的特异性多肽制备单克隆抗体,经碳化二亚胺(EDC)将纯化后的单克隆抗体IgG与羧化乳胶共价偶联,并对偶联乳胶的IgG含量及偶联时间等条件进行合理选择,建立了快速检测副猪嗜血杆菌的乳胶凝集试验方法.利用LAT方法检测148株副猪嗜血杆菌疑似菌株,参考16 S rRNA-PCR方法的结果,符合率为83.1%,且致敏乳胶不与临床常见菌株发生凝集反应.结果表明,此检测方法具有操作简便、快速、特异性高的特点,便于在基层推广使用,为副猪嗜血杆菌的诊断和有效防治提供了参考和依据.     

副猪嗜血杆菌OMP P5间接ELISA抗体检测方法优化

利用副猪嗜血杆菌(HPS)OMP P5基因表达并纯化复性后蛋白作为包被蛋白,通过对最佳加样作用时间的确定和最佳酶标二抗反应时间等条件的探索优化,建立针对副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5(OMPP5)的间接ELISA抗体检测方法,通过对进行和未进行HPS免疫的健康猪血清的检测,证实了建立的间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强、反应快速准确等特点,可用于HPS的快速诊断