养殖大菱鲆红斑溃疡病病原菌的生物学特性研究

为研究养殖大菱鲆Scophthalmus maximus红斑溃疡病病原菌的生物学特性,从辽宁葫芦岛地区养殖大菱鲆患病鱼的溃疡灶、肝脏、肾脏和脾脏中均分离到一株优势菌,命名为HLD01,该菌株呈乳白色,圆形,直径为(0.6±0.1)mm,表面湿润、光滑;用腹腔注射法和划伤浸泡法进行人工感染试验,这两种方法感染大菱鲆的半致死剂量分别为8.4×10⁷、6.3×107、6.3×10⁴CFU/mL,结果显示,人工感染患病大菱鲆体表出现与自然发病大菱鲆相同的溃疡灶及其他病症,表明菌株HLD01对大菱鲆有较强的致病力,可以引起养殖大菱鲆发生红斑溃疡病;生理生化鉴定结果显示,该菌与杀鲑气单胞菌无色亚种Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes相似度最高;基于16S rDNA序列构建的系统进化树结果显示,该菌与气单胞菌属Aeromonas细菌聚为一支。综合HLD01菌株各项生物学特征,将其鉴定为杀鲑气单胞菌无色亚种,该菌对庆大霉素、卡那霉素、菌必治、恩诺沙星等药物高度敏感,可参考选取以上药物来治疗和控制养殖大菱鲆溃疡病。     

养殖大菱鲆暴发性疖疮病的病原分离与组织病理研究

为探究大菱鲆Scophthatmus maximus疖疮病的病因及患病大菱鲆的组织病理学变化,从患病鱼体(体质量为180 g±10 g)分离到一株优势菌DLPJC01,经分子生物学鉴定为杀鲑气单胞菌无色亚种Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes,并进行了人工感染试验。结果表明:该菌株对大菱鲆有较强的致病力,证实其为疖疮病病原;药敏试验结果显示,该菌株对庆大霉素、头孢曲松、链霉素、头孢噻肟和新霉素5种抗菌药物高度敏感,对复方新诺明、环丙沙星、卡那霉素等13种抗菌药物完全耐药;组织病理学观察发现,病鱼呈现典型的急性全身性感染,各组织中均可见大量细菌团块;肌肉组织呈急性化脓性肌炎,肌细胞及脂肪细胞坏死,中性粒细胞渗出;肝、脾、肾、鳃和肠道等组织呈多灶性或弥漫性坏死,坏死细胞的细胞核碎裂、核染色质边移。研究表明,大菱鲆疖疮病的病原菌杀鲑气单胞菌亚种为典型的全身性感染菌,肝、脾、肾、鳃、肠道和肌肉是其主要的靶器官或靶组织。     

楠木溃疡病病原菌生物学特性及防治药剂筛选研究

【目的】明确楠木溃疡病病原菌生物学特性,筛选出林间病害防治有效的杀菌剂。【方法】以强致病菌株假可可毛色二孢Lasiodiplodia pseudotheobromae SCMN-BB-8为研究对象,进行病原菌生物学特性和杀菌剂室内抑菌效果测定,开展室内筛选药剂林间防治试验。【结果】菌株以PSA培养基（pH 7.0）在30℃进行培养最有利于菌丝生长,最适碳源为蔗糖或葡萄糖,最适氮源为硝酸钠和硝酸钙,光照对菌株菌丝生长影响不大;分生孢子最适萌发温度为30℃,与相对湿度密切相关;筛选出咯菌腈、甲基硫菌灵和氟硅唑3种室内外抑菌效果较好的杀菌剂。【结论】明确了楠木溃疡病病原菌株生物学特性,筛选出防效较好的杀菌剂,为该病害监测预报和防治工作奠定基础。     

甘肃省中部沿黄灌区马铃薯茎溃疡病病原菌生物学特性研究

采用常规组织分离法从马铃薯茎溃疡病新鲜病株上分离病原菌,通过形态学鉴定和致病性测定,确定引起甘肃中部沿黄灌区马铃薯茎溃疡病的病原菌是丝核菌属的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani).通过固体和液体培养方法研究了马铃薯立枯丝核菌的生物学特性,以明确碳氮营养、温度和pH值等培养条件对病原菌的菌落生长和菌丝干质量的影响.结果表明:在固体培养基上,菌落生长的最佳碳源为可溶性淀粉和蔗糖,最佳氮源为硝酸钾和蛋白胨,pH为6~7.在液体培养基上,最佳碳源为可溶性淀粉,最佳氮源为硝酸钾,pH为7,最佳振荡频率为80r/min.菌丝生长的最适温度在固体和液体培养基上均为25℃.     

贵州火龙果溃疡病病原菌鉴定及生物学特性

[目的]对贵州省火龙果溃疡病的病原进行鉴定及生物学特性研究,为贵州火龙果溃疡病的防治及病原菌的碳氮源代谢研究奠定理论基础.[方法]采用组织分离法、形态学观察以及分子生物学等方法对贵州火龙果溃疡病病原进行分离鉴定,并采用菌丝生长速率法及Biolog表型芯片技术研究病原菌生物学特性.[结果]贵州火龙果溃疡病病菌为新暗色柱节...     

贵州省火龙果溃疡病病原菌鉴定及生物学特性

【目的】火龙果溃疡病是火龙果上发生最为严重的病害之一,对贵州省火龙果溃疡病的病原进行鉴定及生物学特性研究,为防治贵州省火龙果溃疡病提供理论基础。【方法】采用组织分离法、形态学观察以及分子生物学等方法对贵州火龙果溃疡病病原进行分离鉴定,并采用菌丝生长速率法及Biolog表型芯片技术研究病原菌生物学特性。【结果】贵州火龙果溃疡病病菌为新暗色柱节孢（Neoscytalidium dimidiatum）;病原菌适宜生长温度为20~35℃,最佳生长温度为28℃,最适pH为6～7;光照对菌丝生长有抑制作用,短时间的紫外光照射对病原菌生长有促进作用。火龙果溃疡病菌对PMl、PM2微孔板中190种碳源物质利用率为18.42%,对PM3微孔板中95种氮源物质的利用率为52.63%。【结论】贵州火龙果溃疡病病菌为新暗色柱节孢（Neoscytalidium dimidiatum）,病原菌较耐高温,生长环境偏酸性。研究结果对贵州火龙果溃疡病的防治及病原菌的碳氮源代谢研究奠定了理论基础。     

银鹊树溃疡病病原菌的研究

通过分离培养、人工接种和病原鉴定,确定银鹊树溃疡病的病原为茄腐皮镰孢菌(Fusarium solani(Martius)App. etWr.),有性世代未见。病菌菌丝生长适温25～33℃,低于10℃、高于38℃均不能生长,且大孢子的产生量与温度有关;对pH值要求不严,在pH为2～10时均可生长;其菌丝在PDA 和马丁氏培养基上生长最佳,大型分生孢子产生量多,在银鹊叶煎汁和清水洋菜培养基上生长一般。在利用碳源上以葡萄糖、蔗糖和鼠李糖生长最好,半乳糖、果糖次之,木糖最差。分生孢子萌发的适宜温度为25～30℃,大孢子萌发以10% 银鹊叶煎汁及2% 葡萄糖液最好(达98% ),6h 达到萌发盛期;小孢子10h为萌发盛期,且在上述两种营养液中的萌发率仅为40.3% 和36.0% 。     

朱顶兰红斑病的研究——(Ⅰ)症状、病原菌及生物学特性

病菌(Stagonospora curtisii)主要危害朱顶兰(Amaryllis vittata)叶片及花梗,其次危害鳞茎。病斑呈椭圆形、纺缍形或半圆形。被害部初期呈鲜红色,后期转赭红色,其上密生黑色小点。菌丝生长的适宜温度为15～30℃,最适为25℃;适宜pH位为4～9,最适为6左右;菌丝生长对培养基具有一定的选择性,以PSA培养基最佳;对碳源的利用以蔗糖、葡萄糖最佳,山梨糖最差;对氮源的利用,有机氮及无机氮均能利用,其中以牛肉浸膏和门冬酰胺最佳,尿素最差;分生孢子萌发的适宜温度为15～30℃,最适为25℃,高于35℃或低于8℃时孢子均不能萌发。     

大果沙棘溃疡病病原菌的鉴定及生物学特性研究

对大果沙棘溃疡病的症状、病原菌形态学特征、致病性测定以及生物学特性进行了研究。根据病原菌的形态特征鉴定为壳梭孢属葡萄生壳梭孢（Fusicoccum viticolum）。室内外的回接试验结果表明,壳梭孢菌是大果沙棘溃疡病的病原菌。通过生物学特性研究,壳梭孢菌生长的适宜温度为25~28℃,最佳为25℃,最佳pH值为7.5,全光照条件下生长速度较快,生长的最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为牛肉膏。     

养殖大菱鲆出血性败血症病原菌致病性的研究及鉴定

从全身弥漫性出血合并腹水的养殖大菱鲆Scophthalmus maximus的腹水、肝脏和肾脏中分离到3株菌落形态相同的优势菌,编号为L-49231、L-59231、L-59232。选用L-49231菌,通过注射、浸泡和灌喂3种途径分别对两种规格(全长(12±2)cm,体重(30±2)g;全长(18±2)cm,体重(125±5)g)的养殖大菱鲆进行人工感染试验,结果证实:此菌可经上述3种途径造成该病的发生,注射和浸泡方式的感染率均为100%,死亡率分别为100%和66.7%;灌喂方式未见死亡,感染率为85.7%。该菌经革兰氏染色为阴性,杆状,大小为2~3μm×1~1.2μm,周生鞭毛,兼性厌氧,接触酶为阳性,氧化酶为阴性,V.P试验为阴性。根据《常见细菌系统鉴定手册》所描述的爱德华氏菌属的生理生化特性,菌株L-49231为迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda。     

养殖大菱鲆“皮疣病”的初步研究

于2003年5月至2005年8月对4家养殖场患皮疣病的大菱鲆Scophthalmus maximus病鱼进行了病理学研究。结果表明:病鱼的疣状突起是由皮肤表皮层细胞发生异常增生所致,增生的表皮细胞较正常表皮层细胞大,细胞形态较为一致,胞浆淡染,呈嗜碱性,核大,核仁明显;增生部位的基底部细胞排列整齐,不呈浸润性生长,内有真皮结缔组织深入其中。电镜观察发现:增生的表皮细胞间松散排列,连接减少,间隙较大,胞质向外形成许多丝足;核质比增大,核型不规则;细胞器数量较少,胞浆内出现大量小泡围绕胞核排列,空泡内有电子密度较低的颗粒状物质;细胞间隙中有淋巴细胞浸润。病理学研究显示:该病明显不同于鱼类的淋巴囊肿病,而应属于一种乳头状瘤;患病机体表现出以淋巴细胞增生为主要的病理变化特点,通过淋巴细胞和单核巨噬细胞来参加对该病的免疫应答反应。病原分析结果排除了霉菌、寄生虫和细菌感染的可能性。在部分病鱼的脾脏中发现了病毒粒子,但该病毒粒子与疣状突起发生的关系尚待进一步研究。     

养殖大菱鲆“皮疣病”的初步研究

于2003年5月至2005年8月对4家养殖场患"皮疣病"的大菱鲆Scophthalmus maximus病鱼进行了病理学研究.结果表明:病鱼的疣状突起是由皮肤表皮层细胞发生异常增生所致,增生的表皮细胞较正常表皮层细胞大,细胞形态较为一致,胞浆淡染,呈嗜碱性,核大,核仁明显;增生部位的基底部细胞排列整齐,不呈浸润性生长,内有真皮结缔组织深入其中.电镜观察发现:增生的表皮细胞间松散排列,连接减少,间隙较大,胞质向外形成许多丝足;核质比增大,核型不规则;细胞器数量较少,胞浆内出现大量小泡围绕胞核排列,空泡内有电子密度较低的颗粒状物质;细胞间隙中有淋巴细胞浸润.病理学研究显示:该病明显不同于鱼类的淋巴囊肿病,而应属于一种乳头状瘤;患病机体表现出以淋巴细胞增生为主要的病理变化特点,通过淋巴细胞和单核巨噬细胞来参加对该病的免疫应答反应.病原分析结果排除了霉菌、寄生虫和细菌感染的可能性.在部分病鱼的脾脏中发现了病毒粒子,但该病毒粒子与疣状突起发生的关系尚待进一步研究.     

用两种ELISA方法快速检测大菱鲆细菌性出血性败血症的病原菌

以大菱鲆Scophthalmus maxinzoa出血性败血症病原菌迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda为抗原,从免疫家兔体内获得高免疫血清,建立快速检测大菱鲆出血性败血症病原迟钝爱德华氏菌的间接ELISA技术。采用棋盘滴定法确定间接ELISA抗原和抗血清的最适工作浓度分别为10^7个／mL和1：20000;最低检测菌浓度为10^4个／mL;抗血清与其他细菌标准菌株的交叉反应结果均为阴性,表明该方法具有较高的特异性。将该方法优化后检测了19尾人工感染出血性败血症并发病的大菱鲆和19尾健康的大菱鲆,阳性检测率分别为89．5％和的10．5％。同时在间接ELISA方法的基础上建立竞争ELISA检测技术,结果表明：理想的包被抗原浓度为10^7个／mL,兔抗血清的工作浓度为1：20000,酶标抗体工作浓度为1：1000,可测最适范围为2×10^5～2×10^8个／mL,最低检测菌浓度为2×10^5个／mL,得到回归方程y=-0．3811x＋2．2335,R^2=0．992。     

哈维氏弧菌硫氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中的表达及对大菱鲆的免疫保护作用

从致病性哈维氏弧菌Vibrio harveyi SF1基因组中扩增获得含硫氧还蛋白还原酶(trxR)基因的1 133bp目的片段,连接至载体pMD19-T Simple。测序结果表明,目的片段含有960 bp trxR基因阅读框,编码为319个氨基酸残基的蛋白质。Blast分析结果显示,硫氧还蛋白还原酶蛋白氨基酸序列与哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、弗氏弧菌的硫氧还蛋白还原酶蛋白序列的相似性分别为99%、98%、96%、94%、92%。构建表达质粒pET-28a(+)/TrxR后转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析显示,重组蛋白的相对分子质量为34 000。用Ni琼脂糖亲和层析柱分离得到纯化的重组蛋白,将该蛋白以50μg/尾的剂量肌肉注射免疫大菱鲆Scophthalmus maximus,用ELISA法检测免疫1～4周内鱼血清中特异性抗体的效价。结果表明,特异性抗体效价持续升高,第2周则达到1∶128。免疫4周后用哈维氏弧菌SF1对大菱鲆进行人工感染,对照组鱼的死亡率为100%,免疫组鱼的死亡率为25%,相对免疫保护力为75%。试验表明,哈维氏弧菌TrxR蛋白具有较好的免疫原性,可作为潜在的亚单位疫苗用于哈维氏弧菌病的免疫预防。     

哈维氏弧菌硫氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中的表达及对大菱鲆的免疫保护作用

从致病性哈维氏弧菌Vibrio harveyi SF1基因组中扩增获得含硫氧还蛋白还原酶（trxR）基因的1 133bp目的片段,连接至载体pMD19-T Simple。测序结果表明,目的片段含有960 bp trxR基因阅读框,编码为319个氨基酸残基的蛋白质。Blast分析结果显示,硫氧还蛋白还原酶蛋白氨基酸序列与哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、弗氏弧菌的硫氧还蛋白还原酶蛋白序列的相似性分别为99%、98%、96%、94%、92%。构建表达质粒pET-28a（＋）/TrxR后转化至大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析显示,重组蛋白的相对分子质量为34 000。用Ni琼脂糖亲和层析柱分离得到纯化的重组蛋白,将该蛋白以50μg/尾的剂量肌肉注射免疫大菱鲆Scophthalmus maximus,用ELISA法检测免疫1～4周内鱼血清中特异性抗体的效价。结果表明,特异性抗体效价持续升高,第2周则达到1∶128。免疫4周后用哈维氏弧菌SF1对大菱鲆进行人工感染,对照组鱼的死亡率为100%,免疫组鱼的死亡率为25%,相对免疫保护力为75%。试验表明,哈维氏弧菌TrxR蛋白具有较好的免疫原性,可作为潜在的亚单位疫苗用于哈维氏弧菌病的免疫预防。     

大菱鲆出血性败血症病原茵的分离与鉴定

从全身呈弥漫性出血的养殖大菱鲆.Scophthalmus maximus肝脏、腹水和肾脏中分离到3株菌落形态相同的优势菌,取菌株L-59231通过注射(菌液浓度分别为4×lO.、5×107 cfu/mL,剂量0.1 mL/尾)、灌喂(4×106 cfu/mL,0.5 mL/尾)和创伤浸泡(4.7×105 cfu/mL)三种途径对大菱鲆进行人工感染试验.结果表明:以上三种途径均可造成大菱鲆的发病,灌喂感染和创伤浸泡对试验鱼的感染率为100%和57.1%,未发现死亡;注射感染的死亡率分别为100%和71.4%.药敏试验表明,庆大霉素、四环素、氯霉素、红霉素、链霉素等对L-59231菌株有较强的抑制作用.该菌呈短杆状,革兰氏染色阴性,氧化酶阳性,接触酶阴性,V-P试验阴性,硝酸盐还原反应阳性.根据<常见细菌系统鉴定手册>所描述的弧菌属的生理生化特性,综合形态观察、生理生化特征、16S rRNA基因序列等试验结果,可将L-5923l菌株鉴定为创伤弧菌.     

复方中草药对大菱鲆非特异性免疫力的影响

将牛膝、板蓝根、甘草、陈皮、肉桂、麦芽、神曲7味中草药,粉碎后经80目筛网过滤,按一定比例混匀,以2%、4%和6%的质量分数添加于基础饲料中连续投喂体质量为(29.00±1.82)g的大菱鲆Scophthalmus maximus,对照组投喂不添加中草药的基础饲料,试验共进行28 d,试验结束后测定大菱鲆的非特异性免疫指标及抗病力。结果表明:在整个试验周期内,4%浓度组大菱鲆血清溶菌酶活力和抗菌活力均比对照组有显著升高(P<0.05);试验前2周4%和6%浓度组鱼血清抗蛋白酶活力较高,后2周2%浓度组鱼血清抗蛋白酶活力逐渐升高,并显著高于其他组(P<0.05);试验前3周4%浓度组鱼血清补体C3含量与对照组相比显著升高(P<0.05);在整个试验周期内,2%、4%、6%浓度组鱼血清NBT阳性细胞数与对照组相比均显著升高(P<0.05),且4%和6%浓度组升高更为明显;在整个试验周期内,4%和6%浓度组头肾白细胞吞噬活性均呈现先降低后升高的趋势,均在第4周达到峰值,且显著高于对照组和2%浓度组(P<0.05);攻毒试验表明,各组的存活率从大到小依次为4%浓度组>2%浓度组>6%浓度组>对照组。本研究表明,该复方中草药可以显著提高大菱鲆的非特异性免疫力和抗病力,2%浓度组在一定水平上有促进作用,4%浓度组效果更为显著。