禽流感病毒A/PFV/Restock/34(H7N1)HA基因在昆虫/杆状病毒系统中的表达

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/PFV／Restock／1／34（H7N1）1．7kbHA基因的cDNA，将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后，亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis，筛选到重组质粒命名为pBlueBacHisH7HA，测序正确后与线性化的杆状病毒DNA（Bac-N-Blue^TMDNA）共转染sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经三轮蚀斑纯化，获得数株重组杆状病毒rpBlueHisH7HA。提取重组病毒DNA，经PCR证明目的基因片段已插入到杆状病毒基因组中，血凝实验、SDS-PAGE和Western blot实验结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的HFive细胞中获得了表达。     

H7亚型禽流感病毒HA1基因在重组杆状病毒中的表达及其表达产物的抗原性

从pMD18-T—HA阳性质粒中扩增出H7亚型禽流感病毒（AIV）HA1基因，并亚克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A，将筛选的重组质粒命名为pBlueBacHisH7-HA1，与线性化杆状病毒DNA（Bac—N—BlueDNA）共转染sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经3次蚀斑纯化，得到重组杆状病毒rpBlue-HisH7HA1。Western-blotting和间接免疫荧光试验结果显示，HA1在昆虫细胞中得到表达，且表达产物具有抗原性。抗原特异性试验证明，重组HA1蛋白与鸡H5、H9亚型AIV抗血清不发生交叉反应。血凝试验证明，重组HA1蛋白具有良好的血凝性。     

H5亚型禽流感病毒HA基因杆状病毒载体的构建

经过PCR反应,以特异性引物扩增了禽流感病毒DK/Zhejiang/11/00(H5N1)去除信号肽的HA基因,克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-HTA中,阳性重组质粒转座DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选、PCR鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染sf 9昆虫细胞,获得含H5亚型禽流感病毒HA基因的重组杆状病毒H5HA-Bac HTA。利用SDS-蛋白酶K方法提取重组病毒DNA,PCR反应证实HA基因片段已重组到杆状病毒基因组中。以适宜剂量的重组杆状病毒接种sf 9昆虫细胞,待绝大部分细胞产生细胞病变后收获细胞。细胞裂解产物经间接免疫荧光、SDS-PAGE及Western-Blot试验检测,结果表明:H5亚型禽流感病毒HA基因在重组杆状病毒H5HA-Bac-HTA感染sf 9细胞后获得高效表达,且具有良好的蛋白活性及特异免疫反应原性。     

A群猪轮状病毒G5型OSU株VP7基因的克隆及其重组杆状病毒的鉴定

利用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增出A群猪轮状病毒（PRV）G5型OSU株长度约为1．0kb的基因片段，将其克隆到pMD18-T载体上进行测序鉴定，证明为该PRV的VP7蛋白基因，与已发表的该PRV，VP7基因序列的同源性为99．8％，将该基因黏端克隆至表达载体PblusBAChis C质粒中，酶切及PCR鉴定表明获得了PRV－VP7蛋白基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子，纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA分子Bac-N-Blue共转染昆虫细胞sf9,5d后收获重组病毒，通过对重组杆状病毒DNA分子的酶切及PCR鉴定，确定PRV－VP7基因已正确投入，将经3次蚀斑筛选纯化后的该重组杆状病毒接种于sf9细胞大量增殖后，获得了重组杆状病毒PRV－VP7蛋白的真核表达。     

传染性喉气管炎病毒王岗株糖蛋白gB基因在重组杆状病毒中的表达

将克隆到pUC119中的传染性喉气管炎病毒（ILTV）糖蛋白gB基因，通过EcoRI位点克隆至杆状态病毒转移载体pVL1393中，构建成重组杆状病毒转移载体rpVLgB，将rpVLgB转移载体质粒与杆状态病毒DNA（Bac-N-Blue DNA)共转染Sf9昆虫细胞，经3轮蚀斑纯化，获得重组病毒并命名为rpVL－ILTVgB。PCR方法鉴定证明gB基因正确插入到杆状病毒基因组中，直接免疫荧光试验和Dot－ELISA结果均表明gB基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞保获得表达，表达的gB蛋白将作为鸡传染性喉气管炎的亚单位疫苗和诊断抗原。     

表达H5N1亚型禽流感HA-NA基因重组火鸡疱疹病毒的构建

将禽流感病毒H5N1亚型具有免疫原性的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因,克隆于表达质粒Tmd-CMV-IRES-EGFP中,使其位于含细胞巨化病毒(CMV)早期启动子的调控下,并与增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)串联,将上述串联基因插入到火鸡疱疹病毒(HVT)基因的非必需区(US10)中,从而构建了带标记的重组转移质粒。将该转移载体质粒感染HVT的鸡胚成纤维细胞(CEF),利用脂质体共同转染CEF,待病毒蚀斑出现后,利用蚀斑筛选带有绿色荧光的重组病毒蚀斑,数轮蚀斑纯化,经荧光和PCR初步鉴定获得了重组火鸡疱疹病毒。     

赤羽病毒G1基因的真核表达及抗原性检测

通过RT-PCR获得赤羽病毒（AKAV）OBE-1株的Gl基因,克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的pFastBacHTA转移载体质粒中,利用Tn7转座子与穿梭我体Bacmid DNA同源重组,获得了重组杆状病毒DNA,用CELLFECTIN介导其转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BAC-G1P1。SDS-PAGE结果表明,感染BAC-GIP1后的Sf9昆虫细胞表达可溶形式的120ku目的蛋白,其大小与预期相符。Western blot和间接免疫荧光试验显示表达产物具有良好的免疫学活性。     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表达

猪圆环病毒2型(PCV2)基因组包含2个开放阅读框架(ORFs),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap).为了在昆虫细胞表达Cap蛋白,本研究采用PCR扩增PCV2-ORF2编码基因,将PCR产物插入到昆虫杆状病毒转移载体上,经酶切反应及DNA序列分析得到验证.重组质粒与昆虫杆状病毒线性基因组混合,转染到昆虫细胞(Sf-21)进行基因重组,经3次病毒蚀斑克隆,获得高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,毒价可达1.28×108pfu/mL.采用SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,重组Cap融合蛋白分子量为32.8 ku,占总蛋白含量的17.2%.免疫印迹试验分析表明,重组Cap蛋白与PCV2阳性血清产生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应.本研究为进一步进行该病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定了基础.     

H7亚型禽流感病毒HA基因在杆状病毒系统中的表达

利用PCR反应，以特异性引物扩增禽流感病毒去除信号肽的H7亚型HA密码子优化基因，克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-HTB中，转座DH10感受态细胞，通过蓝白斑筛选、PCR鉴定获得阳性克隆，然后提取基因组Bacmid，转染Sf9昆虫细胞，得到含H7亚型流感病毒HA基因的重组杆状病毒opti-H7HA-Bac。重组杆状病毒接种Sf9昆虫细胞，待绝大部分细胞产生细胞病变后收获细胞，细胞裂解产物经血凝试验、SDS-PAGE及Western blot分析证实，密码子优化的H7HA基因在重组杆状病毒opti-H7HA-Bac感染Sf9细胞后获得高效表达，且具有良好的蛋白活性及特异免疫反应原性。     

应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH_la株囊膜糖蛋白 (GP5 )基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB中 ,与杆状病毒线性DNA(Bac_N_BlueTMDNA)共转染昆虫细胞sf9,经过三轮蚀斑纯化后 ,获得重组杆状病毒rBac_GP5。用该重组病毒感染sf9细胞后 ,应用间接免疫荧光试验、SDS_PAGE和Westernblot检测表明 ,GP5基因在杆状病毒系统中获得了高效表达 ,表达产物因糖基化程度差异 ,表观分子量有 2 2、2 5和 30kDa三种总计约占细胞蛋白总量的 2 6 .4%。     

H7亚型禽流感病毒血凝素基因的真核表达载体的构建及鉴定

参考已发表的H7亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因序列设计引物,以pUCH7为模板,经PCR扩增出一条1.7kb的HA全基因片段,将该片段定向克隆到真核表达质粒载体pcDNA3.1(一)中,转化大肠埃希氏菌DH5α,小量制备重组质粒pcDNA-HA,酶切鉴定正确后,转染COS-1细胞,经免疫荧光鉴定其体外表达情况。结果表明H7亚型AIV HA在COS-1细胞中获得了成功表达。用该重组质粒pcDNA-HA免疫BALB／C小鼠,制备免疫血清,经免疫印迹实验证实该H7亚型AIV HA在小鼠体内也得到了良好的表达。     

流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增了禽流感病毒Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６（Ｈ５Ｎ１）１．７ｋｂ的ＨＡ基因,将其克隆到ｐＵＣ１９的ＢａｍＨＩ位点,筛选到阳性重组子 ｐＵＣＨ５。然后将 ＨＡ基因亚克隆到杆状病毒转移载体 ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＢ,筛选到重组转移载体ｐＢａｃＨ５。经过序列分析证明阅读框架正确后,在脂质体转染试剂介导下,ｐＢａｃＨ５与线性化的杆状病毒 ＤＮＡ（Ｂａｃ－Ｎ－Ｂｌｕｅ ＤＮＡ）共转染Ｓｆ９昆虫细胞。重组杆状病毒经三轮蚀斑纯化,获得纯化的重组杆状病毒ｒＢａｃＨ５。提取重组杆状病毒ＤＮＡ经ＰＣＲ扩增证明目的基因片段插入到杆状病毒基因组中。间接免疫荧光染色试验、血凝试验和 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ试验结果表明 ＨＡ基因在重组杆状病毒感染的Ｓｆ９细胞表面获得表达。重组杆状病毒表达的ＨＡ蛋白能够凝集公鸡红细胞,血凝价１２８０－２５６０ＨＡＵ／ｍｌ。ＨＡ蛋白在杆状病毒表达系统的成功表达,为禽流感亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

非洲马瘟病毒VP7基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

为了获得具有天然活性的非洲马瘟病毒重组VP7蛋白,制备针对非洲马瘟VP7蛋白的单克隆抗体及建立快速抗体检测方法,本试验通过PCR扩增、胶回收纯化后经Xba Ⅰ和Hind Ⅲ特异性酶切,将VP7基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、酶切、测序鉴定后,成功构建了携带VP7基因的重组质粒pFastBacHTB-AHSV-VP7。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bacmid-AHSV-VP7,并在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染Sf9昆虫细胞,收获表达产物。表达产物经Western blotting分析表明,VP7重组蛋白得到表达,其分子质量大小约为45 ku,且具有良好的生物活性。     

禽流感病毒核蛋白基因在重组杆状病毒中的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法成功地扩增了我国禽流感病毒分离株Ａ／Ｘｉｎｇｊｉａｎｇ／１／９６（Ｈ１４Ｎ５）的核蛋白（ＮＰ）基因,其限制性内切酶图谱和核苷酸序列与鸭源的标准Ｈ１４Ｎ５毒株几乎完全一致,与其它毒株则有较大差异,说明该鸡源分离株与鸭源毒株有非常近的亲缘关系。将ＮＰ基因定向克隆到杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３中,再与杆状病毒线性ＤＮＡ（ＢＡＣ－Ｎ－ＢｌｕｅＤＮＡ）共转染于Ｓｆ９昆虫细胞中,经过三次蚀斑筛选,获得重组病毒ｒＢ２。用其细胞表达产物裂解后作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ,结果表明ＮＰ基因在杆状病毒系统中获得了表达。同时用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与现行标准禽流感琼扩抗原具有相同的生物学活性。     

鸡传染性支气管炎病毒DB株核蛋白基因的克隆及在杆状病毒系统中的表达

利用PT－PCR方法扩增鸡传染性支气管炎病毒（IBV）DB株的核蛋白基因，并对其序列进行了测定，DB株IBV的核蛋白基因长度为1230bp，编码蛋白由409个氨基酸残基组成。与已发表的参考毒株进行核苷酸同源性比较，发现DB株与澳大利亚群毒株的亲缘关系最为密切。同时构建了杆状病毒重组转移载体pBlue-DB-N，将其与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9昆虫细胞，经过3轮蚀斑纯化和聚合酶链式反应（PCR）鉴定，获得重组杆状病毒rBac-DB－N。SDS－PAGE分析和Western blot检测的结果表明DB株IBV核蛋白基因基因在重组杆状病毒感染原Sf9昆虫细胞内获得表达，融合蛋白最大表达量占细胞蛋白总量的19．4％左右。     

PRRSV核衣壳蛋白基因在杆状病毒中的表达

根据已发表的猪生殖 -呼吸道综合征病毒 ( PRRSV) CH-1 a分离株核衣壳 ( N)蛋白基因核苷酸序列和杆状病毒转移载体 p Blue-Bac-His B多角体蛋白阅读框架 ,设计合成了 1对特异性引物 P7S1 /P7R1。应用PCR对重组质粒 p UC1 8-ORF7扩增 ,获得了 CH-1 a株 N基因的片段。经 Hind 和 Bgl 双酶切 ,将其定向克隆到同样双酶切的 p Blue-Bac-His B的 PH启动子下游 ,获得转移载体 p Blue-Bac-His B-ORF7。将转移载体p Blue-Bac His B-ORF7与苜蓿银蚊夜蛾多核型多角体病毒 ( Ac MNPV,简称杆状病毒 )线性化 DNA ( Bac-N-Blue TMDNA)共转染 Sf9细胞 ,经过蓝斑筛选和蚀斑纯化 ,获得重组病毒 r Bac7。经用引物 P7S1 /P7R1和杆状病毒多角体蛋白基因通用引物 PCR鉴定 ,证明目的基因已插入到杆状病毒中。将重组病毒接种于对数生长期的 Sf9细胞 ,分别于感染后 2 4、4 8、72、96、1 2 0 h收集感染细胞 ,经 SDS-PAGE和 Western blot分析 ,结果表明 ,细胞接种重组病毒 2 4 h即开始表达重组蛋白 ,至 96h达到峰值 ,占整个细胞蛋白的 8.4 % ,此后开始下降。表达产物为融合蛋白 ,大小约 2 0 0 0 0。将重组病毒感染的 Sf9细胞用抗 PRRSV N蛋白的单克隆抗体SDOW-1 7进行间接免疫荧光试验 ,结果在细胞浆和细胞核中观察到了特异性的亮绿     

表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定

本研究根据GenBank数据库中的猪圆环病毒2型全基因组序列设计并合成了1对能扩增完整Cap序列的引物,采用PCR扩增猪圆环病毒2型YZ株的Cap基因,并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,获得阳性质粒pFastBacHTA-Cap;测序后将该质粒转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,获得含有Cap基因的重组杆状病毒质粒Bacmid-Cap;最后将获得的重组杆状病毒质粒Bacmid-Cap转染sf9昆虫细胞并成功拯救了能稳定表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组杆状病毒rBacmid-Cap,该重组病毒的成功拯救为研制猪圆环病毒2型的基因工程亚单位疫苗奠定了基础.     

O型口蹄疫病毒P1-2A基因重组杆状病毒的构建及其表达

设计合成特异引物,扩增O型口蹄疫病毒(O/FMDV)P1-2A基因,将其克隆至T载体上,通过Hind Ⅲ和Not Ⅰ双酶切P1-2A基因和真核转座载体pFastBac^TM Dual,构建重组转座质粒pFastBac-P12A,再将pFastBac-P12A转化入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac,经重组筛选获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P12A。将Bacmid-P12A质粒转染Sf9昆虫细胞,出现典型CPE。病变细胞经Dot blotting和SDS-PAGE检测和分析,结果表明,O/FMDV P1-2A蛋白在Sf9细胞中获得表达,为O型FMDV特异性蛋白。