FMDV非结构蛋白3A和3B的表达与反应活性分析

根据已测得的O/China/99口蹄疫病毒(FMDV)基因组序列,设计两对特异性表达引物,以带有O/Chi-na/99 3ABC基因片段的重组质粒pGEM-3ABC为模板,扩增得到了3A、3B基因,通过两端的BamHI和SalI酶切位点插入原核表达载体pET28a,将重组表达质粒转化宿主菌BL21,用IPTG诱导表达目的蛋白.表达产物经SDS-PAGE检测表明,3A和3B基因成功的在大肠埃希氏菌中得到了表达;通过Western blotting分析和斑点ELISA分析表明,纯化后的蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应.     

猪O型FMDV主要抗原表位多肽的合成与鉴定

为筛选口蹄疫病毒表位抗原,使用Symphony 12通道多肽合成仪,采用Fmoc固相合成原理,合成5条O型FMDV抗原表位肽。Quattro Micro液-质联用仪分析多肽分子的结构特性,分析结果表明,在误差允许的范围内所检测的结果与理论值相符,5条多肽均通过质谱检测。通过SMCC双功能偶联剂将多肽偶联于BSA载体蛋白,以Dot-blot和间接ELISA法检测这5条与BSA偶联得多肽与O型FMDV阳性血清的结合能力,结果显示,中和表位Pep1、Pep2、Pep3能特异性结合O型FMDV感染血清和免疫血清,为抗FMDV中和表位单克隆抗体的制备和FMDV抗体检测试纸条方法的建立奠定基础。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的表达及反应原性鉴定

[目的] 研究口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的表达及反应原性鉴定。[方法] 以含有FMDV 3ABC基因的质粒为模板,应用RT-PCR技术扩增口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因并进行序列测定,将3AB基因克隆至表达载体pET-28a（＋）,选取阳性克隆转化BL21感受态用IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE鉴定与Western-bolt检测分析。[结果] 经SDS-PAGE和Western-bolt分析表明,在大肠杆菌中成功表达了3AB蛋白,表达的目的蛋白能与FMDV阳性血清发生特异性反应。[结论] 该项研究为应用以重组FMDV非结构蛋白为抗原建立感染和免疫动物的鉴别诊断方法提供了依据。     

猪O型FMDV抗体检测试纸条与ELISA对比试验

为初步评价研制的猪O型FMDV抗体检测试纸条的性能,检测了免疫FMDV多肽疫苗20 d后制备的猪血清(143份),并对比FMDV VP1抗体检测ELISA试剂盒的检测结果。结果显示,二者的符合率为100%。猪O型FMDV抗体检测试纸条特异、敏感、快速、简便,具有广阔的推广应用前景。     

携带FMDV…DNA疫苗重组减毒沙门氏菌的构建及其安全性和稳定性研究

为探讨携带FMDV DNA疫苗重组沙门氏菌口服免疫可行性,PCR扩增O型FMDV主要抗原基因VP1,并连接到真核表达载体pIRES,将构建的质粒pIRES-VP1体外转染BHK-21细胞,间接免疫荧光检测VP1基因的表达.通过氯化钙转化法将重组质粒pIRES-VP1转入减毒鼠伤寒沙门氏菌2266,构建2266 (pIRES-VP1)重组菌,并以108、109、1010CFU的剂量口服免疫小鼠,2周后以相同剂量加强免疫,以研究重组菌在小鼠体内的稳定性及安全性,并通过将重组菌进行体外传代,研究重组质粒在体外的稳定性.研究结果表明:108、109CFU剂量免疫小鼠成活率为100％,1010CFU剂量口服小鼠出现扎堆现象,且行动迟缓.重组菌体外连传8代以及免疫小鼠后从脾脏和肝脏分离鉴定表明,重组菌2266 (pIRES-VP1)在体内和体外均具有较好的安全性和稳定性.     

氯氰菊酯农药降解菌株的稳定性研究

通过氯氰菊酯农药生产车间下水道中的农药的混合微生物富集驯化培养获得降解氯氰菊酯降解菌.在富集培养基中分别传代5、10、15代,传代温度是30 ℃,pH值7.0,该混合微生物呈现不同的生长曲线.继代5代的氯氰菊酯农药降解能力为55%,继代10代的氯氰菊酯农药降解能力为52%,继代15代的氯氰菊酯农药降解能力为50%,表明该菌具有较好的降解能力稳定性.     

果蔬型果肉饮料的生产及稳定性试验

 介绍了复合果蔬果肉饮料的生产工艺,比较了果胶酶处理对液化率的影响,并对几种稳定剂单独或混合使用的效果进行了试验.结果显示,果胶酶处理山楂、胡萝卜其液化率分别比对照提高32.50%和14.52%.各种稳定剂中,单独使用以0.05%～0.10%黄原胶效果最好;混合使用以0.05%～0.10%CMC+0.05%琼脂和0.05%CMC+0.05%～0.10%黄原胶效果最好.     

多等温加速试验预测重组鸡α干扰素的稳定性

在3种温度下对大肠杆菌表达重组鸡α干扰素进行了多等温加速稳定性试验和2℃保存的稳定性考察,预测重组鸡α干扰素的稳定性,为制品有效期的确定提供依据。采用多等温加速试验,将制品放在3种不同温度下孵放,定期取出样品,测定效价,根据制品的效价下降情况推算其在有效期内的稳定性。结果显示:用加速降解有关公式可以求出在2℃存放1年后的残余效价为226 492 682单位,下降率为9.9%,与实测值228 000 957单位基本吻合;2年后的残余效价为203 868 551单位,下降率为18.9%。即2℃保存2年后效价保持在80%以上,推算的结果与试验值较吻合,产品稳定性良好。     

3个地点白桦种源试验生长稳定性分析

开展多点造林试验是对参试种源进行稳定性分析及生长特性评价的重要步骤。本文以18个白桦种源为材料,分别在帽儿山、草河口、金河3个试验点营建种源试验林,对17年生白桦树高、胸径及材积等性状进行多地点联合分析,结果表明:树高、胸径及材积性状在各地点间和各种源间以及种源与地点的交互作用上差异均达到极显著水平(P<0.01)。对各试验点参试种源保存率分析发现,18个白桦种源在各试验点平均保存率在4.76%~76.55%之间,其中东方红、凉水、长白和乌伊岭等种源平均保存率较好,西北地区种源如六盘山、西宁和天水等保存率较低。采用AMMI模型对参试种源的树高性状进行稳定性评价,结果显示:凉水、小北湖、辉南、东方红、露水河、桓仁、天水属于高产稳产型的种源,乌伊岭、帽儿山、汪清、草河口、清源、莫尔道嘎属于高产非稳产型的种源,昭苏、长白、西宁等属于低产稳产型种源,绰尔、六盘山属于低产非稳产型种源。研究结果不仅为白桦优良种源选择提供理论依据,而且也为白桦良种的应用与推广提供参考。      

紫外线对重组杆状病毒(AcMNPV-BmKIT-Chi)稳定性的影响

通过研究重组杆状病毒(AcMNPV-BmKIT-Chi)经紫外线照射后对棉铃虫幼虫的感染,来确定病毒对紫外线的稳定性。结果表明,不同浓度的病毒(2×106,2×107和2×108 PIBs/ml)经紫外线照射后,在感染前期受到一定的影响;同一浓度的病毒经紫外线照射不同时间(10,30,60,90,120 min)对病毒的毒力影响结果无明显趋势,但照射对其感染初期有一定的影响。从整个感染过程来看,紫外线对病毒的毒力效果无明显影响。     

口蹄疫病毒多抗原基因VP1-VP3-3C在大肠杆菌中的融合表达

应用PCR扩增技术获得1564bp的片段,包含口蹄疫病毒VP1全长基因、VP3部分基因和编码3C裂解酶全长基因,连接到pMD-18T载体上,在获得重组质粒pMD-18T-P13C后,进行序列分析;并成功地构建了重组表达质粒PGEX-KG-P13C,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,收集菌体进行SDS-PAGE电泳。结果表明,P13C基因在大肠杆菌中获得成功表达,其表达产物为分子量83kDa的融合蛋白;能与猪抗FMDV血清发生反应,并为口蹄疫病的诊断及其基因工程疫苗的研究提供了依据。     

检测猪血清口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体ELISA方法的建立

用大肠杆菌表达的FMDV NSP 3AB经纯化后作为抗原,建立了3AB间接ELISA方法,该方法可用于判定被检动物是否感染了口蹄疫病毒.重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB作为检测抗原包被酶标板反应孔,以兔抗猪IgG/HRP酶结合物作为第2抗体,建立了抗非结构蛋白抗体检测的方法.用该方法检测了大量不同背景的猪血清,并与3ABC-I-ELISA检测结果进行比较.结果表明:3AB-I-ELISA和3ABC-I-ELISA的总符合率为98.9%,而且3AB-I-ELISA的特异性高于3ABC-I-ELISA.     

牦牛FMDV持续感染分离株非结构蛋白P2的克隆及基因特征分析

以FMDV持续感染模型动物牦牛的食道/咽部分离物(O/P液)为反转录模板,用1对特异性引物扩增目的cDNA,然后与pMD18-T载体连接并转化JM109菌株,再经重组质粒电泳、PCR和EcoRⅠ酶切鉴定.序列测定和分析结果表明,分离株与China/99的同源性最高达93.4%,而与Akesu/58序列的同源性为90.3%;推导的氨基酸序列同源性分别为97.8%、96.7%.     

以偶联多肽为抗原建立检测O型猪口蹄疫 病毒抗体的ELISA方法

以偶联多肽为抗原建立检测O型猪口蹄疫病毒抗体的ELISA 方法。通过FMDV 多肽序列的筛选、化学 合成及反应原性鉴定,将多肽与非蛋白结构多聚体载体进行偶联。利用偶联多肽作为抗原,通过方阵滴定确定偶联 多肽、血清及HRP 的最佳工作浓度,确定方法的阴阳性临界值,然后进行特异性试验、敏感度测定及临床猪血清样 本的免疫效果评估等。结果表明,偶联多肽具有良好的反应原性,最佳包被浓度为1.0 滋g/mL,血清最佳稀释度为1: 32,HRP 最佳稀释度为1:8 000,方法特异性好,敏感度高,操作方便省时,能够对FMDV 的自然感染进行检测,也可 对FMDV 免疫后的猪血清抗体水平进行评估。     

含O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的羊痘病毒弱毒株转移载体的构建

利用已构建的口蹄疫病毒O/China99毒株的pMD18-T-P1-2A-3C载体和p-EGFP-N1-P7.5载体,分别通过HindⅢ、NheⅠ酶切,将基因P1-2A-3C连接到线性载体p-EGFP-N1-P7.5,构建了载体p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C。将EGFP-P7.5-P1-2A-3C基因整体通过平末端连接到KpnⅠ酶切后的载体pUC119-TK中,得到重组载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C。通过PCR扩增、酶切鉴定及序列测定。结果表明,成功构建了一侧启动表达P1-2A-3C基因,一侧启动表达标记基因EGFP的pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C转移载体。     

口蹄疫病毒O型Cathay毒株的分离鉴定

[目的]研究FMD疑似组织病料,为口蹄疫相关研究工作提供试验参考。[方法]应用细胞培养、电镜观察、反向间接血凝试验、RT-PCR及测序技术对FMD疑似组织病料进行分离鉴定,确定其血清型及基因型。[结果]结果显示,分离鉴定的FMD疑似组织病料为O型Cathay口蹄疫病毒株。[结论]为口蹄疫的诊断、防治、流行病学调查及疫苗的研究使用奠定了基础。     

FMDV P1基因DNA疫苗构建及免疫实验

[目的]构建口蹄疫DNA疫苗[方法]构建以PRV为载体的表达FMDV P1基因的质粒pIESZP1和pUTK3CP1,免疫小鼠并检测了免疫后小鼠的抗体水平.将构建的2个真核表达质粒分别转染Vero细胞,通过PCR、IFA、Western-blot等方法检测目的基因的转录和表达.将正确表达目的基因的DNA质粒肌肉接种3周龄的Balb/C小鼠,采用ELISA和SN方法检测了免疫小鼠体内的抗体水平.[结果]携带有FMDV衣壳蛋白P1基因的DNA质粒能引起小鼠产生特异性的体液免疫反应,两重组质粒诱导小鼠产生抗FMDV的抗体水平无差异.[结论]该研究为含有FMDV P1基因重组PRV以及重组病毒的动物免疫试验以评价基因工程疫苗的免疫效果奠定了基础.     

口蹄疫病毒部分免疫功能肽段的合成、鉴定及免疫功能评价

利用微波多肽合成仪Liberty,合成O型口蹄疫病毒VP1 140~160和200~213氨基酸序列的两条肽段,并用高压液相色谱仪及质谱分析仪就合成的多肽片段进行分析纯化和鉴定;将合成的多肽片段作为半抗原与载体蛋白BSA偶联,免疫小鼠,进行血清制备和抗体效价测定.结果表明:成功合成了口蹄疫2条免疫功能短肽,其纯度均达到80%以上.半抗原成功与载体蛋白偶联;小鼠抗血清经过抗体效价检测证明半抗原与载体蛋白偶联组的抗体水平高于其余2个对照组,但是达不到免疫保护的水平.同时说明Liberty是一种操作简单、方便,合成效率高的多肽合成仪,可高效合成研究用多肽.