利用正交设计优化向日葵ISSR-PCR反应体系

向日葵产业的发展对调整黑龙江省种植业结构、利用中低产田、增加农民收入具有十分重要的作用,为了推广ISSR分子标记技术在向日葵分子育种上的应用,利用正交设计对向日葵ISSR-PCR反应体系中的5个因素(模板DNA、dNTP浓度、Mg2+浓度、引物浓度、Taq酶用量)在4个水平上进行优化,确立了适合向日葵ISSR-PCR反应的20μL体系:50ng模板DNA、2.0μmol·L-1dNTP、37.5μmol·L-1 Mg2+、8μmol·L-1引物、8UDNA Taq酶。     

用正交设计法优化辣椒ISSR-PCR反应体系

采用正交设计L16(45)对辣椒ISSR-PCR反应体系的5个因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物浓度)在4水平上进行优化试验。结果表明,最佳反应体系为:在25μl总反应体系中,含1×PCR缓冲液、2.0 mmol Mg2+、1.5 unitTaqDNA聚合酶、0.25 mmoldNTP、0.48μmol引物、120 ng模扳DNA。扩增程序为:95℃预变性5 min;94℃变性45 s,51℃退火1 min,72℃延伸2min,进行38个循环;最后72℃延伸10 min。新优化的辣椒ISSR-PCR反应体系和程序有很好的重复性和稳定性。此研究为今后利用ISSR技术对辣椒进行种质资源分类、遗传图谱构建和基因定位提供了一个较理想的应用方案。     

茶树ISSR-PCR反应体系的正交优化

对茶树ISSR-PCR反应体系中的5因素(Taq酶浓度(U/(20μL))、Mg2+浓度(mmol/L)、模板DNA质量浓度(ng/(20μL))、dNTP浓度(mmol/L)、引物浓度(μmol/L))在4水平上进行正交优化试验,筛选出各因素的最佳水平,建立茶树最佳ISSR-PCR反应体系,即20μL反应体系中,TaqDNA聚合酶为1.0U/(20μL),Mg2+为2.0mmol/L,模板为40ng/(20μL),dNTP为0.20mmol/L,引物为0.25μmol/L.对茶树ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火试验,确定引物ISSR1、UBC881的最适退火温度分别为52.4、59.0℃.     

正交设计优化大旗瓣凤仙ISSR-PCR反应体系

[目的]优化大旗瓣凤仙ISSR-PCR反应体系,为大旗瓣凤仙遗传多样性分析提供技术参考.[方法]利用正交试验设计对大旗瓣凤仙ISSR-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA)4水平进行优化分析,并在此基础上对PCR反应过程中的退火温度进行筛选.[结果]建立了大旗瓣凤仙ISSR-PCR的优化反应体系,即在25.0 μL反应体系中含1×PCR Buffer、Mg+ 1.5 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、引物0.8 μmol/L、TaqDNA聚合酶0.75~1.00 U、模板DNA 100 ng.通过该体系可以筛选出6条对大旗瓣凤仙种群扩增效果较好的引物.[结论]优化的ISSR-PCR反应体系具有较高的稳定性,可用于大旗瓣凤仙及凤仙属植物种群的ISSR遗传多样性分析.     

正交设计优化杂交油菜ISSR-PCR反应体系研究

采用正交设计法优化适合于杂交油菜的ISSR体系,对影响ISSR-PCR的多个因素,包括Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物用量等进行了比较、优化;对DNA模扳浓度,退火温度进行了筛选。结果确定了杂交油菜ISSR-PCR反应体系的最佳方案为:94℃预变性5分钟,1个循环;每个循环94℃变性20s;56.2℃退火1分钟,72℃延伸80s,38个循环;72℃完全延伸6分钟;4℃保存。20μl PCR反应体系包括10×Buffer 2.5μL、模板20ng 1μl、2.5mmol/L dNTP1μl、10μmol/L Primer 1.2μl、5U TaqE0.2μl、25mmol/L Mg2+1.4μl。     

正交优化法建立沙打旺ISSR-PCR最佳反应体系

根据正交试验设计的原理,设计了探索性正交试验和细调性正交试验来确定沙打旺ISSR-PCR体系中各成分的浓度。得到既稳定又能扩出最多条带的适合沙打旺的ISSR-PCR最佳反应体系,即20μl的反应体系中含有1×buffer,dNTP 0.2 mmol/L,Taq酶1.0 U,引物0.3μmol/L,Mg2+2.5 mmol/L,DNA模板2.5 ng/μl。然后对沙打旺ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火试验,得到这条引物的最佳退火温度为54.1℃。这一最佳体系的建立为今后利用ISSR标记技术,研究沙打旺的遗传多样性提供了标准化程序。     

正交设计优化莲雾ISSR-PCR反应体系

以莲雾品种‘农科一号’为试材,采用经改良的CTAB法提取莲雾叶片的DNA,探讨了Mg2+、dNTPs、引物浓度、Taq聚合酶、模板DNA含量对莲雾ISSR-PCR的影响。建立了总体积为25μL的莲雾ISSR-PCR反应体系:Mg2+浓度为3.0mmol.L-1﹑dNTP浓度为0.2mmol.L-1﹑primer浓度为0.4μmol.L-1﹑Taq DNA聚合酶1.5U﹑模板DNA含量为30ng,并含2.0μL 10×PCR Buffer(Mg2+free)。应用该反应体系对‘农科一号’和‘农科二号’进行ISSR-PCR扩增,共筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。     

牡丹ISSR-PCR反应体系正交优化设计

以“凤丹(”Paeonia ostii)基因组DNA为模板,采用正交试验设计方法,研究牡丹ISSR反应体系的影响因素,建立了适合牡丹的ISSR反应体系及程序。10 lμ反应体系为:1×反应缓冲液,2.5 mmo1/LMg2+,0.4 mmo1/LdNTPs,1.0 UTaq聚合酶,0.75μmol/L引物,10～20 ng模板DNA。反应程序为:94℃预变性3 min;94℃变性45 s,45～60(℃不同引物退火温度各异)复性45 s,72℃延伸90 s,35个循环;72℃延伸7 min;4℃保存。通过梯度退火试验,确定不同引物的退火温度。     

黔产苦参ISSR-PCR反应体系正交优化研究

[目的]确定适合苦参稳定的ISSR-PCR反应体系。[方法]采用经典的CTAB法提取苦参新鲜幼嫩叶片DNA;针对Mg2+、d NTPs、引物、模板DNA和Taq DNA聚合酶进行正交设计L_(16)(4~5),优化黔产苦参ISSR-PCR反应体系。[结果]最适ISSR-PCR反应体系为:模板DNA 90 ng、0.4μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg~(2+)、TaqDNA聚合酶0.5 U、0.5 mmol/L d NTPs。[结论]建立的苦参ISSR-PCR反应体系,经过19份苦参样品检验,证明该体系稳定可靠,可用于苦参遗传多样性分析。     

正交设计优化棉花黄萎病菌ISSR-PCR反应体系

采用正交试验设计方法,对ISSR的影响因素进行研究,从Taq酶、Mg2+、dNTP和引物4因素3水平进行优化试验,筛选并建立了适合棉花黄萎病菌的ISSR-PCR最佳反应体系,即25 μL的反应体系中含有1×PCR buff-er,00 μmol/L dNTP,.75 μmol/L引物,50 mmol/L Mg2+,U TaqDNA聚合酶和40 ng模板DNA.     

甜槠ISSR-PCR反应体系的正交优化

对甜槠Castanopsis eyrei进行遗传多样性研究的过程中,为了获得清晰可靠、重复性强的ISSR扩增结果,利用正交设计对Mg2 ,dNTP,引物,Taq酶,牛血清蛋白(BSA)和模板DNA等6种因素5个水平进行筛选和优化。确定甜槠ISSR-PCR最适宜反应体系为:10μL反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris-HCl,pH 9.0,50 mmol.L-1KCl,10 g.L-1TritonX-100),1.7 mmol.L-1Mg2 ,0.25 mmol.L-1dNTP,8.34 nkatTaqDNA聚合酶,1.5 g.L-1牛血清白蛋白,6 pmol引物,12 ng模板DNA。甜槠扩增时引物UBC846的最适退火温度为56.3℃。图2表1参23     

珍稀濒危植物香果树ISSR-PCR反应体系的筛选与优化

以珍稀濒危植物香果树(Emmenopterys henryi)基因组DNA为研究对象,测试了ISSR-PCR反应体系的最适退火温度,并通过对反应体系中的Mg2 、dNTP浓度、模板DNA含量,Taq DNA聚合酶量、BSA浓度、引物浓度的筛选和优化,获得了香果树ISSR分析较适宜的扩增条件是:10 μL PCR反应体积,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol·L-1 Tris·HCl pH9.0,50 mmol·L-1 KCl,0.1%Triton X-100),2.0 mmol·L-1 MgCl2,0.75 U Taq酶,10 ng模板DNA,12 pmol引物;dATP、dCTP 、dGTP 、dTTP 各0.2 mmol·L-1,2 mg·mL-1牛血清白蛋白.香果树的合适退火温度为48.5℃.     

黑龙江林蛙ISSR反应体系的建立与优化

以黑龙江林蛙为材料,使用引物ISSR807,采用正交优化方法对影响PCR反应的Mg2+、dNTPs、引物、DNA聚合酶、模板进行体系优化,对引物的最佳退火温度进行选择,建立适合黑龙江林蛙的ISSR-PCR分析的最佳体系:在25μL总体积中,包含10×PCR Buffer 2.5μL,Mg2+4.0 mmol.L-1,dNTPs 0.15 mmol.L-1,引物0.3μmol.L-1,TaqDNA聚合酶0.5 U,DNA模板2.0 ng.μL-1,最佳退火温度53.8℃。为利用该技术对黑龙江林蛙遗传多样性分析和构建遗传图谱提供一定的依据。     

黄藤ISSR反应体系的条件优化

在利用ISSR技术对黄藤进行分子生物学研究过程中,对影响PCR扩增效果的一些因素,如模板DNA浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度以及退火温度等指标进行筛选和优化,获得用于黄藤ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件:20μLPCR反应体积中含有1×缓冲液,20 ng模板DNA,2 mmol.L-1MgC l2,100μmol.L-1dNTP,1.5 U TaqDNA聚合酶,0.4μmol.L-1引物,2%甲酰胺,0.5 mmol.L-1亚精胺.扩增程序为:94℃预变性5 m in;再35个循环:94℃30 s,52℃45 s和72℃1.5 m in;最后72℃延伸7 m in.     

甜槠ISSR-PCR 反应体系的正交优化

对甜槠Castanopsis eyrei 进行遗传多样性研究的过程中, 为了获得清晰可靠、重复性强的ISSR 扩增结果, 利用正交设计对Mg 2+ , dNTP , 引物, Taq 酶, 牛血清蛋白(BSA )和模板DNA 等6 种因素5 个水平进行筛选和优化。确定甜槠ISSR-PCR 最适宜反应体系为:10 L 反应体中, 1 Taq 酶配套缓冲液(10 mmolL-1 Tris-HCl , pH 9.0 , 50 mmolL-1 KCl , 10 gL-1 TritonX-100), 1.7 mmolL-1 Mg 2+ , 0.25 mmolL-1 dNTP , 8.34 nkat Taq DNA 聚合酶, 1.5 gL-1牛血清白蛋白, 6 pmol 引物, 12 ng 模板DNA 。甜槠扩增时引物UBC846 的最适退火温度为56.3 ℃。图2 表1 参23     

茶树ISSR-PCR反应体系优化研究

通过优化影响茶树ISSR PCR的主要参数,确立适合于茶树的ISSR反应体系和扩增条件。结果表明,在20μl反应体系中模板DNA的用量、T aq酶用量、引物浓度、M g2 浓度、dNT p浓度分别为:模板DNA为40 ng;T aq酶为0.5 U;引物为0.25μm o.lL-1;M gC l2为1.5 mm o.lL-1;dNT p为0.2 mm o.lL-1。适宜退火温度比Tm值高2~3℃。     

葡萄种质资源ISSR-PCR反应体系的建立与优化

【目的】建立并优化葡萄种质资源稳定的ISSR—PCR体系,为葡萄种质资源研究和种质创新奠定基础。【方法】以新疆22个葡萄种质资源叶片为材料,采用改良CTAB法提取葡萄基因组DNA,并利用单因素法对影响ISSR反应体系中的各个影响因子进行优化。【结果】优化的最佳ISSR—PCR反应体系为：模板DNA30ng,dNTPs0．3mmol／L,引物0．5μmol／L,Taq DNA聚合酶1．0U,反应体系为25．0μL。【结论】优化了新疆葡萄种质资源ISSR-PCR反应体系中的各个影响因子,利用该体系能够扩增获得清晰、稳定的条带,可以用于葡萄种质资源遗传多样性分析。     

正交设计优化花菜类SRAP分子标记体系的研究

采用正交设计,从Mg^2＋、dNTPs、引物三种因素3个水平对青花菜SRAP反应体系进行优化,确立适合青花菜的SRAP反应体系,并在6个青花菜和花椰菜品种中进行验证。结果表明：20μ/L反应体系中适宜体系的浓度dNTPs为0．2mmol／L、Mg^2＋为1．25mmol／L、上下引物各0．4μmol／L、DNA为20ng、Taq酶1．2U、退火温度为50℃。     

胡枝子属ISSR-PCR反应体系的建立与优化

在利用ISSR技术对胡枝子属种质资源遗传多样性进行研究的实验过程中,对影响PCR扩增效果的一些因素如DNA的提取、模板DNA质量浓度、Taq酶用量、引物用量、dNTP的用量以及退火温度等指标进行筛选和优化,筛选优化出可用于胡枝子属ISSR-PCR分析较适宜的PCR反应条件:Taq酶1.0 U,2μL的10×Buffer(200 mM Tris-HC l;200 mM KC l;100 mM(NH4)2SO4;15 mM MgC l2),模板DNA 40 ng,dNTP 0.2 m mol/L,引物0.2μmol/L.     

梨品种ISSR-PCR反应体系的优化与应用

以海子梨渊Haizili冤品种的DNA 为材料袁对影响ISSR-PCR 扩增的重要因子进行单因素的优化设计袁建 立了最佳体系: 25 滋L 反应体系中含2.5 滋L 10伊buffer尧0.75 U Taq DNA 聚合酶尧0.2 mmol/L dNTPs尧2.5 mmol/L MgCl2尧0.25 滋mol/L 引物尧10~60 ng 模板DNA遥将最佳体系应用于黔西南的22 个梨品种袁证实了该体系的重复性好袁 很稳定遥