球毛壳菌几丁质酶3基因的序列分析

根据EST分析的结果，从cDNA文库中挑取几丁质酶3基因的克隆进行了测宁并序列分析。结果表明：cDNA文库中几丁质酶3基因的克隆插入片断大小为1268bp；用Phrap软件拼接出来的几丁质酶3的表达序列标签拼接序列与实际平列不完全吻合：因此，在EST分析中不用Phrap软件为好。     

油菜内生球毛壳菌抑菌作用初步测定

平板对峙试验显示,从油菜(Brassicanapus)叶、根和种子上分离到的14株内生球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)对油菜菌核病原菌和立枯丝核菌均有不同程度的抑制作用,其中以种子上分离到的Dyst-1和MYNS-1的抑制作用最好。Dyst-1和MYNS-1的发酵液通过高压湿热灭菌和细菌过滤器过滤灭菌后,分别对所选用的几株植物病原真菌表现出抑制作用,特别是对油菜种传病害菌核病病菌。油菜内生球毛壳菌的详细抑菌机制需进一步研究。     

球毛壳菌pdc基因克隆及生物信息学分析

利用BlastX将球毛壳菌（Chaetomium globosum）ESTs序列与GenBank的Nr数据库进行相似性搜索,获得含有丙酮酸脱羧酶基因（pdc）的2条ESTs（BP099214和BP113195）,以此设计引物,克隆获得球毛壳菌pdc基因的cDNA及DNA序列。cDNA和DNA序列长度分别为1725和1829bp,编码574个氨基酸的多肽,蛋白质分子质量63．38ku。蛋白质家族预测其属于焦磷酸硫胺素TPP家族。BlastP相似性分析表明,PDC氨基酸序列保守性不高,与其相似性最高的是柄孢霉的PDC（Podospora anserina,CAD60727）,相似性为79％。pdc基因的cDNA及DNA序列在GenBank上的登录号分别为EU304327,EU304326。     

毛壳菌产抗真菌活性物质菌株的筛选与鉴定

对实验室分离保存的40株毛壳菌菌株代谢产物进行抗真菌活性筛选,5个菌株代谢产物对植物病原真菌具有选择性抑制效果。其中,菌株CH08、CH23发酵液对芒果炭疽菌、苹果炭疽菌、小麦根腐菌有较强的抑制作用;菌株CH16、CH17发酵液对芒果炭疽菌、苹果炭疽病具有较强的抑制作用;菌株CH21发酵液对西瓜枯萎菌、辣椒炭疽菌有较强的抑制作用。经形态学鉴定,CH08、CH16、CH17、CH23为球毛壳菌,CH21为角毛壳菌。     

球毛壳菌及其产生的鞘氨醇对油菜根肿病的室内生防作用

采用灌根接种法研究内生真菌球毛壳菌(Chaetomium globosum)对油菜根肿病的室内生防作用。结果表明,灌根接种球毛壳菌孢子悬浮液后,油菜体内的过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶的活性均明显提高。球毛壳菌孢子悬浮液灌根接种油菜根部后,根肿病的发病率和病情指数均明显降低,对油菜根肿病的防效为76.88%。通过极性梯度萃取、薄层层析和HPLC从球毛壳菌发酵液中分离纯化活性物质,经质谱鉴定为C16鞘氨醇和植物鞘氨醇。鞘氨醇对根肿菌休眠孢子的萌发有明显的抑制作用,其MIC值小于0.1μg/mL,表明球毛壳菌防治油菜根肿病的机制为诱导系统抗性和次生代谢产物拮抗病原菌2种机制。     

生防真菌球毛壳ND35的RAPD特异序列的标记转换

利用随机扩增多态性DNA（RAPD）方法对包括球毛壳ND35在内的20个真菌分离物进行分析,筛选出球毛壳ND35的RAPD扩增特异性DNA片段,经pEASY—T3载体克隆和测序、Seqman整合后,用Primer5．0软件设计了球毛壳ND35的特异引物对CgND35—1：GTTGCCAGCCCGAGGGGAAG,CgND35—2：G111ACCAGCCATGCCTTGAAG,经优化PCR条件,成功获得球毛壳ND35的SCAR标记,该标记片段长度为329bp。用CgND35—1／CgND35—2引物对进行了SCAR标记特异性和灵敏度检测,表明该特异引物可用于球毛壳ND35的快速检测。     

转几丁质酶基因毛壳菌的抗病原真菌作用

含有来自绿色木霉Trichoderma viride 的内切几丁质酶基因chbi的真菌表达载体pECHBI,通过原生质体转化将该基因导入球毛壳菌Chaetomium globosum CG12菌株,内切几丁质酶活性的测定结果表明,1/5的CG12转化子的内切几丁质酶活性得到了明显提高,PDA平板测定证实毛壳菌转化子对9种病原真菌具有拮抗能力,其中4株转化子的拮抗能力被显著提高.     

球毛壳菌cox5基因克隆及特性分析

利用BlastX将球毛壳菌(Chaetomium globosum)ESTs序列与GenBank的Nr数据库进行相似性搜索,获得含有细胞色素c氧化酶亚基5基因(cox5)全长cDNA序列的EST(BP099084),以此设计引物。以球毛壳菌总RNA反转录产物为模板进行PCR扩增,获得球毛壳菌cox5的cDNA序列。cDNA全长685bp,编码169个氨基酸的多肽,蛋白质分子量18.3KD。蛋白质家族预测其属于cox4家族。球毛壳菌cox5是具有导肽的跨线粒体内膜的蛋白质。BlastP相似性分析表明cox5氨基酸序列保守性不高,与其相似性最高的是柄孢霉的cox5(Podospora anserina,CAB76570),相似性为75%。cox5基因的cDNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank上登录(登录号分别为DQ082750、AAY85812)。     

石榴叶斑病球毛壳菌生长习性及杀菌剂筛选

采用生长速率法研究了云南蒙自石榴叶斑病球毛壳菌菌丝生长的条件及有效杀菌剂。结果表明,球毛壳菌菌丝在26~34℃均能生长,适宜温度是26~32℃,最适温度为28℃;偏好75%~85%的相对湿度,最适相对湿度为85%;光照促进菌丝生长;pH值4.5~7.5时均适宜于球毛壳Bd-2菌丝的生长,最适pH值为6.5,表明该菌偏好弱酸性环境。不同碳源、氮源对球毛壳菌菌丝生长的影响均较明显,麦芽糖和蛋白胨对菌丝生长有显著的促进作用。随后,分别用75%百菌清、80%甲基硫菌灵和80%代森锰锌等3种常见杀菌剂,以及细辛、小桐子和夹竹桃等3种植物提取液在培养基上进行抑菌实验,从菌丝生长的抑制率大小初步鉴定80%甲基硫菌灵为该病害的有效杀菌剂;在3种植物提取液中,细辛提取液对球毛壳Bd-2的菌丝生长抑制率最高,4 mg·mL~(-1)抑菌率达100%。明确了云南蒙自石榴叶斑病球毛壳菌生长的环境条件及有效杀菌剂,为生产上化学防治提供了选择杀菌剂的理论基础。     

球毛壳菌二烯醇内酯水解酶基因克隆及序列分析

以球毛壳茵cDNA文库中获得的二烯醇内酯水解酶基因片段(GenBank Accn：BP099060)为基础,用RACE技术克隆出该基因的全长cDNA序列。序列长919bp,由450bp的3’RACE产物和608bp的5’RACE产物拼接而成。开放阅读框762bp,编码253个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为27．5kD,理论等电点为5．98。利用cDNA两侧非编码区序列作引物克隆出该基因的DNA序列。序列分析表明,该基因由2个内含子和3个外显子组成,外显子与内含子剪连接区符合AG—GT规则。克隆的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY465528,AY555772,AAS66899)。     

以潮霉素抗性为选择标记的毛壳霉原生质体转化

利用PEG方法，将含有潮霉素抗性标记的质粒pCB1003转化毛壳霉原生质体,并在高于毛壳霉敏感的潮霉素浓度下筛选转化子。转化率达1～2个转化子/μg质粒DNA。以潮霉素抗性的毛壳霉转化子的基因组DNA为模板进行PCR扩增及其产物的Southern杂交。结果表明，潮霉素抗性基因已整合入毛壳霉染色体。稳定性试验表明，所获得的转化子可通过有丝分裂稳定传代。     

球毛壳菌ACCC30566木聚糖酶生产低聚木糖的研究

利用玉米芯生产粗木聚糖,再用球毛壳菌 ACCC30566木聚糖酶液酶解粗木聚糖,获得低聚木糖,最后对低聚木糖进行提取纯化,并用薄层层析法初步测定了低聚木糖成分.结果表明:球毛壳菌ACCC30566木聚糖酶酶解产物主要成分为木二糖、木三糖、木四糖等低聚木糖,葡萄糖含量较少.该菌株所产木聚糖酶成分较纯,纤维素酶含量较低.可以用来生产低聚木糖.     

球毛壳ND35对植物生长的影响及其生防效果初探

［目的］研究球毛壳DN35对植物生长的影响及其生防效果,为该菌的推广应用提供依据。［方法］以植物内生真菌球毛壳（Chaetomiumglobosum）ND35为供试菌株,在温室和大田条件下测定其对植物生长的影响及其对5种植物病害的防治效果。［结果］ND35对杨树侧根和胸径生长有一定的促进作用。接种ND35能诱导杨树对腐烂病菌和叶锈病菌产生抗性;也能诱导番茄和菜豆对灰霉病菌产生系统抗病性;还可有效防治菜豆立枯病。［结论］内生真菌球毛壳ND35引起的诱导系统抗病性在植物病害的生物防治中有重要作用。     

球毛壳ND35对植物生长的影响及其生防效果

[目的]研究球毛壳ND35对植物生长的影响及其生防效果,为该菌的推广应用提供依据。[方法]以植物内生真菌球毛壳ND35为供试菌株,病原菌有杨树腐烂病菌、立枯丝核菌、番茄灰霉菌。（a）调查球毛壳ND35对植物生长的影响。在扦插杨树枝条时,设2个处理：①接种10g长有球毛壳ND35的麦粒培养基;②接种10g无球毛壳ND35的麦粒培养基为对照。出芽后,测量杨树高度、1．3m处的胸径,同时调查侧根（d≥8mm）数量。（b）大田试验测定球毛壳ND35对杨树腐烂病的拮抗作用。采用烫伤接种的方法,在主干距地面高50cm和100cm（约树干的1／3和2／3）处先用火烫伤树皮,再接种含病原菌菌丝体的PDA菌饼。在随后的1个多月统计发病情况,以29d后发病的为0级,26～28d发病的为1级,23～25d发病的为2级,20～22d发病的为3级,19d之内发病的为4级。分级计数,计算发病率、病情指数和拮抗效果。（c）大田试验调查球毛壳ND35对杨树叶锈病的拮抗作用。在杨树1．3、1．7、2．1m处分别调查2个处理组杨树叶片正面（冬孢子堆）及背面（夏孢子堆）的发病情况,在发病杨树上,根据同一高度叶正面和叶背面的病斑面积占叶片总面积的比例确定分级标准：没有发病为0级、0～20％为1级、20％～40％为2级、40％～60％为3级、〉60％为4级。计算发病率、病情指数和拮抗效果。（d）温室试验测定球毛壳ND35对灰霉病的诱导抗病作用。将菜豆、番茄分别分为2个处理：①接种拮抗菌ND35;②不接种ND35。分别测量病斑长短直径,计算病斑面积。（e）温室测定ND35对菜豆立枯病的防治效果。处理组：播种时接种内生菌球毛壳ND35,同时接种立枯丝核菌;对照组：播种时只接种立枯丝核菌。在接种10d后观察发病情况,根据病斑直径占茎基周长的比例确定分级标准：没有发病的植株为0级,〈25％为1级、25％～50％为2级、50％～75％为3级、〉75％为4级。计算病情指数和防治效果。[结果]球毛壳ND35在植物体内定殖后能促进杨树根系和胸径的生长,使植株粗壮,有利于提高植物的抗病性;接种球毛壳ND35能诱导杨树对腐烂病菌和叶锈病菌产生较好的拮抗效果;也能够诱导番茄和菜豆对灰霉病菌产生抗病性,诱导抗性效果分别达58．85％和35．65％;还可有效防治菜豆立枯病,防治效果达50．9％。[结论]内生真菌球毛壳ND35引起的诱导系统抗病性在植物病害的生物防治中有重要作用。     

内生真菌球毛壳ND35的生物安全性评价

本试验初步研究了植物内生真菌球毛壳（Chaetomium globosum）ND35抗生物质粗提物对植物生长性状和植物根际土壤微生物的影响,对小白鼠、大白兔的毒性,子囊孢子在水中的存活及对鱼类的安全性。结果表明,球毛壳ND35抗生物质粗提物对黄瓜、菜豆和小麦的种子是安全的,并且能够显著增加须根数和根鲜重,促进种苗生长,对根际菌群数量无显著影响,对动物来说属低毒级;球毛壳ND35子囊孢子在水中能自行消解,且低于10^5cfu／ml时为泥鳅生长无显著影响;表明球毛壳菌ND35无毒、无污染,用于土传病害的生物防治无明显性风险。