成年牛瘤胃上皮细胞原代培养方法研究

为了更加经济便捷,微观科学地研究成年牛瘤胃生理及营养代谢机制,本试验着手建立成年牛瘤胃上皮细胞(ruminal epithelium cell,REC)的原代培养方法,其主要分为瘤胃微生物去除和细胞分离培养两部分。首先用9种不同种类和剂量的抗生素洗涤液,冲洗瘤胃上皮组织。根据微生物去除结果,确定最佳种类和剂量的抗生素洗涤液;然后采用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA在不同条件下对瘤胃上皮进行连续消化和分步消化以及先用0.1%胶原酶I消化再用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA在37℃分步消化,根据所得的细胞特征以及细胞增殖活性来确定适合成年牛瘤胃上皮细胞的分离方法。结果表明,瘤胃上皮需分别经过6倍青链霉素和6倍庆大两性霉素洗涤液的清洗后能有效去除瘤胃上皮表面微生物。而瘤胃上皮先经过0.1%胶原酶I消化30min再经0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA分步消化后可获得较多的上皮细胞,且活性较好,分离效果较理想。本试验为成年牛瘤胃上皮细胞的原代培养提供了参考方法。     

山羊瘤胃上皮细胞和空肠黏膜上皮细胞原代培养技术研究

本研究旨在建立山羊瘤胃上皮细胞(ruminal epithelium cell,REC)和空肠黏膜卜皮细胞(iejunum epithelial cell,JEC)的原代培养方法.首先进行胃肠道微生物去除的研究,设计9种不同种类和剂量的抗生素洗涤液,按随机区组原则冲洗采集到的瘤胃上皮和空肠黏膜.根据微生物去除试验结果,选择最佳种类和剂量的抗生素洗涤液对瘤胃上皮和空肠黏膜进行洗涤,然后采用不同的方法对REC和JMC进行分离与培养,根据分离所获的细胞特征以及细胞增殖活性结果确定适合山羊瘤胃上皮和空肠黏膜特性的分离方法.结果表明,为有效去除黏附的微生物,瘤胃上皮需分别经过5倍青链霉素和2倍庆大两性霉素洗涤液的冲洗,而空肠黏膜需分别经过5倍青链霉素和5倍庆大两性霉素洗涤液的冲洗.瘤胃上皮和空肠黏膜分别经2.50%胰蛋白酶+0.02%EDTA和0.20%Ⅳ型胶原酶+0.50 mmol/L CaCl2消化后可获得理想的细胞分离效果以及细胞增殖活性.本研究结果提示,根据胃肠道微生物的组成特征以及组织特性选择所确定的抗生素洗涤液以及组织细胞分离方法可用于山羊REC和JEC的原代培养.     

山羊乳腺上皮细胞培养体系的建立

乳腺是转基因动物技术的一个主要研究对象,因为通过遗传操作可改变乳汁成分,获得具有生物活性成分的重要外源蛋白质产物［１］。近几年来,乳腺生物反应器研究成功的例子屡有报道［２］,但通过乳腺生物反应器生产的蛋白质能达到商品化所需浓度的却为数不多,其中一个重要原因是人们对乳腺上皮细胞的各种生理特性及其基因表达调控的分子机制了解得不够深入［３］。有鉴于此,本研究建立了正常山羊乳腺上皮细胞（ＧＭＥＣ）培养体系,为进一步研究ＧＭＥＣ的增殖和分化以及基因表达调控的分子机制提供了有利条件。１　材料与方法１．１　细…     

不同氮源对瘤胃上皮细胞凋亡的影响

本试验采用细胞增殖试验、流式细胞术检测试验、Western blot试验、Hochest33342染色荧光显微镜检测等探究不同氮源（蛋氨酸与氯化铵）对瘤胃上皮细胞凋亡的影响及其可能的调控机制。结果表明：对瘤胃上皮细胞来说,处理36 h时,添加0.12 mmol NH4Cl组和0 mmol Met缺失组的OD值均达到对照组的一半,且均显著低于0.048 mmol Met组、0.12 mmol Met组（对照组）和0.048 mmol NH4Cl组（P <0.05）,0 mmol Met组比0.12 mmol NH4Cl组细胞活性显著降低（P <0.05）;添加0 mmol Met组的总凋亡率和晚期凋亡率最高,显著高于0.12 mmol Met组（对照组）和0.12 mmol NH4Cl组（P <0.05）,而0 mmol Met组和0.12 mmol NH4Cl组的早期细胞凋亡率均显著高于0.12 mmol Met组（对照组）（P <0.05）;与对照组相比,0.12 mmol NH4Cl组和0 mmol Met组的线粒体膜电势分别显著下降到71.99%和67.6...     

苹果酸对山羊瘤胃发酵的影响

以4头装有永久性瘤胃瘘管的本地山羊为试验动物,采用4×4拉丁方设计,研究苹果酸(0、5、10和15g/d)对山羊瘤胃发酵的影响。结果表明,日粮中添加苹果酸显著提高了瘤胃pH和丙酸比例(P<0.05),并显著降低了NH3-N、乳酸浓度和乙丙比(A/P)(P<0.05)。添加苹果酸后8 h时,5 g/d和10 g/d处理组的乳酸浓度分别比对照组降低了31%(P<0.05)和29%(P<0.05);添加苹果酸后2 h时,10 g/d和15 g/d处理组的NH3-N浓度均比对照组降低了30%(P<0.05)。10 g/d和15 g/d处理组乙丙比日平均值分别比对照组降低了12%(P<0.05)和22%(P<0.01);但各处理组总挥发性脂肪酸浓度(TVFA)未见明显变化。结果提示,日粮添加苹果酸可以改变瘤胃发酵类型,明显提高丙酸比例,促进乳酸和NH3-N的利用。     

槲皮素对脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮细胞抗氧化和抗炎的影响

为研究槲皮素对脂多糖(LPS)刺激下山羊瘤胃上皮细胞抗氧化和抗炎的影响,先将山羊瘤胃上皮细胞在添加0、5、10、20、40、60、80、120、160和320μg·mL?1槲皮素的基础培养基中培养6 h后,通过检测细胞活性,确定80μg·mL?1为槲皮素后续试验浓度.然后分成4组,山羊瘤胃上皮细胞在基础培养基(对照组,...     

槲皮素对脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮细胞抗氧化和抗炎的影响

为研究槲皮素对脂多糖(LPS)刺激下山羊瘤胃上皮细胞抗氧化和抗炎的影响,先将山羊瘤胃上皮细胞在添加0、5、10、20、40、60、80、120、160和320μg·mL?1槲皮素的基础培养基中培养6 h后,通过检测细胞活性,确定80μg·mL?1为槲皮素后续试验浓度.然后分成4组,山羊瘤胃上皮细胞在基础培养基(对照组,Con)和基础培养基[分别加入1μg·mL?1的LPS(L)、80μg·mL?1槲皮素(Q)以及1μg·mL?1 LPS和80μg·mL?1槲皮素(L+Q)]中培养6 h后,测定相关指标.结果显示:1)与Con组相比,L组瘤胃上皮细胞的过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性显著降低(P<0.05),而丙二醛(MDA)浓度显著升高(P<0.05);Q组瘤胃上皮细胞的CAT、SOD、总抗氧化力(T-AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性极显著升高(P<0.01),而MDA浓度显著降低(P<0.05).与L组相比,L+Q组瘤胃上皮细胞的CAT、SOD、T-AOC和GSH-PX活性显著升高(P<0.05).2)与Con组相比,L组瘤胃上皮细胞因子IK、趋化因子配体5(CCL5)、CXC趋化因子配体6(CXCL6)、CXCL8、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-1β 的mRNA相对表达量极显著升高(P<0.01).与L组相比,L+Q组瘤胃上皮细胞IK、CCL5、CXCL6、CXCL8、IL-6、TNF-α和IL-1β的mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01).3)与Con组相比,L组瘤胃上皮细胞Toll样受体2(TLR2)、核转录因子κB(NF-κB)、髓样分化因子88(MyD88)和转录因子3(IRF3)的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05),Q组瘤胃上皮细胞Toll样衔接蛋白(TOLLIR)和TLR 4的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05).与L组相比,L+Q组瘤胃上皮细胞TLR 2、NF-κB、MyD 88、TOLLIR和TLR 4的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05).综上所述,槲皮素能够提高山羊瘤胃上皮细胞的抗氧化和抗炎症性能,促进细胞增殖.     

激素和生长因子对山羊乳腺上皮细胞生长的影响

为了研究不同激素和生长因子对乳腺上皮细胞生长的影响.试验采用原代外植块培养法,经传代获得乳腺上皮细胞,添加不同浓度的FBS、EGF、胰岛素、氢化可的松和ITS,通过倒置相差显微镜观察,利用血细胞计数板来进行研究.结果表明: 5% 的FBS、10 μg/L的EGF、1 mg/L的胰岛素、0.1 mg/L的氢化可的松、10 mL/L的ITS对乳腺上皮细胞生长的影响较大.说明不同激素和生长因子对乳腺上皮细胞生长均具有调控作用,但作用程度不同.     

鸡小肠上皮细胞的分离及体外培养研究进展

小肠是食物消化吸收的主要场所,而小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)在营养物质的消化吸收及转运、消化酶分泌及肠道免疫方面发挥着重要作用。利用体外培养方法分离培养IEC为研究其分化增殖、凋亡等生物学功能提供了重要手段。作者综述了培养组织样的选择、分离IEC的常用方法、影响IEC培养的因素及IEC的鉴定方法等鸡IEC体外分离培养过程中的相关研究进展。     

酵母培养物对山羊瘤胃纤维素酶活及挥发性脂肪酸的影响

在高精料日粮条件下,以4头装有永久性瘤胃瘘管的本地山羊为试验动物,采用4×4拉丁方设计,研究酵母培养物(0、20、30、和40g/d)对山羊瘤胃纤维素酶活及挥发性脂肪酸(VFA)的影响。结果表明:日粮中添加酵母培养物有提高瘤胃中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)消失率及羧甲基纤维素酶活、木聚糖酶活的趋势,但差异均不显著(P>0.05)。日粮中添加酵母培养物能够提高瘤胃乙酸、丙酸、丁酸、TVFA浓度及乙酸丙酸比。与对照组相比,早饲后4h时,20g/d处理组乙酸浓度提高22%(P<0.05),TVFA浓度提高21%(P<0.05),30g/d处理组的丙酸浓度提高11%(P>0.05);18h时,30g/d处理组乙酸浓度和TVFA浓度较对照组分别提高32%(P<0.05)和28%(P<0.05)。     

浏阳黑山羊瘤胃上皮细胞周期分布、增殖和凋亡特点

本研究旨在建立浏阳黑山羊瘤胃上皮细胞的体外培养模型,并对其周期分布、增殖和凋亡特点进行研究。试验采集60日龄浏阳黑山羊的瘤胃上皮组织,应用0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化法对山羊瘤胃上皮组织进行消化,得到单个的山羊瘤胃上皮原代细胞进行体外培养。通过倒置显微镜对原代和传代培养阶段细胞形态进行观察,采用细胞计数法检测细胞的生长活性,应用细胞免疫组化学方法对传代细胞进行鉴定,并用流式细胞术检测山羊瘤胃上皮传代细胞周期分布情况和凋亡比率。结果显示:1)经0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化获得的山羊瘤胃上皮原代细胞,培养1 d开始贴壁生长,2 d开始生长较快(对数期),呈典型的"波峰"状生长,3~4 d生长最为迅速,7 d生长速度平稳(平台期)。2)经细胞免疫组化学方法的鉴定,细胞胞浆为黄褐色,即细胞角蛋白19呈阳性表达。3)膜联蛋白-V/碘化丙啶联合染色显示,随着培养时间的延长,细胞凋亡比率显著增加(P0.01)。结果表明,通过0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA的消化方法成功得到了浏阳黑山羊瘤胃上皮细胞,可为今后研究反刍动物瘤胃相关机制与功能提供模型。     

亚急性瘤胃酸中毒奶山羊瘤胃上皮形态结构和通透性的变化

本试验旨在研究亚急性瘤胃酸中毒(SARA)对瘤胃上皮形态结构和通透性的影响。选用体况良好、体重相近的泌乳期萨能奶山羊9只,随机分为3组(对照组、SARA组、恢复组,n=3),对照组饲喂基础饲粮[非纤维性碳水化合物与中性洗涤纤维比(NFC/NDF)=1.40],SARA组和恢复组先后饲喂NFC/NDF为1.40、1.79、2.31、3.23的4种试验饲粮诱导SARA发生,每种饲喂15 d,恢复组奶山羊待SARA诱导成功后自由采食青干草30 d。对照组奶山羊分别在饲养30、60(与SARA组3只同时)和90 d(与恢复组3只同时)各屠宰1只。采集瘤胃腹囊部上皮组织用于石蜡切片、透射电子显微镜观察及尤斯灌流系统(Ussing chamber)研究。结果表明:1)组织切片结果显示,瘤胃上皮角质层厚度SARA组显著高于对照组和恢复组(P0.05),恢复组显著低于对照组(P0.05);颗粒层厚度对照组显著高于SARA组和恢复组(P0.05),但SARA组和恢复组之间无显著差异(P0.05);棘突层厚度3组之间无显著差异(P0.05);上皮总厚度恢复组显著低于对照组和SARA组(P0.05),但对照组与SARA组之间无显著差异(P0.05)。透射电子显微镜结果显示,SARA组瘤胃上皮紧密连接被破坏,细胞间隙增大,棘状层细胞线粒体出现降解并出现空泡。2)与对照组相比,SARA组和恢复组瘤胃上皮短路电流(Isc)、组织导电性(Gt)和辣根过氧化物酶(HRP)流速显著升高(P0.05),跨膜电位差(PD)显著降低(P0.05)。综合得出,SARA破坏了奶山羊瘤胃上皮形态结构的完整性,使瘤胃上皮通透性增加,导致瘤胃上皮屏障功能长期受损。     

谷氨酰胺及其二肽对过氧化氢诱导山羊瘤胃上皮细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响

本试验通过建立过氧化氢(H2O2)诱导山羊瘤胃上皮传代细胞凋亡模型,研究谷氨酰胺(Gln)、甘氨酰谷氨酰胺(Gly-Gln)和丙氨酰谷氨酰胺(Ala-Gln)对凋亡细胞的凋亡率及Bcl-2、Bax基因表达量的影响。选用60日龄湘东黑山羊的瘤胃上皮传代细胞,采用不同浓度[0(对照组)、100、400、800μmol/L]的H2O2培养细胞,应用流式细胞术检测细胞凋亡情况。传代瘤胃上皮细胞分为5组,对照组和1组分别添加0、800μmol/L H2O2,2组、3组、4组均添加800μmol/L H2O2,同时分别添加17.28 mmol/L Gly-Gln(2组)、16.0 mmol/L Gln(3组)、16.0 mmol/L AlaGln(4组),应用流式细胞术检测细胞凋亡情况,同时采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测细胞Bcl-2、Bax基因表达量。结果显示:1)与对照组相比,当H2O2浓度增加到800μmol/L时,早期凋亡的凋亡率显著增加(P0.05),而晚期凋亡的凋亡率随着H2O2浓度的增加呈现增加后减少的趋势,但相对于对照组,都呈显著增加(P0.05)。2)与对照组相比,4组晚期凋亡的凋亡率显著增加(P0.05),试验组早期凋亡的凋亡率均显著增加(P0.05)。3)与对照组相比,试验组Bcl-2/Bax均显著增加(P0.05);与1组相比,2组、3组和4组Bcl-2/Bax均显著增加(P0.05),且2组显著高于3组、4组(P0.05)。综合得出,Gly-Gln对H2O2引起山羊瘤胃上皮细胞早期凋亡具有一定的保护作用。     

牛输卵管上皮细胞培养的研究

用０．７６％的ＥＤＴＡ分离剥取输卵管上皮细胞是一种好的试剂,１０％胎牛血清（ＦＣＳ）ＴＣＭ－１９９培养其上皮细胞,５－６ｄ即可生长成单层,寿命可延至３－４周,共同培养从第７天开始,其囊胚发育率显著高于与颗粒细胞共同培养。     

不同NDF/NFE比的日粮对山羊瘤胃发酵参数影响的研究

利用4只(35±2.5)kg装有瘤胃瘘管的徐淮白山羊,采用拉丁方试验设计,饲喂NDF/NFE分别为1.46(A组)、1.2(5 B组)、1.0(3 C组)、0.8(2 D组)的4种日粮,研究其对瘤胃内环境参数的昼夜动态变化规律的影响。结果表明:①瘤胃pH随NDF/NFE的降低而降低,由A组的6.37降至D组的5.86;②乙酸浓度以B组最高,极显著(P<0.01)高于A、C和D组,A、C、D 3组则依次降低(P>0.05);丙酸浓度以B、D两组较高,极显著(P<0.01)高于A和C组;丁酸浓度随NDF/NFE降低而升高,D组最高,极显著(P<0.01)高于C和B组;总VFA浓度B组最高,极显著(P<0.01)高于D组,显著(P<0.05)高于A、C组;乙酸/丙酸比随NDF/NFE比的降低而减小,A组极显著(P<0.01)大于B、C和D组;③瘤胃氨态氮平均浓度随日粮NDF/NFE比的降低而升高,由A组的8.37mg/dL升至D组的13.71mg/dL。     

酵母菌培养物对瘤胃发酵的影响

本研究采用完全随机试验设计,使用持续动态人工瘤胃装置,研究了酿酒酵母菌培养物对瘤胃发酵的影响。试验处理为对照组、1%和5%(占发酵液体积)酿酒酵母菌培养物添加组。通过对瘤胃液pH、微生物蛋白质(MCP)、氨态氮(NH3-N)、挥发性脂肪酸(VFA)浓度的测定得出以下结果:添加酿酒酵母菌培养物对pH和NH3-N浓度没有显著影响(P>0.05);5%酿酒酵母菌培养物添加组显著提高MCP浓度并降低了丙酸浓度(P<0.05);而酿酒酵母菌培养物对总挥发酸酸、乙酸、丁酸和乙、丙酸比例没有显著影响(P>0.05)。以上结果表明:添加一定量的酿酒酵母菌培养物可在不改变瘤胃发酵类型的情况下,促进微生物蛋白质的合成。     

幼龄反刍动物瘤胃上皮细胞β-羟基丁酸代谢与调控机制

β-羟基丁酸(β-hydroxybutyric acid,BHBA)是酮体的主要成分之一,在反刍动物瘤胃中由微生物发酵产生的丁酸在瘤胃上皮细胞中氧化生成,BHBA对反刍动物瘤胃上皮细胞的代谢与增殖具有重要调控作用。近年来,有关BHBA研究多集中在肝脏生酮、奶牛酮病及泌乳等方面,关于BHBA与幼龄反刍动物瘤胃上皮细胞生长发育之间的关系及内在机制研究很少。本文重点针对BHBA在瘤胃上皮的生成、转运,以及BHBA作为信号分子调控瘤胃上皮细胞代谢与增殖的分子机制进行综述,这对于丰富瘤胃发育及调控理论与幼龄反刍动物培育营养策略具有重要意义。     

阴阳离子平衡对山羊瘤胃内环境及养分消化代谢的影响

选择装有永久瘤胃瘘管的黄淮山羊6只,随机分为3组,分别饲喂3种不同阴阳离子平衡(A组332mEq/kgDM、B组418 mEq/kgDM、C组496 mEq/kgDM)的日粮,研究日粮阴阳离子平衡对瘤胃消化代谢的影响。结果表明:提高日粮阴阳离子水平可有效提高瘤胃液pH值,在饲喂后8 h差异显著(P<0.05);青干草DM、CF的降解率在瘤胃内随时间的增加而增加,DM在同一时间段以B组最高,A组最低,且在12 h、24 h时A组显著低于B、C两组(P<0.05),在48 h时A、B、C 3组组间差异均显著(P<0.05)。CF的降解率在6 h时A、B、C 3组组间差异均显著(P<0.05),其他时间段均是B组最高,A、B两组显著高于C组(P<0.05)。     

饲粮中不同比例桑叶粉对湖羊瘤胃上皮组织结构的影响

本试验旨在研究饲粮中不同比例的桑叶粉对育肥湖羊瘤胃上皮组织结构的影响。选取3月龄育肥湖羊40只,随机分为5组,每组8只。各组用桑叶粉分别替代饲粮中精料的0(A组)、15%(B组)、30%(C组)、45%(D组)、60%(E组)。预试期2周,正试期8周。结果表明:1)B组和C组瘤胃重/复胃重显著高于A组(P0.05)。2)各组瘤胃乳头宽度的差异不显著(P0.05)。3)对于瘤胃上皮的角质层宽度,A组高于其他各组,其中显著高于C组和D组(P0.05);对于瘤胃上皮颗粒层宽度,除D组显著高于E组(P0.05)外,其余各组间差异不显著(P0.05);对于棘突层和基底层宽度,与A组相比,桑叶粉处理能提高棘突层和基底层的宽度,但是作用不显著(P0.05),D组和B组的基底层宽度显著高于C组(P0.05)。总之,用桑叶粉替代15%~45%的精料能在一定程度上提高湖羊复胃的重量,促进的棘突层和基底层细胞的分裂,从而促进瘤胃上皮组织发育,同时,也有效降低了瘤胃上皮角质层的宽度。     

卵巢表皮上皮的生物学特性及其细胞培养

将近90%以上的恶性卵巢癌发生于覆盖在卵巢表面的单层上皮细胞——卵巢表皮上皮(ovarian surface epithelium,OSE),将其称之为卵巢表皮癌。由于先前研究人员未找到合适的动物模型,卵巢表皮上皮细胞的培养方法在近期才得以确立。作者旨在于总结卵巢表皮上皮的生物学特性及其细胞培养方法和不同物种间卵巢表皮上皮特性的变化。