亚麻CAD基因克隆及反义表达载体的构建

本试验以亚麻(Linum usitatissimumL.)品种Argos为材料,分离了高纯度的RNA。用简并引物以RT-PCR的方法,克隆了亚麻CAD基因cDNA部分序列,长度为477bp,构建了pGEM-T-CAD质粒。用限制性内切酶EcoRI酶切pGEM-T-CAD质粒和载体pGEM-7Zf(-),进行连接,构建成中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒。用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒和pBI121载体,进行连接,构建了亚麻CAD基因反义植物表达载体pBI121-antiNTCAD。     

亚麻CAD基因克隆及反义表达载体的构建

本试验以亚麻(Linum usitatissimum L.)品种Argos为材料,分离了高纯度的RNA.用简并引物以RT-PCR的方法,克隆了亚麻CAD基因cDNA部分序列,长度为477bp,构建了pGEM-T-CAD质粒.用限制性内切酶EcoR I酶切pGEM-T-CAD质粒和载体pGEM-7Zf(-),进行连接,构建成中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒.用限制性内切酶Xba I和BamH I双酶切中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒和pBI121栽体,进行连接,构建了亚麻CAD基因反义植物表达载体pBI121-antiNTCAD.     

大豆11S球蛋白Gy5(A3B4)cDNA的克隆及植物表达载体的构建

从大豆(花生豆1号)未成熟种子中提取总RNA,逆转录形成cDNA第一条链.根据genebank中大豆11S球蛋白Gy5的cDNA序列设计引物,用PCR方法扩增Gy5的cDNA序列,克隆到pUC19质粒载体上,并测定其全序列.用限制性内切酶PstI和EcoRI酶切重组质粒,将目的片段与质粒pCAMBIA1301连接,构建成植物表述载体并转化到农杆菌中,以便于以后的研究利用.     

苎麻茎皮cDNA文库的构建

以生长中期的苎麻茎皮为材料，提取总RNA，经纯化mRNA后，合成双链cDNA。双链cDNA加上EcoRI—SmaI接头后，用限制酶NotI酶切并除去小于400bp的短链cDNA，长的cDNA片段连接到EcoRI—NotI酶切载体pAP3neo上，获得滴度为2．6×10^4的苎麻cDNA文库，插入片段大部分分布在500bp-1500bp之间。该文库的建立为苎麻表皮功能性新基因的发现奠定了基础。     

外源诱导提高茶树新梢EGCG含量过程的相关基因分离

以福鼎大白茶为试验材料,用荧光标记的mRNA差异显示技术,研究外源诱导物ID1在诱导提高茶树新梢EGCG含量过程中基因转录水平的变化,分离相关基因片段。从诱导茶树芽叶及对照中分离出18个差异显示的cDNA片段,反向Northern杂交显示其中5个片段可能是来自差异表达基因的转录产物,其中编号DD2、DD9、DD12、DD16为诱导表达上调片段,编号DD3为诱导表达下调片段。将这5个片段克隆于pGEM T-Easy载体,酶切鉴定结果显示载体以及插入的特异片段。序列测定表明,DD12的cDNA片段出现未识别码。通过NCBI网站(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)作Blast序列同源性分析。结果表明,DD2的差异cDNA片段与烟草的硫氧还蛋白过氧化物酶的基因序列同源;DD3的差异cDNA片段,是茶树一个RAPD产物(AJ516005.1)的一段序列,功能未知;DD9的差异cDNA片段与拟南芥、莲子的NADH脱氢酶具有很高的同源性;DD16的差异cDNA片段未能找到与之同源的基因序列,可能为新基因。     

大豆llS球蛋白Gy5（A3B4）cDNA的克隆及植物表达载体的构建

从大豆(花生豆1号)未成熟种子中提取总RNA，逆转录形成cDNA第一条链。根据genebank中大豆llS球蛋白Gy5的cDNA序列设计引物，用PCR方法扩增Gy5的cDNA序列，克隆到pUC19质粒载休上，并测定其全序列。用限制性内切酶PstI和EcoRI酶切重组质粒，将目的片段与质粒pCAMBIA1301连接，构建成植物表述载体并转化到农杆菌中，以便于以后的研究利用。     

苎麻茎皮cDNA文库的构建

以生长中期的苎麻茎皮为材料,提取总RNA,经纯化mRNA后,合成双链cDNA。双链cDNA加上EcoRI-SmaI接头后,用限制酶NotI酶切并除去小于400bp的短链cDNA,长的cDNA片段连接到EcoRI-NotI酶切载体pAP3neo上,获得滴度为2.6×104的苎麻cDNA文库,插入片段大部分分布在500bp～1500bp之间。该文库的建立为苎麻表皮功能性新基因的发现奠定了基础。     

玉米淀粉分支酶基因的克隆和反义载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了玉米淀粉分支酶的cDNA基因片段,并将其克隆到pMD18-Tvector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了DNA全序列.结果表明:克隆片段全长为1 698 bp.将该基因反向插入到pCAMBIA1301的CaMV35S启动子之后,构建了反义表达载体.     

茶树咖啡因合成酶基因RNA干涉表达载体构建

咖啡因合成酶（TCS）是茶树咖啡因生物合成途径中的一个关键酶,催化7-甲基黄嘌呤转变为可可碱和可可碱转变为咖啡因。抑制TCS基因表达是培育低咖啡因茶树的最有效途径。用RT-PCR方法扩增茶树TCS基因的两个cDNA片段,并克隆入T-载体中。干涉载体和TCS基因片段的T克隆经限制性内切酶两次双酶切与连接,将两个TCS基因片段分别反向重复插入到干涉载体pFGC5941,构建了TCS基因的RNA干涉载体,分别命名为pFGC5941-TCS02和pFGC5941-TCS03。经PCR和DNA测序获得验证。TCS基因RNA干涉载体的构建为培育低咖啡因茶树奠定了基础。     

木薯淀粉分支酶基因克隆及反义表达载体的构建

利用RT-PCR方法,用木薯块根cDNA做模板克隆获得支链淀粉合成的关键酶基因SBEII,经序列分析,同源性为98.07%;以PCAMBIA1301为基础,构建了以块根特异表达启动子Sporamin驱动的SBEII基因反义结构的植物表达载体.