H3K4和H3K9三甲基化在猪体外成熟卵母细胞和克隆胚胎中的表达分析

该研究主要运用单细胞免疫荧光技术分析猪卵母细胞和克隆胚胎发育过程中,H3K4和H3K9三甲基化(H3K4me3,H3K9me3)的表达情况.收集体外成熟0h,6h,12h,24h,30h,36h,42h的猪卵母细胞;同时通过体细胞核移植操作获得一细胞、四细胞、桑葚胚和囊胚期克隆胚胎,经过免疫荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察H3K4me3和H3K9me3修饰在卵母细胞和胚胎中的变化情况.免疫荧光结果显示,在不同减数分裂阶段的猪卵母细胞内均能观察到H3K4me3的表达,并且呈现出逐渐下降的趋势;在生发泡期(GV),生发泡晚期(L-GV)和生发泡破裂(GVBD)阶段的卵母细胞中能发现明显的H3K9me3表达,随着减数分裂的进行,H3K9me3表达消失,在第一次减数分裂中期前阶段(Pre-MI)到第二次减数分裂中期(MⅡ)阶段卵母细胞中未发现H3K9me3荧光信号.H3K4me3和H3K9me3在不同发育阶段的猪克隆胚胎中都有表达,其中H3K4me3在不同阶段胚胎中荧光信号强度相近,H3K9me3在四细胞胚胎中荧光强度降低,在桑葚胚和囊胚中荧光强度出现升高的趋势.以上结果说明,H3K4me3参与调控猪卵母细胞体外成熟的整个过程,H3K4me3和H3K9me3在猪体细胞核移植胚胎早期发育过程中可能具有调控作用.     

H3K4me3对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响

哺乳动物卵母细胞的成熟与组蛋白甲基化修饰密切相关. CPI-455是一种组蛋白去甲基化酶抑制剂,可特异性抑制组蛋白去甲基转移酶KDM5A/B的活性,提高H3K4me3(组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化)的表达水平.本实验在猪卵母细胞体外成熟过程中添加CPI-455,探究H3K4me3组蛋白甲基化对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响.首先,用不同浓度CPI-455在不同时间处理猪卵母细胞,发现在0～22 h添加5μmol CPI-455的处理方法效果最佳,卵母细胞成熟率与囊胚形成率均显著高于未处理组(p0.05). 0～22 h添加5μmol CPI-455处理卵母细胞显著提高了囊胚中H3K4me3的表达(p0.05),降低了卵母细胞中KDM5A和KDM5B的表达(p0.05),并且显著提高了囊胚中Nanog,Oct4,CDX2等多能性基因的表达(p0.05). CPI-455处理可以通过降低卵母细胞中相关基因的表达,上调囊胚中多能性基因的表达,调控H3K4me3的甲基化水平,从而促进猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育.     

动物组蛋白H3K4三甲基化转移酶MLL3的生物信息学分析

[目的]对动物组蛋白H3K4三甲基化转移酶MLL3进行生物信息学分析。[方法]利用生物信息学的方法,对小鼠MLL3的基因结构、氨基酸序列、系统进化树、染色体定位和共线性等问题进行分析。[结果]编码合成的小鼠MLL3蛋白质一级结构包括7个锌指结构域、1个HMG-box(高迁移率族蛋白)、1个FYRN(N-末端富含苯丙氨酸或酪氨酸区域)、1个FYRC(C-末端富含苯丙氨酸或酪氨酸区域)、1个SET域和1个postSET域;从序列对比和同源性上发现,该研究中的19种动物都基本上具有这些结构,说明这些结构在进化上是相对保守的,其中SET域具有高度的保守性,是维持组蛋白甲基化酶活性所必须的;从系统发生上看,19种动物在进化树上的位置与其分类地位相一致;在共线性分析中,虽然小鼠和人的MLL3基因位于不同的染色体上,但其上游和下游具有相同的基因,说明小鼠和人的MLL3基因具有共线性。[结论]不仅揭示了MLL3的核苷酸序列及其氨基酸序列的一级结构,为以后研究其高级结构和蛋白质的功能奠定了基础;同时也为后期进行小鼠MLL3基因的引物设计、启动子分析、基因的克隆、定位和表达的调控模式研究奠定了基础。     

鸡卵泡颗粒层组蛋白H3K4me3和H3K27me3的表达研究

卵母细胞成熟过程受组蛋白H3K4me3(trimethylation of lysine 4 on histone 3)和H3K27me3(trimethylation of lysine 27 on histone 3)及其相关的甲基化和去甲基化酶的调控,因此考虑对鸡的卵泡发育也存在一定的影响。选取“苏禽3号”配套系第一母本为研究对象,采用Western blot法探究组蛋白H3K4me3和H3K27me3在鸡卵泡不同发育阶段颗粒层中蛋白的表达模式。结果表明：在苏禽3号卵泡颗粒层中,组蛋白H3K4me3在卵泡发育不同阶段表达模式呈降低→升高→降低→升高的波浪形趋势,波浪变化较为平缓,在F5、F2和F1 3个表达高点的表达量与SWF(small white follicle)、LWF(large white follicle)、SYF(small yellow follicle)和F3 4个表达低点的表达差异显著（P<0.05）。组蛋白H3K27me3在不同发育阶段表达模式亦呈波浪形表达趋势,波浪变化起伏较明显,在SWF、SYF和F33个表达高点的表达量与F5、F4、F1和F2 4个表达低点的表达差异显著（P<0.05）。相关性分析显示,组蛋白H3K4me3与H3K27me3在不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达呈较强的负线性相关(R=-0.808,P=0.000)。结果提示：组蛋白H3K4me3和H3K27me3在不同发育阶段卵泡颗粒层中的表达具有组织差异性,呈负相关的动态修饰性,可能共同协调卵泡生长过程中各基因的表达与功能,研究结果为鸡繁殖性状调控机理提供了理论依据。     

BIX-01294对山羊胎儿成纤维细胞生长状态和组蛋白H3K9二甲基化的影响

为探讨BIX-01294对供核细胞的影响,使用不同浓度的BIX-01294处理山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblasts,GEFs),并检测其细胞活力、细胞周期、细胞凋亡、H3K9me2水平和多能性基因的mRNA水平。细胞活力检测结果显示,BIX-01294浓度在1.0μmol/L以下不会影响细胞活力,2.0μmol/L时24h和48h处理组的细胞活力显著下降(P0.05),≥4.0μmol/L时所有处理组的细胞活力均极显著下降(P0.01)。细胞周期和凋亡检测结果显示,H3K9me2下调会引起细胞周期的停滞和正常细胞的减少,其中BIX-01294在大于2.0μmol/L时G0/G1期细胞的比例极显著升高(P0.01),4.0μmol/L时凋亡细胞极显著增加(P0.01)。处理后的细胞H3K9me2水平均极显著下降(P0.01),但大于1.0μmol/L的处理浓度能获得较好的下调效果。处理后细胞Oct4、Sox2和Nanog的mRNA水平均有不同程度的增加,其中Oct4和Nanog的mRNA水平增加极显著(P0.01)。说明:采用1.0μmol/L BIX-01294处理山羊胎儿成纤维细胞,可以下调H3K9me2水平,增加G1/G0期细胞比例,上调细胞多能性基因表达量,而且不影响细胞活力。     

动物组蛋白H3K4三甲基化转移酶MLL3的生物信息学分析(英文)

[目的]对动物组蛋白H3K4三甲基化转移酶MLL3进行生物信息学分析,从而探寻其相对保守的进化过程以揭示组蛋白H3K4三甲基化转移酶MLL3在在人类癌症的中的作用。[方法]利用生物信息学的方法,对小鼠MLL3的基因结构、氨基酸序列、系统进化树、染色体定位和共线性等问题进行分析。[结果]编码合成的小鼠MLL3蛋白质一级结构包括7个锌指结构域、1个HMG-box(高迁移率族蛋白)、1个FYRN(N-末端富含苯丙氨酸或酪氨酸区域)、1个FYRC(C-末端富含苯丙氨酸或酪氨酸区域)、1个SET域和1个postSET域;从序列对比和同源性上发现,该研究中的19种动物都基本上具有这些结构,说明这些结构在进化上是相对保守的,其中SET域具有高度的保守性,是维持组蛋白甲基化酶活性所必须的;从系统发生上看,19种动物在进化树上的位置与其分类地位相一致;在共线性分析中,虽然小鼠和人的MLL3基因位于不同的染色体上,但其上游和下游具有相同的基因,说明小鼠和人的MLL3基因具有共线性。[结论]不仅揭示了MLL3的核苷酸序列及其氨基酸序列的一级结构,为以后研究其高级结构和蛋白质的功能奠定了基础;同时也为后期进行小鼠MLL3基因的引物设计、启动子分析、基因的克隆、定位和表达的调控模式研究奠定了基础。     

H3K9me3对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响

H3K9的异常甲基化被认为是影响胚胎发育障碍的主要表观遗传修饰之一. 毛壳素是 H3K9me3的特异性抑制剂,能抑制其甲基转移酶SUV39H1/2和G9A的活性,下调 H3K9me3水平.本实验通过在猪卵母细胞体外成熟过程中添加毛壳素, 探究调控 H3K9me3对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响. 在0～22h用...     

小鼠卵母细胞体外成熟过程中wee 1和cdc 25基因的表达

已知 wee 1基因产物是成熟促进因子 ( maturation promoting factor,MPF)活性的负调节者〔7〕,而 cdc2 5基因产物是 MPF活性的正调节者〔2〕。后来在小鼠和人类的体细胞发现了cdc2 5的等效基因和 wee1基因〔3～ 6〕。但哺乳动物卵母细胞长期被阻滞在第一次成熟分裂的前期 ,是否因 MPF的活性受到 wee1基因产物的抑制 ,而促性腺激素等解除这种抑制是否由 cdc2 5基因表达所引起 ,目前尚未见报道。本试验目的在于研究小白鼠卵母细胞成熟过程中 wee1、cdc2 5基因的表达规律 ,为揭示哺乳动物卵母细胞成熟过程中分子生物学调控机理提供科学资料…     

小鼠卵母细胞减数分裂期间组蛋白乙酰化及其对卵母细胞成熟质量的影响

为了解卵母细胞减数分裂期间组蛋白乙酰化规律,以组蛋白H4K12的乙酰化为标记,利用免疫荧光技术,研究了小鼠卵母细胞减数分裂期间组蛋白乙酰化的变化规律及其对卵母细胞成熟质量的影响。结果表明:小鼠生发泡期卵母细胞中组蛋白高度乙酰化,在第1及第2次减数分裂中期则发生去乙酰化;II型组蛋白去乙酰基酶(HDACs)负责调控减数分裂过程中的组蛋白乙酰化;减数分裂过程中存在组蛋白乙酰化/去乙酰化的动态变化;特异性抑制II型HDACs不影响卵母细胞成熟、纺锤体形态和染色体排列,但广谱性抑制HDACs后会导致卵母细胞染色体排列发生改变。     

小鼠早期胚胎发育过程中胚胎发育相关功能基因mRNA的表达

运用半定量RT-PCR技术对候选功能基因在表达水平上检测不同交配组合胚胎早期发育过程中存在的差异,选取正常DDK品系小鼠和BALB/c品系小鼠,进行不同组合交配.选取8个功能基因EGF,EGF-R,TGF-α,Bcl-2,Mcl-1,C-myc,H-ras,LIF作为候选基因.结果表明,在2细胞期有EGF,Bcl-2,Mcl-1 3个基因进行表达,且3个基因表达差异显著(P＜0.05);在4细胞期有6个基因进行表达,EGF,Bcl-2,Mcl-1,EGF-R 4个基因表达差异显著(P＜0.05);在8细胞期有7个基因进行表达,EGF,Bcl-2,Mcl-1,EGF-R 4个基因表达差异显著(P＜0.05).杂交胚胎从8细胞期之后即桑葚期开始发生凋亡现象,因胚泡形成障碍,而导致胚胎早期死亡;候选基因中Mcl-1,Bcl-2,EGF,EGF-R基因在胚胎细胞中表达量差异显著(P＜0.05),并且与正常胚胎相比杂交胚胎中差异基因的表达均下调,这些基因表达水平的下调可能间接地引发早期胚胎致死现象.     

家鸡胚胎发育过程DNA甲基化的MSAP检测

[目的]检测鸡胚不同发育阶段时的DNA甲基化水平。[方法]以不同发育阶段的家鸡胚胎为试验材料,提取基因组DNA,采用甲基敏感扩增片段多态性（methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP）技术对其甲基化水平进行了初步检测。[结果]共发现甲基化位点880个,CCGG位点单链外侧的胞嘧啶甲基化位点比例为20．48％,双链CCGG位点的内侧胞嘧啶甲基化19．30％,两者总比例为39．78％。[结论]鸡胚发育过程,DNA甲基化随着胚胎的发育呈升高趋势。     

小鼠原始生殖细胞迁移过程中H2A.Z的表达

小鼠原始生殖细胞(PGCs)迁移、增殖、性别分化都受着基因组和DNA表观遗传修饰的调控,H2A.Z与转录激活有关,可能与表观遗传修饰存在联系,通过PGCs单细胞及组织石蜡切片的免疫荧光方法进行研究。结果表明,PGCs在迁移过程中,8.5 dpc时PGCs中不存在H2A.Z;迁移至生殖嵴时H2A.Z主要集中于细胞核,11.5dpc整个PGCs细胞核和细胞质都存在;13.5 dpc雌性的卵母细胞中H2A.Z主要集中于细胞质,而精原细胞中H2A.Z偏向集中于细胞核。综合基因组和DNA表观遗传修饰分析,H2A.Z的表达与其有密不可分的联系。     

小鼠原始生殖细胞迁移过程中H2A.Z的表达

小鼠原始生殖细胞(PGCs)迁移、增殖、性别分化都受着基因组和DNA表观遗传修饰的调控,H2A.Z与转录激活有关,可能与表观遗传修饰存在联系,通过PGCs单细胞及组织石蜡切片的免疫荧光方法进行研究。结果表明,PGCs在迁移过程中,8.5 dpc时PGCs中不存在H2A.Z;迁移至生殖嵴时H2A.Z主要集中于细胞核,11.5dpc整个PGCs细胞核和细胞质都存在;13.5 dpc雌性的卵母细胞中H2A.Z主要集中于细胞质,而精原细胞中H2A.Z偏向集中于细胞核。综合基因组和DNA表观遗传修饰分析,H2A.Z的表达与其有密不可分的联系。     

猪孤雌激活胚胎和卵母细胞体外成熟过程中的甲基化检测

【目的】探索猪孤雌激活胚胎培养过程和猪卵母细胞体外成熟前后的DNA甲基化水平及其变化,为探讨猪孤雌激活胚胎和卵母细胞的发育提供理论依据。【方法】通过使用间接免疫荧光组化和激光共聚焦显微镜的荧光相对定量的两种方法来间接检测猪孤雌激活胚胎培养过程中和猪卵母细胞成熟前后的细胞5-甲基胞嘧啶的相对含量,观察其体外发育过程中甲基化水平的变化。【结果】随着体外培养时间的延长,猪孤雌激活胚胎的甲基化程度在二到桑葚胚时呈逐渐减弱趋势;在猪孤雌激活胚胎发育的过程中,同一个胚胎的不同卵裂球之间的甲基化水平有差异;内细胞团的甲基化水平低于滋养层。猪卵母细胞成熟前和体外成熟的基因组DNA甲基化水平相比,成熟前卵母细胞基因组DNA甲基化水平低于体外成熟后的卵母细胞基因组DNA甲基化水平;随着体外成熟时间的延长,猪卵母细胞的基因组DNA甲基化水平大致呈上升趋势。【结论】IVM/PA/IVC对猪卵母细胞及早期胚胎的甲基化模式有一定影响;猪卵母细胞体外培养过程中,猪卵母细胞核基因组的甲基化水平接近于正常体内的卵母细胞。     

miRNA-145、Oct4和Sox2基因在小鼠早期胚胎发育分化中的表达情况

【目的】揭示miRNA-145、Oct4和Sox2基因与早期胚胎细胞表型间可能存在的关联,为阐明miRNA-145调控早期胚胎发育分化的分子机制奠定基础。【方法】利用手术法收集SPF级昆明小白鼠体内生产的2-细胞胚胎和囊胚,采用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测小鼠2-细胞胚胎和囊胚中miRNA-145、Oct4和Sox2基因的表达情况。【结果】在小鼠早期胚胎由2-细胞胚胎发育至囊胚的过程中,miRNA-145在囊胚中的表达量显著高于在2-细胞胚胎中的表达量（P〈0.05,下同）,而Oct4和Sox2在囊胚中的表达量显著低于在2-细胞胚胎中的表达量。【结论】miRNA-145基因表达量上调与Oct4、Sox2基因表达量下调是随着小鼠早期胚胎发育分化的进行同时发生。     

孕鼠DEHP暴露影响胎儿早期卵母细胞H3K27me3表达的研究

本文以胎鼠卵母细胞为研究对象,分析了妊娠母鼠孕期暴露邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)对胎鼠卵母细胞早期发育过程中组蛋白甲基化修饰程度的影响,结果发现:妊娠母鼠在12.5 dpc到16.5 dpc 期间暴露40 μg/kg DEHP,第一次减数分裂前期的胎鼠雌性生殖细胞的H3K27me3表达受到了显著影响,导致H3K27me3强阳性细胞比例显著减少.该研究结果说明DEHP可通过孕鼠影响胎鼠卵母细胞早期发育过程中的组蛋白甲基化修饰.     

斑马鱼卵母细胞第一次减数分裂过程中MAPK的表达及定位

用不同浓度的促滤泡激素(FSH)和17α,20β-双羟孕酮分别作用于斑马鱼卵母细胞。结果表明,1 IU/mL的FSH和5 ng/mL的17α,20β-双羟孕酮对斑马鱼卵母细胞生发泡破裂都具有明显促进作用。其中17α,20β-双羟孕酮的作用效果较好,经过SDS-PDGE电泳和WesternBlot检测发现,5 ng/mL 17α,20β-双羟孕酮对斑马鱼卵母细胞诱导后,分裂原蛋白激酶被激活,生发泡破裂的卵母细胞数目增多。免疫组化检测证实,第Ⅰ期的卵母细胞中分裂原蛋白激酶没有激活,第Ⅱ期、第Ⅲ期细胞质中分裂原蛋白激酶开始激活,第Ⅴ期卵母细胞的胞质与核区同时存在活性的分裂原蛋白激酶,并伴有生发泡破裂。以上结果说明分裂原蛋白激酶在斑马鱼卵母细胞第一次减数分裂恢复过程中发挥重要作用,并且随着分裂原蛋白激酶激活,其活性部位从细胞质转移到细胞核。     

斑马鱼卵母细胞第一次减数分裂过程中MAPK的表达及定位

用不同浓度的促滤泡激素(FSH)和17α,20β-双羟孕酮分别作用于斑马鱼卵母细胞。结果表明,1 IU/mL的FSH和5 ng /mL的17α,20β-双羟孕酮对斑马鱼卵母细胞生发泡破裂都具有明显促进作用。其中17α,20β-双羟孕酮的作用效果较好,经过SDS-PDGE电泳和Western-Blot检测发现,5 ng/mL 17α,20β-双羟孕酮对斑马鱼卵母细胞诱导后,分裂原蛋白激酶被激活,生发泡破裂的卵母细胞数目增多。免疫组化检测证实,第Ⅰ期的卵母细胞中分裂原蛋白激酶没有激活,第Ⅱ期、第Ⅲ期细胞质中分裂原蛋白激酶开始激活,第Ⅴ期卵母细胞的胞质与核区同时存在活性的分裂原蛋白激酶,并伴有生发泡破裂。以上结果说明分裂原蛋白激酶在斑马鱼卵母细胞第一次减数分裂恢复过程中发挥重要作用,并且随着分裂原蛋白激酶激活,其活性部位从细胞质转移到细胞核。