应用重组抗原建立检测牛传染性胸膜肺炎的间接ELISA方法

 【目的】丝状支原体丝状亚种SC（Mycoplasma mycoides subsp mycoides SC，MmmSC）是引起牛传染性胸膜肺炎（contagious bovine pleuropneumonia，CBPP）的病原体。成熟的脂蛋白LppQ N端是亲水性的，在自然感染和人工感染时，特异性免疫反应产生早，持续时间长，抗体滴度高，因此有理由相信脂蛋白LppQ N端片段将有可能成为一种理想的CBPP诊断抗原。【方法】由于TGA密码子在支原体中编码色氨酸（Trp），而在细菌中则为终止密码子，故利用一步重叠延伸PCR突变方法体外诱变中国生产抗原用毒株HVRI Ⅹ的lppQ基因进行原核表达，利用重组抗原建立间接ELISA方法。【结果】序列分析表明，将lppQ基因第198位的A成功突变为G， 并将突变后的脂蛋白LppQ N端基因片段插入原核表达载体pET32a的多克隆位点，构建了原核表达载体。重组菌经诱导后，表达出了分子量约为42 kD、带有6个组氨酸标签的重组融合蛋白，纯化后蛋白质纯度高达95%，Western blot结果显示，重组蛋白具有很好的免疫活性。将纯化的蛋白质稀释至0.35 ?g·ml-1，包被酶标反应板，优化反应条件，P/N为4.8（0.934/0.193）。应用TG-ROC统计软件分析确定阴阳性血清临界OD值为0.376，敏感性为95.8%（46/48）， 特异性为98.9%（161/163）。应用间接ELISA和补体结合试验（CFT）对来自3个省自治区3 817头份牛血清进行了检测。【结论】Kappa值为0.63，两种方法存在中、高度一致性。     

绵羊肺炎支原体贵州株P113基因的克隆与生物信息学分析

为获得绵羊肺炎支原体贵州株P113基因生物信息学特征,应用DNAStar、Mega 5.0、Protparam、Protscale、IEBD等工具对其(GZ-QX1株)P113蛋白特性、结构和功能进行预测分析。结果显示,绵羊肺炎支原体GZ-QX1株P113基因序列大小为3 240bp,编码1 079个氨基酸,与绵羊肺炎支原体Y98标准株、四川SC01株、猪肺炎支原体P97、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊亚种的核苷酸序列同源性分别为99.9%、81.9%、60.4%、3.9%和5.2%。P113蛋白是分子质量约119ku的碱性蛋白,具有较多优势抗原表位;蛋白结构分析显示,P113蛋白无跨膜结构,有9个N糖基化位点,59个丝氨酸、16个苏氨酸的磷酸化位点,14种保守的特异性蛋白质激酶的结合位点;蛋白功能分析认为,P113可能是某信号传导通路的信号分子,也是一种具有良好抗原性的结构蛋白。     

绵羊肺炎支原体 p113 基因的序列分析及功能预测

采用多种软件对p113基因的相似性、跨膜结构、重复序列、信号肽、抗原表位等进行预测,并与同源序列进行比较分析.结果表明,p113基因是猪肺炎支原体黏附素基因p97的直系同源基因,并具有与P97蛋白R2区类似的特征性重复序列.通过综合比较分析,推测P113蛋白极可能是绵羊肺炎支原体的黏附素和膜表面免疫原.     

西藏牦牛牛支原体的分离鉴定及其生长特性、耐药性分析

为确定引起西藏牦牛常发多发肺炎的细菌病原体,采集145份西藏牦牛鼻腔粘液,通过病原分离培养、菌落形态观察、生化试验和PCR鉴定等方法进行细菌检测;通过OD₆₃₀和pH变化对分离株进行生长曲线测定;采用K-B纸片法进行药物敏感性试验。结果显示:从145份牦牛鼻腔粘液中分离得到10株牛支原体;分离株菌落形态和生化试验结果均符合牛支原体的生物学特性;通过PCR分别扩增得到238 bp的uvrC特异性基因与1 500 bp 16S rRNA基因。10株分离株间的uvrC特异性基因和16S rRNA基因序列同源性较高,均与国际标准株PG45有高度同源性,uvrC特异性基因序列和16S rRNA基因序列与国际标准株PG45的同源性分别为98.4%~100%和99.1%~99.9%。生长曲线测定表明,分离株在PPLO培养基中培养24 h内为迟缓期,培养42 h后开始进入稳定期,78 h后开始进入衰亡期;3个分离株培养物的平均pH随着培养时间延长不断降低,其中24~42 h期间pH下降最快,随后下降速度减慢,至78 h后几乎不再变化。药物敏感性试验表明,分离株对大环内酯类、氨基糖苷类和林可胺类等药物均存在不同程度的耐药,但对强力霉素和卡那霉素敏感或中度敏感。     

解鸟氨酸拉乌尔菌ZK4菊酯农药降解酶基因BioH的克隆及原核表达

为挖掘新的拟除虫菊酯类农药降解基因，在大肠杆菌中实现异源高效表达，以本课题组前期筛选出的降解谱广泛、降解率较高的菌株解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)为研究对象，克隆其菊酯类农药降解酶基因BioH,在大肠杆菌中表达。通过解鸟氨酸拉乌尔菌全序列进行基因组注释、蛋白注释和通路注释，和已有菊酯类农药降解基因序列比对，筛选出潜在的具有菊酯类农药降解功能的基因；以解鸟氨酸拉乌尔菌基因组DNA为模板，根据功能基因序列设计特异性引物进行PCR扩增，回收目的片段后与pMD19-T载体连接，筛选阳性克隆并鉴定；酶切回收目的片段后和pET32a(+)表达载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，将验证正确的重组菌经IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE分析蛋白表达情况。结果表明：通过筛选得到BioH基因，该基因具有水解酶的作用，同时也具有其他菊酯类农药降解基因序列中存在的保守五肽motif-GXSXG,PCR扩增后得到大小为783 bp的条带，通过重组技术获得阳性克隆，PCR扩增、酶切和DNA测序进行验证，重组菌经0.2 mmol/L IPTG诱导4 h后获得约为...     

马转录因子TBX3基因的密码子使用偏好性分析

为了解马TBX3基因的密码子使用特性,为选择该基因最佳的受体以及合适的异源表达系统提供依据,利用CHIPS、CUSP、Codon W等软件对NCBI公布的马TBX3基因(GenBank登录号为XM_014742147.1)的密码子使用情况进行分析,并将其与马的10个肢体生长和肢体形态形成相关基因、模式生物基因组以及其他物种TBX3基因进行比较。结果表明:马TBX3基因偏好使用G/C结尾的密码子,存在19种偏好使用的密码子(RSCU1.20),其中:GCC、CTG、AGC和GTG偏好性较强(RSCU2.00);10个马相关基因在20种偏好密码子中偏好性较强的只有CTG,17种密码子偏好G/C结尾;通过比较30种动物的TBX3基因密码子偏好性,发现其TBX3基因表达水平一般,并且密码子偏好G/C结尾;基于RSCU值和CDS序列的聚类分析发现,奇蹄目的家马与食肉目的家猫、北极熊聚在一起,可见系统进化树更接近这30个物种的真实系统分类;在密码子的使用频率上,小鼠更适合作为马TBX3基因的外源表达宿主。本研究可为TBX3基因在动物遗传育种改良中选择适合的宿主动物、筛选最佳的外源表达系统以及提高其表达水平提供依据。     

毛竹PePsbS1基因的分子特征及其原核表达

PsbS蛋白在植物非光化学淬灭(NPQ)中发挥着重要作用。采用同源比对方法从毛竹(Phyllostachys edulis)全长cDNA文库中得到1个PsbS同源基因序列(FP091683),命名为PePsbS1。该基因全长1 069 bp,具有多种光应答元件和参与光应答的顺式作用元件。PePsbS1的开放阅读框为807 bp,编码一个268 aa的蛋白。蛋白结构分析表明,该蛋白由转导肽(53 aa)和成熟蛋白(215 aa)组成,成熟蛋白包含1个叶绿素a/b结合蛋白功能域、4个跨膜区;疏水性分析表明该蛋白组成氨基酸以疏水性氨基酸为主,占42.5%;Blastp分析发现该蛋白与玉米的一致性最高,达80.3%。构建含有PePsbS1编码成熟蛋白序列的原核表达载体pET23a-PePsbS1-mature,转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明,分离纯化获得目的蛋白的分子量约为28 kD,与预测PePsbS1编码成熟蛋白的大小相符。这将有助于对竹子PsbS蛋白结构与功能的深入研究。     

猕猴桃DCL、RDR和AGO基因家族的鉴定与分析

为研究猕猴桃RNAi抗病毒机制相关基因DCL、RDR和AGO。本研究采用blastp比对法和NPS@、SignalP-5.0及TMHMM 2.0等数据库对猕猴桃RNAi相关蛋白家族进行鉴定及其对应基础性质(如：亚细胞定位、二级结构等)的分析。结果在猕猴桃中共鉴定获得4个DCL、6个RDR和18个AGO基因,其中19个基因分布在13条染色体(即第3、6、9、12、13、16、17、18、19、23、26、27、29号染色体)上,另外9个基因未定位到染色体具体位置。 AcAGO1d、 AcAGO2a、 AcAGO2b、 AcAGO2d基因在19号染色体成簇存在。RDR基因和 AGO2/7基因包含的内含子较少,其他的AGO和DCL基因包含的内含子较为丰富。这些猕猴桃基因均与番茄更近缘,它们编码的蛋白质含有不同比例的二级结构类型,无规则卷曲占50%左右,其次是α-螺旋和β-折叠。本研究完善了猕猴桃DCL、RDR和AGO编码基因的鉴定,后分析其对应的基础性质,以期为猕猴桃抗病毒研究奠定基础。     

假结核耶尔森氏菌rpoS基因的抗胁迫功能

为探讨食源性病原微生物假结核耶尔森氏菌的抗逆机制,采用同源重组原理进行双交换以获得rpoS基因突变株。分别在5mmol/L H_2O_2和pH 3.5两种胁迫下测定野生型菌株、rpoS基因突变株和互补菌株的存活率,并以2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)为荧光探针,测定两种胁迫下细菌胞内活性氧水平。结果显示,在5mmol/L H_2O_2和pH3.5胁迫下,假结核耶尔森氏菌rpoS基因突变株存活率明显降低,这种降低能够在互补菌株中得到恢复;突变株中胞内活性氧自由基水平明显高于野生型菌株和互补菌株。说明:rpoS基因具有帮助假结核耶尔森氏菌抗氧化胁迫和酸胁迫的功能,且这一功能的发挥是通过调节胞内活性氧水平实现的。     

转Bt基因棉花杀虫蛋白表达规律及对棉铃虫控制作用研究

为了探明不同棉花品种对棉铃虫发生的影响,采用酶联免疫法(ELISA)检测在安徽省普遍种植的12个转Bt基因棉花品种不同生育期叶片,以及不同组织器官的Bt蛋白含量,并结合室内生物测定方法探讨不同棉花品种对棉铃虫幼虫的毒杀效果。结果表明,不同棉花品种Bt蛋白含量差异显著,首先,Bt蛋白在中棉所71、中棉所65、爱棉1号和岱杂2号的各生育期,以及不同组织器官中均能相对稳定地高表达;其次,铜杂411、荃银棉4号和皖棉17在部分生育期及组织器官中Bt蛋白含量较高;与上述品种相比,创072、湘杂棉7号、稼元216、农丰棉1号和鄂杂棉26在不同生育期以及不同组织器官中的Bt蛋白含量普遍较低。同时,转Bt基因棉花Bt蛋白的含量随着棉花逐渐生长逐步下降,然而其下降趋势并非呈现出平滑和逐渐递减的状态,12个棉花品种三叶期叶片中Bt蛋白的含量普遍较低,随着棉花生长,在七叶期叶片至蕾期叶片的生长过程中出现一个Bt蛋白的表达高峰。室内生物测定表明,其对棉铃虫幼虫的致死率与其杀虫蛋白表达量基本一致。     

苹果树腐烂病菌分隔蛋白基因VmImp2的功能研究

旨在研究苹果树腐烂病菌(Valsamali) VmImp2基因的功能,以期揭示腐烂病菌的生长发育及致病机理。利用生物信息学软件对 VmImp2进行蛋白序列及进化分析;利用Double-joint PCR和PEG介导原生质转化的方法,获得腐烂病菌 VmImp2的缺失突变体和回补菌株;利用十字交叉法以及伤口接种法,研究 VmImp2对病菌营养生长,繁殖体产生以及致病力的影响。生物信息学分析显示, VmImp2编码1 487个氨基酸,编码蛋白属于PCH(Pombe Cdc15 homology)家族,含有典型的FCH(Fes/CIP homology, F-BAR)和SH3(Src Homology 3)结构域,与梨树腐烂病菌(V.pyri)的Imp2蛋白亲缘最近。对基因进行敲除后,共获得5个缺失突变体菌株。表型分析显示,缺失突变体的营养生长受到明显影响,表现为菌丝更加稀疏,生长速率明显减缓。同时,突变体的繁殖体产生能力以及对枝条的侵染能力基本丧失。5个突变体的表型一致。将基因回补之后,共获得3个回补菌株,突变体表型缺陷基本恢复到野生型水平。说明 VmImp2基因参与苹果树腐烂病菌的营养生长、繁殖体形成以及致病过程。     

紫茎泽兰叶绿体基因RNA编辑位点的鉴定及分析

RNA编辑是陆生植物叶绿体转录后基因表达调控的一种重要方式。本试验以紫茎泽兰为材料,利用生物信息学预测结合分子克隆及测序方法对其叶绿体的RNA编辑位点进行预测和分析。结果共预测到分布于19个基因的42个编辑位点,所有位点均为C到U的转换。编辑位点的发生位置分析发现,8个位于密码子第1位,34个位于密码子第2位,而密码子第3位未发现RNA编辑事件。同时,利用RT-PCR方法对其中4个基因的编辑位点进行验证,鉴定发现10个真实发生的编辑位点。进一步分析这10个位点发生编辑后对其编码蛋白质跨膜结构域和二级结构的影响,结果表明,ndhB-467的编辑会引起蛋白质跨膜结构的增加,ndhB-149的编辑会引起蛋白质二级结构的改变。     

罗布麻查尔酮合成酶基因克隆及序列分析

为了解罗布麻査尔酮合成酶基因具体结构,采用RT-PCR、RACE方法从夹竹桃科植物罗布麻中扩增出CHS基因的开放阅读框,其核苷酸序列长1 170bp,推测的氨基酸序列全长为389个氨基酸残基。核苷酸序列同源性分析结果显示,该cDNA片段与其他植物CHS基因的同源性为78%~81%,表明该基因在进化过程中变异程度较小,整个超基因家族序列高度保守。     

长叶红砂咖啡酸-O-甲基转移酶（RtCOMT）基因的克隆及蛋白纯化

长叶红砂(Reaumuria trigyna)是内蒙古东阿拉善-西鄂尔多斯地区特有双子叶盐生小灌木,有极强的耐盐抗旱性,入药可以治疗湿疹、皮炎等疾病,具有一定的药用价值。咖啡酸-O-甲基转移酶(RtCOMT)是一个重要的甲基化酶,主要调控木质素合成过程中中间产物及木质素的变化。基于高通量测序结果,利用RT-PCR技术克隆获得长叶红砂COMT(RtCOMT)基因,构建RtCOMT原核表达载pET32a-RtCOMT,并将其转化大肠杆菌,重组阳性菌经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳检测。结果表明:RtCOMT基因开放阅读框长1 023bp,编码340个氨基酸,推测蛋白分子质量37.24ku,理论等电点(pI)6.71,发现该基因在大肠杆菌中正常表达得到与预期大小一致的融合蛋白。采用Ni-IDA His-Bind亲和层析方法对RtCOMT重组蛋白进行纯化,体外获得目的蛋白。     

化脓隐秘杆菌候选抗原的免疫保护效果测试

为鉴定化脓隐秘杆菌的新抗原,对被抗血清识别的化脓隐秘杆菌膜蛋白进行质谱分析,采用免疫印迹分析抗原性, ELISA方法测试被免疫小鼠的抗体水平,通过化脓隐秘杆菌攻毒测试免疫保护率。结果显示,铁ABC(ATP结合盒,ATP binding cassette)转运体的底物结合蛋白是化脓隐秘杆菌的1个新保护性抗原,具有良好的抗原性和免疫原性。     

易变链霉菌TRM 45540四氢嘧啶合成相关基因的克隆

为了探索嗜盐放线菌对高盐环境的适应机理,以分离于罗布泊易变链霉菌TRM 45540为材料,利用分子克隆技术,构建四氢嘧啶异源生物合成工程菌(以E.coli为宿主),对ectA、ectB、ectC与ectABC基因进行异源表达,分析异源宿主菌的耐盐能力。结果表明:TRM 45540四氢嘧啶合成相关基因ectA为474bp,预测编码蛋白为19ku;ectB为1 272bp,预测编码蛋白为44.6ku;ectC为399bp,预测编码蛋白为19ku;全长基因ectABC为2 403bp,并且携带有ectABC基因工程菌的耐盐能力显著提高。     

1株拮抗棉花枯、黄萎病菌的纤维素分解菌筛选

为获得具有拮抗棉花枯、黄萎病菌的棉杆促腐菌剂,进行棉杆纤维素分解菌分离及拮抗菌株的筛选,采用平板对峙法测定菌株对棉花枯、黄萎病菌菌丝生长的影响,通过生长速率法和孢子萌发法测定菌株发酵液对2种病原菌菌丝生长以及孢子萌发的影响,并对筛选得到的菌株进行鉴定。结果获得1株具有抑菌效果的棉杆纤维素分解菌SJ-3,其羧甲基纤维素酶活(CMCase)达到69.1 U/mL,滤纸酶活(FPase)达到48.5U/mL。该菌对棉花枯、黄萎病菌菌丝生长均有显著抑制,抑制率分别达到24.7%、23.1%。其发酵液具有抑菌活性,较高的发酵液浓度能增强对病原菌的抑制作用,发酵液对枯萎病菌孢子萌发的抑制作用较强,最高抑制率为21.6%,而对该病原菌菌丝生长的抑制较弱,最高抑制率仅为6.2%;发酵液对黄萎病菌的菌丝生长和孢子萌发均有较强的抑制作用,最高分别达到32.2%、21.4%。经鉴定,菌株SJ-3为普通青霉(Penicillium commune)。     

基于I-FABP的鲫肠道通透性检测方法的建立

肠道通透性与肠道稳态及个体健康状况直接相关，目前尚缺乏鱼类肠道通透性的定量评价方法及试剂。血清中肠脂肪酸结合蛋白（intestinal fatty acid binding protein，I-FABP）是肠道通透性的重要血清生物学指标，可用于肠道通透性的定量评价。为建立鲫（Carassius auratus）血清I-FABP的定量检测方法，克隆了鲫I-FABP基因，经原核表达和纯化，并利用重组蛋白分别免疫新西兰白兔（New Zealand white rabbit）及小鼠（Mus musculus），制备了兔源及鼠源多克隆抗体，其效价均为1∶80 000。以纯化的兔源多克隆抗体作为包被蛋白，以辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的鼠源多克隆抗体作为酶标抗体，通过优化各反应条件建立了基于鲫I-FABP的双抗体夹心酶联免疫检测方法（double antibody sandwich ELISA，DAS-ELISA）。标准曲线的线性回归方程为y=0.003 5x+0.036 7，拟合度较高R²为 0.999 1，临界值为0.090 6。批内及批间变异系数分别为1.17%～5.50%及0.16%～4.78%，具有较好的重复性。以该方法对54份样品进行检测，与商业化试剂盒对比，符合率为100%。构建的DAS-ELISA检测方法可用于鲫肠道通透性的定量评估。鉴于鱼类I-FABP的保守性，该方法或可用于其他鱼类肠道通透性的定量评价。     

牛源耐药性金黄色葡萄球菌的分离鉴定及黏附因子基因FnBP和clfA的表达分析

为探究致奶牛乳房炎主要致病菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)的生物学特性,对新疆垦区部分奶牛场乳房炎奶样进行病原学分析,并对病原菌进行耐药性、毒力因子的表达分析。从乳房炎奶样中分离得到S.aureus,采用血浆凝固酶试验、KB法、琼脂筛选法、生化鉴定法(VITEK32)、聚合酶链式反应等法进行鉴定。针对毒力基因clfA(凝集因子A)和FnBP(纤维结合素结合蛋白)进行特异性PCR扩增,用T/A克隆法将其插入pMD18-T载体,并构建原核表达载体pET-28a(+)-FnBP和pET-28a(+)-clfA。转化BL21(DE3)菌,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物。常规鉴定出葡萄球菌105株,其中金黄色葡萄球菌(S.aureus)62株,从62株S.aureus中检出耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA)13株,检出率为20.10%,2株未确检。经测序证实与GenBank中FnBP基因(J04151)和clfA基因(AB245457)序列同源性分别为100%和95.69%。SDS-PAGE显示,clfA和FnBP蛋白相对分子质量分别为45ku和58ku。Western blot分析显示,clfA蛋白和FnBP蛋白均可与金黄色葡萄球菌多克隆抗血清发生特异性反应。病畜奶样中MRSA检出率较高,新疆垦区部分牛场呈蔓延趋势,成功表达了clfA、FnBP蛋白,具有一定的免疫保护效果。     

9株芽孢杆菌的初步分离鉴定与拮抗性试验

通过对采集样品中细菌的分离与纯化,获得9株芽孢杆菌,经纯化培养后观察其个体和群体形态特征,并进行了12项生理生化特征鉴定。结果表明,B10为地衣芽孢杆菌,B13为巨大芽孢杆菌,B12、B14为短小芽孢杆菌,B15为苏芸金芽孢杆菌,B16为蕈状芽孢杆菌,B11,B17,B18为蜡样芽孢杆菌。通过对8株植物病原菌和3株动物病原菌的拮抗试验,初步确定B13,B16,B17,B18的抗菌谱较广,其中B10,B15对棉花枯萎菌,B13,B17对辣椒疫霉菌,B11对西瓜枯萎菌,B10,B17,B18对3株动物病原菌有较好的拮抗能力。